过表达FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制研究

目的探讨FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测人正常成骨细胞hFOB 1.19和人骨肉瘤细胞U2OS、MNNG/HOS中FOXO1的mRNA表达水平。利用pcDNA3.1-FOXO1重组质粒建立FOXO1过表达的细胞模型,空载质粒(pcDNA3.1-vector)作为对照,qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)验证转染效率。确定成功过表达FOXO1基因后利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力(吸光度值),Transwell实验体外检测骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力,并采用qRT-PCR和western blot的方法检测基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达变化。结果人骨肉瘤细胞MNNG/HOS、U2OS中FOXO1的mRNA的表达水平显著低于人成骨细胞hFOB 1.19(P0.05),且骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1的表达水平较低。重组质粒pcDNA3.1-FOXO1转染后,骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1表达水平显著升高。与对照组(pcDNA3.1-vector)比较,U2OS-FOXO1过表达组的细胞的增殖能力降低(P0.05),侵袭迁移和迁移能力降低,MMP9较对照组表达水平明显降低(P0.05)。结论骨肉瘤细胞中FOXO1表达水平明显低于正常成骨细胞。过表达FOXO1可能通过下调MMP9抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力。     

miR-181a-5p通过HOXB4抑制骨肉瘤细胞HOS增殖和迁移

目的：研究miR-181a-5p对HOS骨肉瘤细胞增殖、周期和迁移的影响及其机制。方法 ：采用实时定量PCR检测hFOB1.19成骨细胞和HOS、U2OS、MG63骨肉瘤细胞系中miR-181a-5p及HOXB4的表达情况。利用Lipofectamine 2000将miR-181a-5p mimics和miR-181a-5p inhibitor分别转染至人骨肉瘤HOS细胞中（分别为过表达组和抑制剂组）,并设置miR阴性对照组;CCK-8法检测各组细胞的增殖能力变化,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期变化,划痕愈合实验以及Transwell迁移实验检测各组细胞的迁移能力变化。Targetscan网站预测miR-181a-5p的靶向基因,并通过双荧光素酶报告基因系统及Western blot验证靶向关系。结果：与成骨细胞hFOB1.19相比,miR-181a-5p在骨肉瘤细胞HOS、U2OS和MG63中低表达（P<0.05）,而HOXB4在骨肉瘤中高表达（P<0.05）。与阴性对照组相比,过表达miR-181a-5p抑制骨肉瘤HOS细胞的增殖和迁移能力,并且处于细胞周期S期的细胞...     

趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响

目的探讨趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响。方法Real-time PCR 检测人骨肉瘤细胞株 HOS-8603、U2OS 和 MG-63 中 CXCR4 mRNA 的表达情况;构建、鉴定pcDNA3/CXCR4 重组质粒并将其转染到 HOS-8603 细胞中（PCDNA3/CXCR4 组）,同时制备转染 pcDNA3 空质粒的阴性对照组（pcDNA3组）。MTT检测细胞增殖情况,穿膜小室重组细胞基底膜迁移实验检测细胞迁移情况。结果 HOS-8603细胞中CXCR4 mRNA相对表达含量低于U2OS、MG-63细胞（P 〈0.05）。转染后24、48h,pcDNA3/CXCR4 组 CXCR4 mRNA 表达量是 pcDNA3 组的 96 倍和 124 倍（P 〈0.05）。与 pcDNA3 组比较,转染后24、48、72 h,pcDNA3/CXCR4组细胞增殖率和发生迁移的细胞数明显增加（P 〈0.05）。结论 CXCR4的表达可能是促进骨肉瘤细胞增殖和迁移的重要因素。     

乳腺癌转移抑制蛋白1下调PI3K/AKT1通路抑制骨肉瘤细胞转移

目的 探讨乳腺癌转移抑制蛋白1(BRMS1)在骨肉瘤转移中的作用和机制。方法免疫组化检测骨肉瘤组织中BRMS1蛋白表达;荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)法检测8例骨肉瘤组织和8个骨肉瘤细胞系BRMS1 mRNA表达的变化;western blot检测正常成骨细胞系(HOSB)及人骨肉瘤细胞系(OS187、COL、LM7、SJSA、MG63、HOS、SAOS-2、CCH-D)和BRMS1蛋白和AKT1蛋白磷酸化的水平;侵袭小室(Transwell)法检测过表达BRMS1的HOS细胞转移能力的变化。结果 骨肉瘤组织中BRMS1蛋白表达较癌旁正常骨组织明显减少。骨肉瘤细胞OS187、COL、LM7、SJSA、MG63、HOS、SAOS-2和CCH-D BRMS1 mRNA和蛋白的表达水平较正常成骨细胞HOSB明显降低,而AKT1蛋白磷酸化水平明显升高。HOS细胞过表达BRMS1后,HOS细胞转移能力和AKT1蛋白磷酸化水平明显降低。运用AKT1蛋白磷酸化抑制剂LY294002明显抑制HOS细胞转移能力。结论 BRMS1可以抑制骨肉瘤细胞HOS细胞转移,其机制可能与抑制AKT1蛋白磷酸化有关。     

外源性CC10基因表达对肝癌细胞增殖、 凋亡、迁移和侵袭的影响

目的 探究外源性Clara细胞分泌蛋白10（CC10）的基因表达对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和 侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 采用RT-qPCR和Western blotting检测人正常肝细胞LO2和 肝癌细胞HepG2、Hep3B中CC10的内源表达水平;将HepG2细胞系分为pcDNA 3.1组和pcDNA 3.1-CC10 组,用LipofectionTM分别转染pcDNA 3.1空载体质粒和重组质粒pcDNA 3.1-CC10。用CCK-8法、TUNEL 法和Transwell小室实验分别检测两组细胞增殖、凋亡情况及迁移、侵袭能力。采用RT-qPCR和Western blotting检测两组细胞中CC10和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达水平。结果 与正常肝细胞LO2相 比,CC10在肝癌细胞HepG2、Hep3B中呈明显低表达（P<0.05）;转染 pcDNA 3.1-CC10后的HepG2细胞内 CC10 mRNA和蛋白水平均显著增高（P<0.05）。与 pcDNA 3.1组相比,pcDNA 3.1-CC10组细胞活力受到抑 制,细胞活力以时间依赖性方式降低（P<0.05）,细胞迁移和侵袭实验中的过膜细胞数均低于pcDNA 3.1组 （P<0.05）,细胞凋亡率高于pcDNA 3.1组（P<0.05）。同时,Cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低 （P<0.05）。 结论? 外源性CC10基因表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡,其机制可能与 下调Cyclin D1表达有关。     

GAS5对骨肉瘤U2OS细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:观察生长停滞特异性转录因子5(GAS5)对骨肉瘤U2OS细胞增殖、迁移和侵袭的影响,探讨其机制。方法:在人骨肉瘤U2OS细胞和人正常成骨hFOB 1.19细胞中,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测GAS5和微小RNA (miR)-221的表达,Western blot检测基质金属蛋白酶抑制物-2 (TIMP2)蛋白的表达。转染pcDNA-GAS5重组质粒后,采用噻唑蓝(MTT)法和Trasnwell小室法检测GAS5对U2OS细胞增殖、迁移和侵袭的影响,qRT-PCR检测GAS5对miR-221表达的影响。利用Starbase软件预测和双荧光素酶报告基因实验验证GAS5与miR-221以及miR-221与TIMP2的靶向关系。转染miR-221模拟物和miR-221抑制剂后,观察miR-221过表达对GAS5调控的U2OS细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及miR-221对TIMP2蛋白表达的影响。结果:与正常hFOB 1.19细胞相比,U2OS细胞中GAS5和TIMP2蛋白的表达水平明显降低,而miR-221表达水平显著升高(GAS5:P=0.0001;TIMP2:P=0.0003;miR-221:P=0.0004)。GAS5过表达可抑制U2OS细胞增殖、迁移和侵袭(增殖48h:P=0.0005;增殖72h:P=0.0002;迁移:P=0.002;侵袭:P=0.001),而miR-221过表达可明显逆转GAS5对U2OS细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(增殖48h:P=0.0002;增殖72h:P=0.0003;迁移:P=0.0001;侵袭:P=0.0001)。Starbase软件预测到miR-221存在能够与GAS5互补结合的位点,还存在能够与TIMP2 3′UTR互补结合的位点;双荧光素酶结果显示miR-221过表达后野生型GAS5(GAS5-WT)和野生型TIMP2 (TIMP2-WT)细胞的荧光素酶活性明显降低(P均为0.0003);同时,GAS5过表达后,U2OS细胞中miR-221表达水平明显降低(P=0.0001),反之miR-221明显升高(P=0.0001);miR-221过表达后,U2OS细胞中TIMP2蛋白的表达水平明显降低(P=0.0003),反之TIMP2蛋白的表达水平明显升高(P=0.0009)。结论:GAS5可通过靶向抑制miR-221促进TIMP2表达,进而抑制U2OS细胞的增殖、迁移和侵袭。     

miR-542-3p对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响以及靶基因预测

【】目的 明确miR-542-3p抑制骨肉瘤细胞系HOS以及SAOS2细胞侵袭能力,建立生物信息学miR-542-3p靶基因调控网络,并探讨其潜在作用靶点。方法 使用miR-542-3p mimics 转染HOS以及SAOS2细胞,进行Transwell小室细胞侵袭能力测定。利用基因表达共享数据库GEO联合GEO2R平台,获取并分析miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的基因表达谱数据及差异表达基因,进而使用miRNA预测数据库及Cytoscape软件,预测并建立miR-542-3p靶基因调控网络。qPCR验证mir-542-3p转染HOS以及SAOS2细胞后,部分预测目标靶基因的mRNA表达水平变化。结果 mir-542-3p 转染组骨肉瘤细胞的侵袭能力较对照组明显降低(P<0.05)。数据库差异基因分析表明,miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的表达差异基因共417个,其中185个基因表达下调。实时定量PCR结果显示,Targetsacn以及MiRanda数据库预测靶基因中,miR-542-3p转染细胞组的ILK, TBPL1和ETS1表达水平显著低于对照组(P<0.05)。结论 miR-542-3p通过下调ILK, TBPL1以及ETS1显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。     

内源性硫化氢及其合成酶在人成骨肉瘤细胞中表达的研究

目的：观察硫化氢(H2S)及其合成酶胱硫醚?β?合成酶（CBS）、胱硫醚?γ?裂解酶（CSE）和3?巯基丙酮酸硫转移酶（MPST）在人成骨细胞株及人成骨肉瘤细胞系中的表达。方法我科于2013年6月至2014年12月运用免疫组化染色和蛋白质印迹方法在人永久性成骨细胞株hFOB1.19,成骨肉瘤细胞株Saos?2、MG?63和U?2 OS中分别检测CBS、CSE和MPST基因表达量、蛋白含量;通过敏感硫电极法检测H2S在正常成骨组织和骨肉瘤细胞中的含量。分别比较H2S及其合成酶在各组之间的差异,初步探讨H2S及其合成酶与不同成骨肉瘤细胞之间的关系。结果在成骨肉瘤标本和细胞中CBS、CSE和MPST基因的较高表达;成骨肉瘤组织与成骨细胞来源的正常和恶性肿瘤细胞CBS、CSE和MPST基因表达的蛋白水平以及H2S产生率不同,其中成骨肉瘤细胞株U?2 OS表达水平最高。结论内源性H2S及它的合成酶CBS、CSE和MPST存在于人恶性成骨肉瘤组织和细胞中,高水平的H2S及其生物合成物质或许能成为成骨肉瘤治疗的新靶点。     

miR-542-3p对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响及其靶基因预测

目的 明确miR-542-3p对骨肉瘤细胞系HOS和SAOS2细胞侵袭能力的影响,通过生物信息学建立miR-542-3p靶基因调控网络,并探讨其潜在作用靶点。方法 使用miR-542-3p mimics转染HOS和SAOS2细胞,同时设立正常组（未转染）及阴性对照组（转染miR-neg mimics）,Transwell小室试验检测转染后细胞的侵袭能力。通过美国国立生物信息中心（NCBI）基因表达共享数据库（GEO）联合GEO2R平台,获取并分析miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的基因表达谱数据及其差异表达基因,进而使用miRNA预测数据库及Cytoscape软件,预测并建立miR-542-3p靶基因调控网络。实时荧光定量PCR验证miR-542-3p转染HOS和SAOS2细胞后,部分预测目标靶基因的mRNA表达水平变化。结果 miR-542-3p干预组HOS和SAOS2细胞的侵袭能力较正常组和阴性对照组明显降低（P均＜0.05）。数据库差异基因分析表明,miR-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的表达差异基因共有417个,其中185个基因表达下调。miRNA预测数据库预测的266个靶基因中,有14个与差异基因分析中得到的表达下调基因重合。实时荧光定量PCR分析得出,ILK、TBPL1、ETS1这3个预测靶基因在miR-542-3p干预组中的表达水平显著低于阴性对照组,差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 miR-542-3p通过下调ILK、TBPL1、ETS1显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。     

miR-17-92基因簇对骨肉瘤细胞增殖侵袭的影响

[目的]探究miR-17-92基因簇对骨肉瘤（osteosarcoma, OS）细胞增殖、侵袭的影响及可能机制。[方法] qRTPCR检测OS细胞MG-63转染前（MG-63细胞）、人成骨细胞hFOB1.19 (hFOB细胞)中的miR-17-92基因簇水平。分别对MG-63细胞行miR-17-92基因簇模拟物组转染（miR-17-92组）与阴性对照转染（miR-NC组）,比较两组miR-17-92基因簇水平、细胞增殖水平及侵袭能力,及转染后MG-63细胞转化生长因子-β1 (transforming growth factor beta 1, TGF-β1)、Smad3、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-2、MMP-9蛋白水平。[结果] MG-63细胞的miR-17 [(4.1±1.0) vs (1.2±0.3),P<0.05]、miR-18a [(2.3±0.5) vs (1.4±0.5), P<0.05]、miR-19a [(2.0±0.4) vs (1.3±0.4), P<0.05]、miR-19b [(2.1±0....     

p14ARF增强顺铂诱导的骨肉瘤U20S细胞凋亡的研究

目的探讨p14ARF对顺铂诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡的影响及其机制,为提高骨肉瘤化疗敏感性提供依据。方法在不表达p14ARF的U2OS细胞中稳定转染pcDNA3.1-p14ARF质粒,构建稳定表达株;采用RT-PCR和Western blot法鉴定其表达;台盼蓝拒染法测定生长抑制作用;Hoechst33258荧光染色检测凋亡;Western blot法检测Caspase-3,9和PARP的表达和活化。结果 mRNA和蛋白水平,U2OS和U2OS-vec细胞未见p14ARF表达,U2OS-ARF细胞可见p14ARF的高表达;p14ARF单独对U2OS细胞的生长无影响,但顺铂（5μM）处理72小时后,U2OS-ARF细胞的生长抑制率明显高于U2OS和U2OS-vec细胞,相对于U2OS和U2OS-vec细胞,U2OS-ARF细胞不仅表现更为明显的凋亡形态学变化,还明显出现了Caspase-3,9和PARP的活化裂解。结论 p14ARF能够增强顺铂诱导的骨肉瘤U2OS细胞毒作用和凋亡,通过激活Caspase-PARP级联活化,提高骨肉瘤U2OS细胞对顺铂的敏感性。     

长链非编码RNA Linc00472靶向微小RNA-381对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

目的观察长链非编码RNA Linc00472(LncRNA Linc00472)靶向调控微小RNA-381(miR-381)对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。方法收集2017年3月至2018年5月郑州大学第一附属医院收治的骨肉瘤患者29例为研究对象,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测骨肉瘤组织和瘤旁组织中Linc00472的表达。将骨肉瘤U2OS细胞分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-Linc00472组、pcDNA3.1-Linc00472+miR-NC组、pcDNA3.1-Linc00472+miR-381组。甲基噻唑基四唑(MTT)检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞迁移及侵袭。双荧光素酶报告实验鉴定Linc00472与miR-381的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果Linc00472在骨肉瘤组织中的表达水平低于瘤旁组织(0.31±0.03比1.03±0.10,t=37.138,P<0.05),差异有统计学意义;与pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-Linc00472组细胞存活率[(100.29±10.12)%比(53.29±5.44)%]低于pcDNA3.1组(t=12.272,P<0.05),差异有统计学意义,迁移细胞数[(266.00±23.61)个比(124.00±12.01)个]与侵袭细胞数[(131.00±13.06)个比(62.00±6.24)个]少于pcDNA3.1组(t=16.082,P<0.05;t=14.301,P<0.05),差异有统计学意义,而细胞凋亡率[(8.58±0.91)%比(26.61±2.64)%]高于pcDNA3.1组(t=19.370,P<0.05),差异有统计学意义;miR-381过表达可抑制野生型载体WT-Linc00472细胞的荧光素酶活性(t=19.827,P<0.05),差异有统计学意义;与pcDNA3.1-Linc00472+miR-NC组比较,pcDNA3.1-Linc00472+miR-381组可增强细胞增殖[(53.17±5.33)%比(85.26±8.62)%]、迁移[(122.00±12.31)个比(223.00±22.18)个]及侵袭[(64.00±6.36)个比(104.00±10.20)个]能力高于pcDNA3.1-Linc00472+miR-NC组(t=9.499,P<0.05;t=11.945,P<0.05;t=9.983,P<0.05),细胞凋亡率[(26.11±2.62)%比(13.11±1.34)%]低于pcDNA3.1-Linc00472+miR-NC组(t=13.253,P<0.05),差异有统计学意义。结论LncRNA Linc00472通过靶向调控miR-381可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭并诱导细胞凋亡。     

壳五糖对骨肉瘤细胞抗肿瘤作用的研究

目的探讨壳五糖对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用及其作用机制。方法使用不同质量浓度的壳寡糖单糖(聚合度为2~6)处理3种骨肉瘤细胞系(MNNG、MG63、U2OS),48 h后采用CCK-8法评估细胞活力及细胞增殖情况,并通过流式细胞技术分析细胞周期及细胞凋亡的变化情况。利用Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。采用蛋白质免疫印迹法检测壳五糖处理前后细胞中磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号转导通路中关键蛋白表达水平的变化。结果壳寡糖单糖以剂量依赖性方式抑制骨肉瘤细胞的增殖,其中以壳五糖作用效果最佳,其在3种骨肉瘤细胞中的半数抑制浓度(IC50)分别为1.55 mg/mL(MNNG)、0.84 mg/mL(MG63)、0.76 mg/mL(U2OS)。壳五糖处理3种骨肉瘤细胞后显著抑制这些细胞的增殖和迁移能力,同时影响骨肉瘤细胞周期并促进细胞凋亡。蛋白质免疫印迹法检测显示,PI3K/AKT信号转导通路中的磷酸化PI3K、磷酸化AKT的表达明显下降。结论壳五糖可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力,其作用机制可能是通过调控PI3K/AKT信号转导通路产生的。     

POLE2对非小细胞肺癌细胞侵袭迁移能力的影响

目的 探讨POLE2对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞侵袭迁移能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测人支气管上皮样细胞BEAS-2B和NSCLC细胞A549、SPC-A1中POLE2的表达水平。构建POLE2过表达细胞模型,qRT-PCR和蛋白质印迹法（Western blot）验证转染效率。采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测NSCLC细胞的增殖能力,Transwell实验检测NSCLC细胞的侵袭迁移能力,qRT-PCR检测MMP9的表达水平。结果 人NSCLC细胞SPC-A1、A549中POLE2的表达水平显著高于人支气管上皮样细胞BEAS-2B（P<0.05）。过表达POLE2促进了A549细胞的增殖和侵袭迁移,上调了MMP9的表达（P<0.05）。结论 过表达POLE2可能通过上调MMP9促进NSCLC细胞的侵袭迁移。     

RecQ5表达与骨肉瘤组织恶性程度间的关系分析

目的分析RecQ5在不同组织和细胞上的表达差异,推断RecQ5与组织恶性程度间的关系。方法选取骨肉瘤标本共35例、癌旁组织标本20例及正常骨组织标本20例,通过免疫组织化学染色法检测不同组织中RecQ5的表达情况,并进一步分析其表达程度与骨肉瘤分期的关系;培养hFOB1.19、U2OS和MG-63细胞株,通过Real-timePCR和Westernblot法检测RecQ5的表达程度。结果RecQ5在人骨肉瘤组织中低表达。正常骨组织中,RecQ5的表达阳性率为100%(20/20),在癌旁组织中的表达阳性率为90%(18/20),而在骨肉瘤组织中,RecQ5表达阳性率为68.5%(24/35);正常骨组织、癌旁组织与骨肉瘤组织的RecQ5表达阳性率之间比较差异具有统计学意义(P=0.004),但正常骨组织与癌旁组织之间的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。RecQ5的表达强度随着组织恶性程度的不断增加而逐渐减弱,差异具有统计学意义(P<0.05),且在骨肉瘤组织中,其也随着肿瘤分期增加而表达强度逐渐减弱(P<0.05)。RecQ5在人骨肉瘤细胞株MG-63和U2OS中mRNA和蛋白表达水平较正常人成骨细胞hFOB1.19中低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论RecQ5的表达水平与组织的恶性程度呈负相关,RecQ5的缺失与骨肉瘤的发生存在相关性。     

VEGF15基因表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的特异表达,为重组VEGF165进一步的生物学活性和临床研究奠定基础.方法：采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,在脂质体介导下将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,以抗生素培养基筛选抗性细胞,并对抗性细胞进行单克隆化,采用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blotting等方法对目的蛋白在细胞中的特异表达进行分析鉴定.结果：完成真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165的构建,并成功转染NIH/3T3细胞,筛选到一批G418抗性的阳性细胞,单克隆化的阳性细胞（吸光度值0.345±0.064）与空载体转染（吸光度值0.114±0.012）的对照比较,有显著的VEGF165表达（P〈0.01）,SDS-PAGE和Western Blotting检测到VEGF165在扩大培养的克隆细胞中的特异表达.结论：应用pcDNA3.1（＋）-VEGF165载体转染的NIH/3T3细胞可高效表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白.     

Bim蛋白在骨肉瘤细胞株中的表达及其意义

目的 检测Bim蛋白在3种骨肉瘤细胞中和1种正常成骨细胞中的表达.方法 提取成骨肉瘤细胞Saos-2和成骨细胞hFOB 1.19中总RNA,通过全基因组表达谱芯片比较Bim基因在Saos-2和hFOB 1.19中表达;对骨肉瘤细胞MG-63、U2-OS、Saos-2及成骨细胞hFOB 1.19细胞进行细胞爬片免疫荧光、提取4种细胞中的总蛋白进行Western blot、提取4种细胞中的总RNA进行荧光定量聚合酶链反应(PCR),检测4种细胞内Bim的表达,观察骨肉瘤细胞与成骨细胞中Bim的差异,并通过查阅文献分析全基因组表达谱芯片中筛查出与Bim蛋白表达有关的基因.结果 全基因组表达谱芯片结果为Saos-2/hFOB 1.19=0.32,Saos-2中Bim基因表达比hFOB 1.19下调2倍以上;免疫荧光显示Bim在3种骨肉瘤细胞中的表达显著低于hFOB 1.19;Western blot条带结果表明Bim蛋白在hFOB1.19里面表达最多,定量分析条带灰度显示MG-63、U2-os、Saos-2及hFOB1.19细胞里面的表达值为0.04±0.02、0.15±0.01、0.12±0.02、0.39±0.02,3种骨肉瘤细胞Bim蛋白水平明显低于成骨细胞(P＜0.05);荧光定量PCR检测得出骨肉瘤细胞MG-63、U2-os、Saos-2及hFOB1.19里Bim mRNA的2-△△CT为:1.00±0.03、1.96±0.21、1.20±0.14、0.64±0.07,3种骨肉瘤细胞Bim mRNA明显低于成骨细胞,差异有统计学意义(P＜0.05);通过文献报道+基因芯片筛查出了10种可能跟Bim蛋白表达及生物学作用相关联的基因.结论 Bim在mRNA和蛋白水平下,骨肉瘤细胞中表达量明显少于成骨细胞.

Abstract：

Objective To examine the expression of Bim protein in three osteosarcoma cell lines and the osteoblasts. Methods Comparison of whole genome expression profiling chip in osteosarcoma cell Saos-2 expression and osteoblast hFOB 1. 19 expression; and then the Bim expression were detected and authenticated by immunofluorescence, Western blotting, quantitative polymerase chain reaction (PCR) on the MG-63, U2-OS, Saos-2 osteosarcoma cells and hFOB 1. 19 osteoblast to investigate the differences, and through literature review of whole-genome microarray screening for Bim expression of related genes. Results The gene expression microarray results of Saos-2/hFOB 1. 19 =0. 32,the Bim gene expression in Saos-2 is lower down than hFOB 1. 19 around 2 times; fluorescence signal of Bim in 3 osteosarcoma cells was significantly lower than hFOB 1. 19; Western blotting results show that Bim expression in hFOBl. 19 which is the most,quantitative analysis of band intensity showed MG-63, U2-os, Saos-2 and hFOBl. 19 expression is 0.04 ± 0. 02,0. 15 ± 0. 01,0. 12 ± 0. 02,0. 39 ± 0.02, Bim protein levels in osteosarcoma cells was significantly lower than osteoblast (P＜0. 05) ;fluorescence quantitative PCR detection of MG-63 ,U2-os,Saos-2 and hFOBl. 19 in Bim mRNA expression of 2-△△CT was:1. 00 ±0. 03,1. 96 ±0. 21,1. 20 ±0. 14,0. 64 ±0. 07, osteosarcoma cells Bim mRNA expression were significantly lower than that of osteoblast, the difference was significance (P＜0. 05) ;reviewed and gene chip screening came out of the 10 possible with Bim protein expression and biological function associated genes. Conclusion Bim mRNA and protein level expression in osteosarcoma cells were significantly lower than the osteoblast.