靶向和非靶向微泡联合尿激酶超声溶栓的电镜表现

目的 比较靶向和非靶向微泡联合尿激酶超声溶栓的电镜表现。方法 将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸片段（RGDS）与尿激酶（UK）以及超声微泡（SonoVue）通过机械振荡法,制备成靶向微泡。于30只新西兰大白兔单侧股动脉制备在体混合性血栓,并分为单纯超声辐照组（US组）、超声辐照+非靶向微泡造影剂+UK组（US+M+UK组）、超声辐照+靶向微泡造影剂+UK组（US+RGDS+UK组）。通过超声及多普勒血流仪观察溶栓效果,然后对股动脉离体标本行HE染色,并观察电镜表现。结果 溶栓20 min后,与US组和US+M+UK组比较,US+RGDS+UK组血流量明显恢复（P均<0.05）,US组与US+M+UK组比较差异无统计学意义（P均>0.05）。US+M+UK组HE染色显示管腔内充满血栓,血小板梁呈颗粒状、不致密,扫描电镜示粗大束状的胶原纤维上疏松附着少量细小纤维蛋白丝,大部分断裂;透射电镜示血栓大部分溶解为空泡状,可见白细胞或血小板降解的碎片。US+RGDS+UK组HE染色显示血栓完全溶解;扫描电镜示血栓的纤维网状结构被破坏,纤维蛋白完全的溶解;透射电镜示血栓降解为高电子密度的颗粒。结论 血栓结构的空泡化、纤维蛋白网架结构完全崩解和纤维蛋白的完全溶解是靶向微泡和UK联合溶栓的主要电镜改变。     

超声联合微泡对不同凝龄富血小板血栓和富红细胞血栓的溶栓效果

目的 探讨超声联合微泡对不同凝龄富血小板血栓（PRT）和富红细胞血栓（ERT）的溶栓效果。方法 分别于体外和大鼠体内颈总动脉制备不同凝龄的PRT和ERT。离体及在体实验均分为4组,即离体PRT 3 h组、离体PRT 24 h组、离体ERT 3 h组、离体ERT 24 h组及在体PRT 3 h组、在体PRT 24 h组、在体ERT 3 h组、在体ERT 24 h组;分别于体外循环装置和大鼠颈总动脉血栓模型中进行超声联合微泡溶栓实验,并采集超声图像。行病理组织学检查以验证血栓成分。离体实验主要分析溶栓后管腔横截面积增加百分比及溶栓率,在体实验主要分析溶栓后血管再通率及颈总动脉血流速度。结果 溶栓治疗后,离体及在体实验显示：PRT 3 h组与ERT 3 h组管腔横截面积增加百分比[（121.12±13.21）% vs （130.09±15.34）%]、溶栓率[（39.83±7.09）% vs （42.14±5.17）%]、血管再通率（83.33% vs 91.67%）及颈总动脉血流速度[（0.21±0.02）m/s vs （0.22±0.01）m/s]差异均无统计学意义（P均>0.05）。PRT 24 h组与ERT 24 h组比较、PRT 24 h组与PRT 3 h组比较、ERT 24 h组与ERT 3 h组比较,管腔横截面积增加百分比、溶栓率、血管再通率、颈总动脉血流速度均下降（P均<0.05）。与ERT 24 h组比较,PRT 24 h组管腔横截面积增加百分比、溶栓率、血管再通率及颈总动脉血流速度均下降（P均<0.05）。结论 超声联合微泡对溶解离体及在体大鼠颈总动脉PRT和ERT的效果随血栓凝龄的增加而下降,且以PRT为著。     

长脉冲超声条件下脂质体微泡协同rt-PA溶解微血栓

目的 观察长脉冲超声(US)条件下脂质体微泡造影剂协同重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)溶解微血栓的疗效。方法 采集6名健康受试者全血制备200~300 μm的微血栓,根据不同干预方式分为单纯rt-PA组、rt-PA+低占空比US组(5000个循环)、rt-PA+高占空比US 组(600 000个循环),另将仅US(600 000个循环)照射但无声学微泡协同作为单纯US组。根据辐照系统内压力减低程度评价溶栓的疗效。结果 单纯rt-PA组溶栓率与rt-PA+低占空比US组比较,差异无统计学意义(P>0.05),rt-PA+高占空比US组溶栓率高于单纯rt-PA组和rt-PA+低占空比US组(P均<0.01)。结论 长脉冲US声学微泡辅助rt-PA溶栓效果良好,但此协同作用需在低声压条件下依赖一定比例的占空比才能实现。     

以短肽K237为配体的靶向脂质体超声造影剂构建方法

目的 探讨以与血管内皮生长因子(VEGF)的主要受体KDR特异性结合的短肽K237(P)为配体制备靶向脂质体超声造影剂(P-Bio-Av-Bio-Mbs)的方法。 方法 采用生物素-亲和素桥接法构建P-Bio-Av-Bio-Mbs,流式细胞术筛选最佳配体适配剂量,光镜及荧光显微镜观察靶向微泡与KDR强阳性表达的人大肠癌LOVO细胞结合情况,计算花环形成率。分别以5、50、99 ml/h速率水流冲刷,光镜观察靶向微泡与LOVO细胞结合情况。 结果 不同亲和素剂量下(0、2、6、10、30 μg),微泡表面亲和素携带率差异有统计学意义(P<0.05)。M_avidin=6 μg时,携带率增长达平台期;不同短肽剂量下(0、30、40、50、60、70、100 μg),微泡表面短肽携带率差异有统计学意义(P<0.05),当M_K237=50 μg时,微泡表面短肽携带率增长达平台期。光镜下KDR强阳性表达的LOVO细胞周围花环形成率高达90.52%,荧光显微镜下微泡外壳发出明亮绿色荧光。随冲刷速度增加,靶细胞周围黏附的靶向微泡减少,在99 ml/h冲刷速度下,靶细胞周围仍可见花环结构。 结论 通过生物素-亲和素桥连作用,短肽K237被有效装配在P-Bio-Av-Bio-Mbs表面,体外具有靶向特异性及一定稳定性。流式细胞术是筛选靶向微泡配体适配剂量的可靠方法。     

尿激酶RGDS靶向溶栓造影剂的制备及鉴定

目的 探索制备同时携带尿激酶及精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS)靶向溶栓造影剂的可行性,并评价其理化性质.方法 尿激酶、RGDS荧光双标记后,根据尿激酶及RGDS不同质量比(1∶1、2∶1及1∶2)分为3组,采用直接连接法制备,并检测三组微泡大小、形态、荧光亮度,微泡与尿激酶及RGDS的结合率.结果 通过直接连接法可以将声诺维、尿激酶及RGDS三者结合,以尿激酶和RGDS呈1∶1比例配制的最佳,洗涤前、后微泡表面均可激发出绿色及橙红色荧光,流式细胞仪检测结果 显示,洗涤后尿激酶携带率为(72.3±9.4)%,RGDS携带率为(64.6±10.2)%.结论 携带尿激酶及RGDS的靶向溶栓造影剂能够成功制备.     

LHRHa靶向微泡造影剂的制备及体外寻靶实验

目的 制备人卵巢癌靶向超声造影剂,观察其体外寻靶能力。方法 采用生物素-链霉亲和素法制备促黄体生成素释放激素类似物(LHRHa)靶向脂质微泡,以免疫荧光染色验证LHRHa与脂质微泡的结合情况,并以普通脂质微泡作为对照,在倒置显微镜下观察LHRHa靶向脂质微泡对人卵巢癌A2780/DDP的体外寻靶能力。结果 LHRHa靶向脂质微泡免疫荧光阳性;体外寻靶实验显示LHRHa靶向脂质微泡能够与表面存在LHRH受体的A2780/DDP细胞特异性结合,而普通脂质微泡则不能结合。结论 利用生物素-链霉亲和素方法可成功制备LHRHa靶向脂质微泡造影剂,该靶向造影剂具有体外寻靶能力。     

血栓靶向脂膜超声造影剂的制备与初步评价

目的制备血栓靶向脂膜超声造影剂,并对其配体结合率进行初步评价。方法通过生物素-抗生物素蛋白桥连法,制备携带血栓靶向配体的脂膜超声造影剂,非靶向脂膜微泡为对照;采用流式细胞仪初步评价靶向微泡配体结合率及其影响因素。结果靶向微泡荧光检测为阳性,对照组为阴性;流式细胞仪分析结果显示该血栓靶向微泡配体结合率达82.96%,对照组仅为0.92%、0.89%。结论采用生物素-抗生物素蛋白桥连接法,可以成功制备血栓靶向脂膜超声造影剂。微泡纯化过程中离心速度与离心时间对配体结合率的影响具有显著意义。     

环RGD多肽靶向微泡用于动脉血栓成像

目的 构建环RGD(Arg-Gly-Asp)多肽靶向微泡,评价其在高剪切应力下对体外和体内富血小板血栓的黏附效果。 方法 采用巯基-马来酰亚胺共价桥接法制备携环RGD多肽靶向微泡(Mb-cRGD)及同型对照微泡(Mb-CON),在平行板流动腔中测定二者靶向结合血小板的能力以及解离情况,在琼脂糖流动腔模型中观察二者对大鼠腹主动脉富血小板血栓的靶向显影效果。 结果 两种微泡粒径和浓度相近(P均>0.05);在3.60 dyn/cm²剪切应力下,Mb-cRGD与血小板糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa的结合数目明显多于Mb-CON(P<0.05);采用封闭抗体cRGDfV封闭GPⅡb/Ⅲa后,两种微泡均不能与之有效黏附,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);Mb-cRGD与GPⅡb/Ⅲa半数解离和完全解离所需剪切应力明显高于Mb-CON(P均<0.05);对体外及体内的富血小板血栓行超声检查,可见Mb-cRGD较Mb-CON对血栓显影更清晰(P均<0.05)。 结论 环RGD多肽靶向微泡黏附富血小板血栓牢固而持久,可作为一种新的超声分子探针用于动脉血栓成像。     

Integrin αvβ3靶向超声微泡的制备及体外寻靶实验

目的 制备Integrin α_vβ₃靶向超声微泡,对其一般理化性质及体外寻靶能力进行检测。方法 采用巯基-马来酰亚胺连接法制备携FITC标记iRGD肽的Integrin α_vβ₃靶向微泡(MB_{Integrin αvβ3}),并制备空白微泡(MB_control)。检测两组微泡的一般理化性质,在荧光显微镜下观察两组微泡荧光显像,流式细胞仪检测两组微泡FITC荧光含量。于光学显微镜及荧光显微镜下观察两组微泡与小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)的黏附情况。结果 ①MB_{Integrin αvβ3}粒径为(0.84±0.26)μm,与MB_control粒径(0.79±0.19)μm差异无统计学意义(P>0.05);②荧光显微镜下观察,MB_control组微泡无荧光显示,MB_{Integrin αvβ3}组微泡表面显示绿色荧光;③流式细胞仪测得MB_{Integrin αvβ3}组微泡FITC荧光含量为98.4%,MB_control组微泡FITC荧光含量为2.5%;④体外寻靶实验显示,MB_{Integrin αvβ3}组微泡能聚集结合于bEnd.3细胞表面。结论 成功制备了携iRGD肽的Integrin α_vβ₃靶向微泡,其具有良好的体外寻靶能力。     

载组织型纤溶酶原激活物及精-甘-天-丝氨酸四肽超声微泡造影剂的实验研究

目的 制备一种同时携带组织型纤溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator,tPA)与精-甘-天-丝氨酸四肽(RGDS)靶向配体的新型脂质超声微泡造影剂.方法 以冷冻干燥法制备包载tPA的脂质超声微泡造影剂并应用共价键桥连剂法结合RGDS配体.光镜及荧光显微镜观察其形态;测量其粒径、表面电位、pH值;以ELISA法测定tPA包封率;流式细胞仪检测RGDS携带率;琼脂糖纤维蛋白平板法检测其纤溶活性;以该造影剂对正常家兔肝脏进行静脉声学造影,绘制时间-强度曲线,检测其成像功能.结果 微泡膜上同时携带tPA和RGDS,浓度(7～9)×109/ml,粒径(2.08±0.93) μm,表面电位-51.3,pH值5.58,tPA包封率(81.12±2.44)%,RGDS携带率(94.49±6.19)%.微泡在超声辐照条件下显示溶栓活性.声学造影后,该造影剂能明显增强实验兔肝实质回声.结论 以冷冻干燥法和共价键桥连剂结合法能成功制备同时包载tPA并携带RGDS的脂质超声微泡造影剂,将为血栓的靶向释药促溶治疗提供一条新的可行之路.     

不同机械指数超声对微泡的作用

目的 体外观察不同机械指数超声对微泡造影剂的作用.方法 设置不同机械指数,采集超声体外辐照纤维素管内微泡的造影图像,观察其中微泡浓度变化,分析不同机械指数条件下微泡的运动趋势;拟合微泡运动速率曲线,分析微泡运动规律.结果 低机械指数对微泡无明显破坏作用,微泡运动速率呈线性变化;随着机械指数增加,微泡运动速率增加;机械指...     

在生理血流条件下靶向超声微泡对P-选择素的靶向黏附效能

目的平行板流动腔评价在生理血流条件下携抗小鼠P-选择素单抗靶向超声微泡（MBp）的靶向黏附效能。方法采用＂亲和素-生物素＂桥接法构建MBp;在3种浓度（10、100和1000ng/ml）小鼠P-选择素Fc段（PSFc）包被的平行板流动腔和固定剪切应力下,以及最大包被浓度和不同剪切应力（0.2-1.7dyn/cm^2）下分别检测MBp的每分钟结合数量（结合率）,以抗小鼠P-选择素单抗封闭组和空白组为对照。在3种包被浓度下检测MBp达半数解离的剪切应力。所有分组样本数均为3。结果两对照组均未见有明显的MBp结合。实验组MBp结合率随包被浓度的增高而增加（P〈0.05）,然而与剪切应力呈现双向性（P〈0.05）。MBp达半数解离的剪切应力随包被浓度的增加而增大（P〈0.05）。结论MBp在生理条件下可与PSFc特异有效地结合,体外对靶向超声微泡的靶向黏附效能评价将有助于判定超声分子成像的效果和靶向微泡的在体应用环境条件。     

对比液态氟碳脂质纳米粒与全氟丙烷脂质微泡体外显影及耐声压性

目的 与全氟丙烷（C₃F₈）脂质微泡造影剂比较,分析自制液态氟碳（PFOB）脂质纳米粒体外显影及耐声压性的优劣。方法 分别制备生物素化PFOB脂质纳米粒及生物素化C₃F₈脂质微泡,评估其稳定性,并观察其加入亲和素前后的体外显影效果。对2种造影剂在低声压（MI=0.28）及高声压（MI=0.56）环境下进行超声辐照,于辐照前及辐照10、20、30 s后观察显影情况及其差异。结果 2种造影剂加入亲和素后均发生聚集现象,粒径均较加入亲和素前明显增大（P均<0.05）;且加入亲和素前（t=16.225,P<0.001）、后2种造影剂间粒径差异均有统计学意义（t=-5.046,P<0.001）。稳定性观察期间PFOB脂质微粒内浓度无明显改变,而C₃F₈脂质微泡随放置时间延长浓度呈减低趋势。加入亲和素后,PFOB脂质纳米粒回声明显增强;C₃F₈脂质微泡加入亲和素前后显影效果均较好。低声压（MI=0.28）及高声压（MI=0.56）环境下,PFOB脂质纳米粒造影剂显影强度无明显改变,而C₃F₈脂质微泡显影强度随辐照时间延长呈减低趋势。结论 相较于C₃F₈脂质微泡,PFOB纳米脂质纳米粒造影剂粒径小、耐声压性好,更符合靶向超声造影剂的要求。     

Antitumor Effect of Docetaxel‐Loaded Lipid Microbubbles Combined With Ultrasound‐Targeted Microbubble Activation on VX2 Rabbit Liver Tumors

Objective. The purpose of the study was to explore the antitumor effect of docetaxel‐loaded lipid microbubbles combined with ultrasound‐targeted microbubble activation (UTMA) on VX2 rabbit liver tumors. Methods. Docetaxel‐loaded lipid microbubbles were made by a mechanical vibration technique. VX2 liver tumor models were established in 90 rabbits, which were randomly divided into 6 groups, including control, docetaxal‐loaded lipid microbubbles alone, docetaxal alone, docetaxal combined with ultrasound, pure lipid microbubbles combined with ultrasound, and docetaxel‐loaded lipid microbubbles combined with ultrasound (DOC+MB/US). The tumor volume and inhibition rate (IR) of tumor growth were calculated and compared. Apoptosis was detected by terminal deoxyuridine nick end labeling. Proliferating cell nuclear antigen and matrix metalloproteinase 2 (MMP2) protein expression was detected by immunohistochemistry. Caspase 3 and MMP2 messenger RNA (mRNA) expression was detected by in situ hybridization histochemistry. The tumor metastasis rate and survival time of the animals were compared. Results. The IR and apoptotic index of the DOC+MB/US group were the highest among all groups, and the proliferating labeling index was the lowest. Matrix metalloproteinase 2 protein and mRNA expression in the DOC+MB/US group was the lowest among all groups, and caspase 3 mRNA expression in the DOC+MB/US group was the highest. The extensive metastasis rate in the DOC+MB/US group was the lowest, and the survival time of the animals in the DOC+MB/US group was the longest. Conclusions. Docetaxel‐loaded lipid microbubbles combined with UTMA could inhibit the growth of VX2 rabbit liver tumors by deferring proliferation and promoting apoptosis, which may provide a novel targeted strategy for chemotherapy of liver carcinoma.     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

右美托咪定对腹腔镜子宫肌瘤剔除术患者镇痛效果及认知功能的影响

目的 探讨右美托咪定对腹腔镜子宫肌瘤剔除术（LM）患者镇痛效果及认知功能的影响。方法 选取2018年11月-2020年11月该院LM患者128例,依据随机数表法分为定全组（n=64）和单全组（n=64）,单全组给予全身麻醉处理,定全组在此基础上给予右美托咪定处理,比较两组患者血流动力学[平均动脉压（MAP）和心率（HR）]、镇痛效果[视觉模拟评分法（VAS）]、全身麻醉药用量、认知功能[简易精神状态检查量表（MMSE）]和不良反应发生率。结果 定全组麻醉30 min时（T1）、肌瘤剔除时（T2）和术毕时（T3）的MAP、HR及术后2、6和12 h的VAS均明显低于单全组（P <0.05）;定全组全身麻醉用药量少于单全祖,认知功能障碍率低于单全组,定全组术后12、24和48 h的MMSE评分明显高于单全组（P <0.05）;定全组不良反应率低于单全组,但差异无统计学意义（P> 0.05）。结论 右美托咪定可有效稳定LM患者血流动力学,加强镇痛效果,减少全身麻醉用药量,改善认知功能障碍,安全有效。