葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞生物学作用的比较研究

目的 对比葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞增殖和分化的影响。方法 将小鼠骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞，取第3、4代细胞，以rhBMP-2为阳性对照，MTT法观察葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞的增殖作用，碱性磷酸酶（ALP）比活性测定及钙结节计数观察葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞分化的影响。结果 20μg／ml的淫羊藿甙可显著促进成骨细胞的增殖；20μg／ml淫羊藿甙及50μg／ml葛根素均能提高成骨细胞的碱性磷酸酶活性，并使矿化结节的形成明显增多。结论 淫羊藿甙不仅能促进成骨细胞的分化，还能增强其增殖能力，而葛根素主要是通过刺激分化来增强成骨细胞的活力。     

淫羊藿苷含药血清对体外培养大鼠颅骨成骨细胞增殖与分化的影响

目的 研究淫羊藿苷含药血清(Serum of rats administered icariin,SI)对体外培养大鼠颅骨成骨细胞(Rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖和分化成熟的影响.方法 以每1 kg体重0.25 g淫羊藿苷的剂量灌服成年大鼠制得淫羊藿苷含药血清,以灌服等体积生理盐水制得对照血清.分别以2.5%,5%和10%3种浓度加入ROB培养基,检测对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和钙化结节数等的影响.结果 2.5%和5%SI均促进细胞的增殖,尤以5%浓度更为明显,该浓度含药血清提高ROB的ALP活性,增加Ⅰ型胶原表达,并显著提高钙化结节形成数量.结论 淫羊藿经口服后的代谢产物可刺激成骨细胞增殖,促进其分化成熟,是淫羊藿抗骨质疏松的有效成分.     

淫羊藿苷对体外培养成人骨髓基质干细胞增殖与成骨性分化的影响

目的研究淫羊藿苷对体外培养成人骨髓基质干细胞(human bone marrow stromal stem cells,hBMSCs)增殖与成骨性分化的影响。方法取住院患者术后骨髓标本(男,40岁),利用骨髓细胞处理试剂盒分离单核层细胞,培养于含10%FBS的DMEM培养液中,3d后首次换液,12d后传代培养。培养基中淫羊藿苷终浓度分别为5×10-5、1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7、1×10-7mol/L。增殖分析采用MTT法,于成骨性诱导培养第8d测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,第14d进行茜素红染色及钙化结节计数。结果原代培养细胞呈典型成纤维细胞样形态;淫羊藿苷剂量依赖性抑制hBMSCs增殖,但能显著促进其向成骨性分化,表现为提高hBMSCs的ALP活性,增加钙化结节数量。结论终浓度为5×10-5mol/L淫羊藿苷显著促进hBMSCs的成骨性分化,证明淫羊藿苷是中药淫羊藿抗骨质疏松的有效成分。     

淫羊藿苷对高重力环境下成骨细胞黏附和细胞骨架的影响

目的通过高加速度离心加载装置建立高重力加载模型,探讨不同高重力加载环境对成骨细胞黏附及细胞骨架的影响,并且分析淫羊藿苷对高重力加载后细胞黏附和细胞骨架的影响。方法将MC3T3-E1细胞按2×105个/cm2的密度接种于细胞培养皿中。实验共分为6组:对照组、单纯给药组、10 G加载组、10 G给药组、40 G加载组、40 G给药组。加载组应用高加速度离心加载机对细胞施行加载,连续加载3 d,每天30 min。对照组和单纯给药组暴露于正常重力情况下,其余条件与实验组无差别。给药组淫羊藿苷均采用10-7 mol/L浓度,且按预防给药的方法实验。通过茜素红染色、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、CCK-8细胞增殖实验、细胞骨架鬼笔环肽染色、qPCR和Western Blot等相关分子生物学技术检测淫羊藿苷对高重力环境下成骨细胞integrinα5、integrinβ1和F-actin的影响。结果所有模型均成功制备。茜素红染色:淫羊藿苷可促进成骨细胞钙化结节形成,10 G加载可促进成骨细胞矿化,而40 G加载则抑制成骨细胞的矿化。ALP活性检测:单纯给药组、10 G加载组、40 G加载组的检测OD值分别为0.246、0.331、0.163,与对照组的0.207相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10 G给药组和40 G给药组分别为0.373和0.180,与各自加载组的差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8增殖实验:单纯给药组OD值为0.650,与对照组0.551的差异有统计学意义(P=0.031);10 G加载组和40 G加载组OD值分别为1.193和0.245,与对照组的差异均有统计学意义(P<0.05);且10 G给药组和40 G给药组1.300和0.310,与各自加载组的差异有统计学意义(P<0.05)。鬼笔环肽染色:10 G加载细胞促进的数量增加,但细胞形态及骨架未见明显变化,40 G加载则抑制,淫羊藿苷对细胞形态无影响,但对加载损伤后的细胞有一定修复作用。QPCR和Western Blot实验结果一致证实,淫羊藿苷作用后,integrinα5、integrinβ1和F-actin的mRNA和蛋白表达上调,10 G加载可促进integrinα5、integrinβ1和F-actin mRNA和蛋白的表达,40 G加载则明显抑制其mRNA和蛋白的表达。结论10 G条件和淫羊藿苷干预均可促进成骨细胞的生长发育、细胞黏附及细胞骨架的稳定,而40 G则具有明显抑制作用。     

淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ通过BMP/Runx2/Osx信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的观察淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化过程中BMP-2/Runx2/Osx信号通路的影响,探讨其可能的作用机制。方法贴壁筛选法体外培养BMSCs,随机分为空白对照组、阳性转化液组、抑制剂组、淫羊藿次苷Ⅰ组及淫羊藿次苷Ⅰ+抑制剂组、淫羊藿次苷Ⅱ组及淫羊藿次苷Ⅱ+抑制剂组。通过茜素红染色,对各组促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化作用进行药效学评价; ELISA法检测各组ALP活性、BGP、COL-Ⅰ、BMP2蛋白分泌量;RTReal-TimePCR法检测各组ALP、BGP、Osterix和Runx-2 mRNA基因表达。结果茜素红染色结果表明,淫羊藿次苷Ⅰ组及淫羊藿次苷Ⅱ组均可明显观察到大量的矿化结节的形成;ELISA实验结果表明,与空白对照组比较,淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均能明显促进ALP细胞活性及BGP、COL-Ⅰ、BMP-2蛋白分泌量,并且差异具有统计学意义(P0.05);两组药物作用强度均已达到阳性转化液组的80%以上。同时,淫羊藿次苷Ⅰ对ALP活性、 BGP蛋白表达均明显强于淫羊藿次苷Ⅱ,并且差异具有统计学意义(P0.05);对COL-Ⅰ、BMP-2的蛋白表达量,两者差异无统计学意义(P0.05)。RT-PCR实验结果表明,与空白对照组相比,淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ均可显著上调成骨相关转录因子ALP、BGP、RunX2,并进一步调节其下游基因Osterix的转录表达,差异具有统计学意义(P0.05);与阳性对照液组比较,淫羊藿次苷Ⅱ对ALP、Osterix的mRNA表达无明显差异(P0.05);淫羊藿次苷Ⅰ与淫羊藿次苷Ⅱ组比较,淫羊藿次苷Ⅱ对Osterix mRNA的表达明显强于淫羊藿次苷Ⅰ,并且差异具有统计学意义(P0.05)。对ALP、BGP、RunX2 mRNA的表达二者无显著性差异(P0.05)。结论淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ均能促进BMSCs定向成骨转化,其作用机制可能与激活BMP/Runx2/Osx信号通路有关。淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ作用差异可能与淫羊藿次苷Ⅰ在体内生物转化为淫羊藿次苷Ⅱ有关。     

淫羊藿苷对体外培养骨髓基质干细胞成骨性分化的影响

目的研究淫羊藿苷对体外培养骨髓基质干细胞增殖与成骨性分化的影响,了解其是否具有促进骨形成活性。方法将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5和10^-4mol/L 5种浓度的淫羊藿苷分别加入原代培养大鼠骨髓基质干细胞（rBMSCs）中,采用MTT法分析细胞增殖情况。在成骨性诱导培养条件下,比较淫羊藿苷组和不加药的对照组间在碱性磷酸酶阳性克隆数（CFU-FALP）、碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素分泌量、钙盐沉积量和钙化结节数等方面的差异,采用RT-PCR和实时荧光定量PCR分析成骨性分化的标志蛋白和细胞因子的基因表达差异。结果淫羊藿苷无促进细胞增殖活性,但10^-5mol/L及更高浓度抑制细胞增殖。10^-5mol/L淫羊藿苷强烈促进原代培养rBMSCs的成骨性分化,表现在加药组的CFU-FALP数量、胞内ALP活性、骨钙素分泌量、钙盐沉积量和钙化结节数等在培养不同阶段均高于或显著高于对照组,包括骨涎蛋白、骨桥素、类胰岛素-I和BMP2等在内的多种标志蛋白和细胞因子基因表达水平也显著提高。结论淫羊藿苷强烈促进骨髓基质干细胞的成骨性分化,表明其具有促进骨形成生理活性。     

淫羊藿苷对钛颗粒作用下成骨细胞增殖和分化的影响

[目的]研究淫羊藿苷(icariin,ICA)对钛(titanium,TI)颗粒作用下成骨细胞增殖和分化的影响。[方法]多次酶消化法体外分离新生大鼠颅骨成骨细胞,进行原代培养。双重荧光染色激光共聚焦显微镜下观察成骨细胞吞噬钛颗粒后的组织形态学改变。CCK-8法检测0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/ml钛颗粒对成骨细胞增殖能力的影响,并筛选出半数致死浓度。在此浓度作用下分别加入10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的淫羊藿苷进行干预,观察淫羊藿苷对钛颗粒作用下成骨细胞增殖能力的影响,找出最佳药物浓度。以最佳药物浓度干预钛颗粒作用下的成骨细胞,于第3、7、14 d ELISA法检测各组细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,观察药物对成骨细胞分化功能的影响。[结果]激光共聚焦显微镜下可见吞噬了钛颗粒的成骨细胞皱缩变形,微丝(F-actin)排列紊乱。不同浓度的钛颗粒均可抑制成骨细胞增殖,呈浓度依赖性,与对照组相比有显著差异(P<0.05),0.5mg/ml为钛颗粒的半数致死浓度。10-10-10-6mol/L的淫羊藿苷均能促进钛颗粒作用下的成骨细胞增殖(P<0.05),与钛颗粒组相比具有显著差异(P<0.05),10-9mol/L为淫羊藿苷的最佳作用浓度。在此浓度下的淫羊藿苷可以显著抑制钛颗粒引起的成骨细胞ALP活性下降(P<0.05)。[结论]淫羊藿苷可以在体外逆转钛颗粒对成骨细胞增殖和分化的抑制作用,有望成为防治人工关节无菌性松动的有效药物。     

氯化锂联合淫羊藿苷对成骨细胞增殖分化的影响

目的研究氯化锂(LiCl)与淫羊藿(ICA)苷联合应用对成骨细胞增殖、分化的影响,为LiCl与ICA联合应用提高成骨细胞矿化能力提供研究基础。方法采用酶消化法和茜素红染色法鉴定并获得大量细胞为成骨细胞,随机分为4组即空白组、ICA组(80 nmol/L), LiCl(5 nmol/L),ICA(80 nmol/L)+LiCl(5 nmol/L)组,诱导21 d后采用茜素红法及碱性磷酸酶活性测定各组成骨细胞矿化能力及活性。采用CCK-8和Western blot法测定各组对体外成骨细胞增殖活性及成骨细胞中p-GSK3β,β-catenin水平。结果倒置显微镜下观察细胞多为单核、多边形及梭形,局部有细胞密集的细胞团,茜素红染色将钙化结节染成橘红色; LiCl及ICA单独作用于成骨细胞时,都可以明显促进成骨细胞的增殖,增加ALP活性及矿化能力,同时明显促进p-GSK3β、β-catenin蛋白的表达;但是LiCl与ICA联合应用能够明显促进成骨细胞的增殖,并且在分子水平能够明显抑制p-GSK3β、β-catenin的表达,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论 LiCl与ICA联合应用可以通过wnt信号通路促进成骨细胞的增殖、分化。     

淫羊藿苷对人成骨细胞增殖及OPG蛋白表达的实验研究

目的：建立体外培养人成骨细胞系,观察淫羊藿苷对人成骨细胞增殖的影响,以及对人成骨细胞内骨保护素（Osteoprorotegerin,OPG）蛋白表达的影响,探讨淫羊藿苷促进人成骨细胞骨形成的可能作用机制。方法：将手术中取得的人股骨头松质骨骨片,使用酶消化法进行培养,取生长良好的第3代人成骨细胞进行实验。实验分为4组,对照组给予15%NCS-DMEM-F12（1：1）培养液培养;淫羊藿苷组分别于正常培养液内添加终浓度为10-6、10-8、10-10mol/L淫羊藿苷。噻唑蓝比色法（MTT）分别在培养1、3、5、7、9d后观察各组人成骨细胞的增殖情况,用蛋白免疫印迹方法（in-cell western blot）测定各组培养8、10、12d后人成骨细胞内OPG蛋白的表达情况。采用重复测量的方差分析方法,比较各组间在不同时间点的作用差异。结果：MTT结果,淫羊藿苷组具有促进人成骨细胞增殖的作用,并呈明显的量效关系,即随着淫羊藿苷浓度的增高,其促人成骨细胞增殖的能力增强,以10-6mol/L淫羊藿苷组（0.402±0.033）促成骨细胞增殖的作用最显著,与对照组（0.268±0.031）比较差异有统计学意义（P〈0.05）。在时效关系的研究中,随着培养天数的延长,人成骨细胞的量逐渐增加,人成骨细胞于第5天时进入快速生长期,第7天进入平台期;淫羊藿苷组从第5天开始促进人成骨细胞的增殖,第7、9天仍然具有明显的促成骨细胞增殖的作用,以第9天促增殖作用最强。其中,第9天10-6mol/L淫羊藿苷组（0.402±0.033）与对照组（0.268±0.031）比较有统计学意义（P〈0.01）。OPG表达结果,对照组人成骨细胞培养至第8天时检测到OPG蛋白的表达,表达量为1.01±0.08,第12天达到表达高峰为1.80±0.10,两个值比较有统计学差异（P〈0.05）;在观察的不同天数内,不同浓度的淫羊藿苷组人成骨细胞内OPG蛋白表达低于对照组,且随着淫羊藿苷浓度的降低,OPG蛋白的表达量逐渐降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;干预12d,10-6mol/L淫羊藿苷组OPG量（1.67±0.13）和10-8mol/L淫羊藿苷组OPG量（1.64±0.05）比较,无统计学差异（P〉0.05）。结论：淫羊藿苷促人成骨细胞骨形成能力的作用途径之一,是通过提高人成骨细胞的增殖能力而实现。     

淫羊藿苷通过促进负调控因子Gα13的表达抑制破骨细胞形成

目的 研究淫羊藿苷对破骨细胞分化和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α13(Gα13)介导的信号通路的影响,探讨淫羊藿苷治疗骨质疏松的可能机制。方法 从C57/BL6小鼠四肢骨骨髓中提取原代单核巨噬细胞（bone marrow derived macrophages,BMMs）,使用核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stlimulating factor,M-CSF）将BMMs诱导成破骨细胞。同时使用不同浓度（0、1、10μmol/L）的淫羊藿苷进行干预,采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和鬼笔环肽染色、qPCR和Western blot等实验分析淫羊藿苷对破骨细胞形成及其对Gα13基因和Akt-GSK3β-NFATc1信号通路相关基因表达的影响。结果 TRAP染色和鬼笔环肽染色结果显示淫羊藿苷可显著抑制破骨细胞形成（P<0.05）。淫羊藿苷显著促进Gα13基因及蛋白表达（P<0.05）,显著抑制Akt-GSK3β-NFATc...     

Icariin stimulates the osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells via activating the PI3K–AKT–eNOS–NO–cGMP–PKG

Icariin, a prenylated flavonol glycoside isolated from Epimedii herba, has been found to be a potent stimulator of osteogenic differentiation and has potential application in preventing bone loss. However, the signaling pathway underlying its osteogenic effect remains unclear. We hypothesized that the osteogenic activity of icariin is related to the nitric oxide (NO) signal pathway and PI3K/AKT pathway in its upstream. Rat bone marrow stromal cells (rBMSCs) were cultured in osteogenic medium and treated with icariin or together with L-NAME, ODQ, PDE5, and/or LY294002 (the inhibitor of NOS, sGC, cGMP, and PI3K respectively), and effects were examined on the expression of signal messengers (NOS, NO, sGC, cGMP, PKG and PI3K) and the levels of osteogenic markers (alkaline phosphatase or ALP, osteocalcin and calcified nodules). It was found that icariin dose-dependently increased ALP activity, and treatment at the optimal concentration (10^− 5 M) increased NOS activity, iNOS and eNOS expression, NO production, sGC and cGMP contents and PKG expression besides the phosphorylation of AKT. The addition of L-NAME, ODQ and PDE5 significantly inhibited the icariin effects on above markers respectively. The addition of LY294002 decreased the p-AKT level, NOS activity, eNOS expression and NO production significantly, but had no significant effect on iNOS expression. The addition of any of the four inhibitors also abolished the osteogenic effect of icariin on rBMSCs as indicated by ALP activity, osteocalcin synthesis, calcium deposition and the number and areas of calcified nodules. These results suggest that the osteogenic effect of icariin involves the PI3K–AKT–eNOS–NO–cGMP–PKG signal pathway. Furthermore, dosage response studies showed that icariin at 10^− 6 M (a physiologically achievable concentration in vivo) also activated this signal pathway.     

黄瓜籽总皂苷对MC3T3-E1细胞分化及SPARC、OPG/RANKL表达的影响

目的观察黄瓜籽总皂苷提取物(cucumber seed saponins,CSS)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响,以及与骨质疏松相关的SPARC、OPG/RANKL/RANK信号通路的作用。方法通过MTT实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测、茜素红染色,考察不同浓度CSS对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化的影响;采用RT-PCR方法检测SPARC、OPG/RANKL mRNA表达水平; Western blot检测SPARC、OPG/RANKL的蛋白表达量。结果与阳性对照组相比,CSS能明显促进MC3T3-E1细胞增殖(P0.05),CSS高、中剂量组能明显提高MC3T3-E1细胞ALP活性及钙化结节数量(P0.05);与空白组相比,CSS不同剂量组均明显上调SPARC、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达水平(P0.05)。结论黄瓜籽总皂苷能够促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化及矿化能力,并通过上调SPARC、OPG/RANKL的表达水平提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

云克对骨质疏松症患者成骨功能影响的研究

目的 观察云克对骨质疏松症患者成骨功能的影响.方法 取骨质疏松症患者骨组织,酶消化法培养成骨细胞,给予不同浓度云克予以干预,CCK-8法检测细胞增殖功能、流式细胞仪检测细胞周期、对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色计数矿化结节的变化、Real-time RT-PCR检测骨钙素和骨形成蛋白(BMP)-...     

Glucose-induced inhibition of in vitro bone mineralization

Patients with diabetes tend to have an increased incidence of osteopenia that may be related to hyperglycemia. However, little is known about how glucose may alter bone formation and osteoblast maturation. To determine whether glucose affects osteoblastic calcium deposition, MC3T3-E1 cells were incubated in media containing either a normal (5.5 mmol/L) or high glucose concentration (15 mmol/L) or mannitol (15 mmol/L), and bone nodule formation was examined. Net calcium flux was measured thrice weekly and cumulative calcium uptake was determined. Compared with control incubations, glucose significantly inhibited daily and cumulative calcium uptake into the nodules. At the time of matrix maturation, cultures undergo a rapid phase of increased calcium deposition; this was significantly inhibited by the presence of glucose. Total calcium uptake, determined by acid digestion, was also significantly inhibited by glucose. Area and number of nodules were quantitated at the end of the incubation period (day 30) by staining with Alizarin Red S calcium stain. Compared with both control and mannitol-treated cultures, the number of nodules was increased by incubation with glucose. Furthermore, both the average total nodular area and calcified nodular area of large nodules were increased by glucose. Cellular proliferation as well as the release of markers of osteoblast activity (osteocalcin and alkaline phosphatase) were determined at the end of the experimental period (day 30). Cellular proliferation and alkaline phosphatase activity was significantly increased in the presence of glucose, however, the release of osteocalcin into culture media was similar in all three groups. In conclusion, the present study shows that elevated glucose concentration present throughout the development of murine osteoblasts stimulates cellular proliferation while inhibiting calcium uptake. The result of glucose inhibition of calcium uptake suggests that bone could be structurally altered in diabetes.     

地塞米松对人牙髓细胞增殖分化影响的研究

目的观察地塞米松对体外培养的人牙髓细胞增殖和分化的影响。方法收集拔除的无龋坏、无牙周疾病的健康前磨牙及第三磨牙,获得牙髓,酶消化联合组织块法体外培养人牙髓细胞(Human dental pulp cells,hDPCs),扩增后取第4代生长状态良好的细胞用于实验。分为两组,实验组hDPCs在含2%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的αMEM培养基中加入10-8mol/L地塞米松(Dexamethasone,Dex)培养,对照组单纯使用含2%FBS的αMEM培养基培养。在细胞培养第1、3、5天检测细胞增殖情况;细胞培养的第1、5、10天分别进行ALP染色及ALP定量分析检测细胞分化情况;细胞培养第10天进行茜素红染色观察钙化结节形成情况。结果细胞增殖活性检测显示,实验组培养第3天及第5天可见hDPCs增殖活性得到显著抑制,与对照组相比有统计学差异;ALP染色及定量测定:培养10 d后,地塞米松实验组ALP活性明显高于对照组;茜素红染色结果:培养10 d后两组细胞茜素红染色均为阳性,表明实验组与对照组均有钙化结节形成,但是实验组钙化结节形成数量较多。结论酶消化联合组织块法可以成功体外培养hDPCs。10-8mol/L地塞米松可显著抑制hDPCs的增殖活性,提高hDPCs的ALP活性及矿化能力。     

MAPK信号通路在淫羊藿甙促进成骨细胞Cbfa1蛋白表达中的作用

目的 观察淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响以及MAPK信号通路在淫羊藿甙促成骨细胞核心结合因子α1(core binding factor-1,Cbfa1)蛋白表达中的作用,以探讨淫羊藿甙对成骨细胞作用的信号传导机制.方法 用酶消化法分离24 h内新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养.在培养液中加入淫羊藿甙(10 ng/mL),作用于成骨细胞5 min、10 min、30 min、60 min,抽提总蛋白,用Western blot法检测细胞中ERK、p-ERK、P38和p-P38蛋白的表达.用雌二醇(10-8 mol/L)作用于成骨细胞5 min、10 min、30 min,同上法检测细胞中ERK、p-ERK、P38和p-P38蛋白的表达.用淫羊藿甙(10 ng/mL)、雌二醇(10-8 mol/L)和u0126或SB203580单独或共同干预成骨细胞24 h,抽提核蛋白,用Western blot法检测Cbfa1蛋白的表达.结果 ①淫羊藿甙作用于成骨细胞,30 min时可促进ERK蛋白的磷酸化,并可持续至60 min,和空白组比较,差异有显著性(P<0.05);淫羊藿甙作用于成骨细胞,5 min时即可促进P38蛋白的磷酸化,在30 min时达高峰,并可持续至60 min,和空白组比较,差异有显著性(P<0.05).②雌二醇作用于成骨细胞,在30 min时可促进ERK蛋白的磷酸化,和空白组比较,差异有显著性(P<0.05);雌二醇作用于成骨细胞,在10 min时可促进P38蛋白的磷酸化,并可持续至30 min,和空白组比较,差异有显著性(P<0.05).③淫羊藿甙和雌二醇均能促进成骨细胞中Cbfa1蛋白的表达,和空白组相比,差异有显著性(P<0.05).u0126和SB203580可以抑制淫羊藿甙和雌二醇促进Cbfa1蛋白表达的作用.结论 ①淫羊藿甙和雌二醇均可以激活成骨细胞中ERK/MAPK和P38/MAPK信号通路;②淫羊藿甙和雌二醇均能促进成骨细胞中核转录因子Cbfa1的表达,并且ERK/MAPK和P38/MAPK信号通路参与了此过程.     

适宜电刺激对成骨细胞平面培养下细胞增殖分化及BMP-2表达的实验研究

目的:观察适宜电流刺激成骨细胞在平面培养下成骨细胞增殖及分化,明确是否具有促进增殖、分化作用,并观察电流刺激下BMP-2表达的变化。方法:将来自家兔幼仔颅骨提取的成骨细胞进行平面培养,2代之后进行分类培养,实验组进行电流刺激,并给予相同的刺激时间和刺激强度,对照组未进行电流刺激。之后在不同时间点进行细胞增殖、分化检测及BMP-2蛋白表达分析。结果:实验组8d内光镜下可见大量成骨细胞增殖,成骨细胞呈多形性改变,6～8d细胞内出现少量钙化点,而对照组骨细胞增殖缓慢。实验组分化明显,碱性磷酸酶及钙结节染色阳性,碱性磷酸酶定量分析显示逐渐增加。实验组经免疫组化分析显示BMP-2量逐渐增加。结论:电刺激可促进成骨细胞的增殖分化而达到实现细胞数目的短时间增加,细胞内部经过免疫组化染色后显示BMP-2表达增加。     

Genistein对乳腺癌细胞致成骨细胞生物学功能改变的影响

目的 探讨Genistein对乳腺癌细胞致成骨细胞(osteoblast, OB)增殖、分化和矿化功能的影响,观察Genistein在乳腺癌骨转移的病理条件下是否能调节OB生物学功能.方法 源于大鼠颅盖骨的原代OB与50%来自人源性乳腺癌细胞系MDA-MB-231或MCF-7的条件培养基(conditioned medium,CM)共同培养,并加入5×10-7 mol/L (G7)、5×10-8 mol/L (G8)或5×10-9mol/L (G9) 的Genistein进行干预.MTT法观察其对OB增殖的影响;PNPP偶氮法观察其对OB碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性的影响;茜素红S(ARS)进行矿化结节染色并计算面积以观察其对OB矿化能力的影响.结果 MDA-MB-231和MCF-7细胞条件培养基可显著抑制OB的增殖.用Genistein干预1 d、3 d和5 d后,OB增值率可有不同程度的提高,差异有统计学意义(P<0.05).此外,乳腺癌细胞条件培养基可明显下调OB的ALP活性,而用不同浓度的Genistein干预后,OB的ALP活性分别较MDA-MB-231和MCF-7细胞条件培养基组增加22.7%、32.4%、63.5%和27.7%、32.0%、58.3%(P<0.05).Genistein还可改善乳腺癌细胞条件培养基对OB矿化能力的抑制,增加OB形成的矿化结节面积.结论 在乳腺癌骨转移的病理条件下,Genistein可促进OB的增殖、分化和矿化能力,改善乳腺癌细胞对OB生物学功能的抑制作用.     

哌嗪雌酚酮对新生大鼠头盖骨成骨细胞的影响

目的 了解新合成化合物——哌嗪雌酚酮对体外培养成骨细胞的影响。方法 应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法、von Kossa染色法、流式细胞术及RT-PCR观察哌嗪雌酚酮对体外培养成骨细胞的增殖、分化、矿化结节形成、细胞周期及I型胶原蛋白表达的影响。结果 哌嗪雌酚酮可刺激成骨细胞增殖,刺激骨结节形成(10-7mol/L组,P<0.05)。结论 哌嗪雌酚酮具有刺激体外培养成骨细胞增殖和晚期分化成熟的功能。