尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒.方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入Sac Ⅰ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定.再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定.所构建的重组质粒转化JM109,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定.结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5 kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5 kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同.所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54 kD蛋白,经鉴定系EWS-FLI1蛋白.结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.     

铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的 构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础.方法 从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexAl基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的 基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定.结果 获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1(1.5 kb)基因,序列分析结果与PA01/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA(1.2 kb)片段相符.结论 含mexA(1.2 kb)基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础.     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

乳胶过敏原Hev b 3的克隆表达和纯化及其过敏原性检测

目的:克隆乳胶主要过敏原Hevb3基因,构建其原核表达载体并表达和纯化重组蛋白,了解重组的Hevb3是否具有和相应IgE特异结合的过敏原特性。方法:用RT-PCR方法从新鲜海南橡胶树叶提取的总RNA中扩增出Hevb3的cDNA,将其克隆于原核表达载体pQE30质粒,转化大肠杆菌XL1-Blue,酶切和测序验证构建的载体,利用Ni-NTA柱层析纯化重组蛋白并用SDS-PAGE和WesternBlot验证。结果:酶切和测序结果证实克隆了正确的Hevb3序列,重组表达并纯化的蛋白具有和特异IgE抗体结合的过敏原特性。结论:成功构建了乳胶主要过敏原的原核表达载体,并纯化了具有过敏原特性的重组蛋白,为过敏原的标准化创造了条件。     

转录因子Oct-4基因的克隆和原核表达

目的克隆转录因子Oct-4基因、构建原核表达载体。方法从人胚胎标本中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Oct-4基因的cDNA,再通过基因重组技术将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,纯化后SDS-PAGE分析表达产物。结果电泳证实RT-PCR扩增产物与预期长度一致,测序结果与GenBank公布的Oct-4基因序列一致较好,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量47KD左右出现目的蛋白表达条带。结论成功构建了pET-Oct-4原核表达载体,表达并纯化出Oct-4蛋白,为进一步研究Oct-4蛋白打下了实验基础。     

人载脂蛋白M野生型和突变型表达载体的构建及鉴定

目的: 构建人载脂蛋白M (APoM)野生型和突变型原核表达载体PGEX-KG-APoM及真核表达载体PcDNA3.1(+)-APoM。方法: Trizol法抽提HePG2细胞总RNA,RT-PCR扩增APoM全长基因,将基因片断重组到PMD18-T质粒中构建PMD18-T-APoM重组质粒载体,转化到大肠埃希菌JM109后筛选阳性克隆,提取质粒酶切和测序鉴定。采用Sited-directedMutagenesis定点诱变试剂盒对APoM基因进行体外定点诱变,DNA测序鉴定定点诱变成功与否。用双酶切方法分别将APoM野生型和突变型基因定向连接到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体PcDNA3.1(+)中,构建野生型和突变型PGEX-KGAPoM重组体和PcDNA3.1(+)-APoM重组体,分别转化到大肠埃希菌DH5α内,提取质粒酶切鉴定和测序鉴定。结果: 成功克隆了APoM并构建了野生型和突变型原核表达载体和真核表达载体。结论: 通过RT-PCR,定点诱变及基因重组技术成功构建野生型和突变型重组表达质粒PGEX-KG-APoM和PcDNA3.1(+)-APoM,为进一步研究APoM的功能奠定了基础。     

小鼠原核表达载体pQE30/FGFR-1的构建及表达鉴定

目的构建小鼠FGFR—1胞外段基因重组原核表达载体pQE30／FGFR—1，并在大肠杆菌JM109中表达。方法利用RT—PCR技术．从胚肝中扩增出小鼠的FGFR—1胞外段基因的cDNA，用内切酶消化后插入原核表达质粒pQE30中。经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，体外转化大肠杆菌，用RT—PCR和免疫印迹方法鉴定，同时利用Ni—NTA琼脂柱层析法纯化复性重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实PCR扩增的cDNA及构建的重组原核表达质粒pQE30一FGFR—1正确，并在大肠杆菌中正确表达。经纯化后，进行SDS—PAGE电泳显示得到1条分子量约40kDa的蛋白质条带。结论成功构建小鼠原核表达载体pQE30／FGFR—1并在大肠杆菌中有效表达，纯化后获得具有活性的重组蛋白质。     

人心肌肌钙蛋白I基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnⅠ的cDNA片段,设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因,重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致,测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnI的cDNA片段，设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导入宿主菌BL21（DE3）中，采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因，重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致，测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

乙型肝炎病毒X基因的克隆与鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,以进一步研究其基因产物的功能及致病机制.方法 以肝炎患者血清DNA为模板,用PCR方法扩增乙型肝炎病毒X基因,构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,经酶切电泳验证重组质粒的正确性,并对X基因进行测序鉴定.结果 PCR结果显示,扩增片断大小约465 bp,与预期相同.重组质粒经酶切电泳判断有目的片段插入,方向正确,经测序证实插入片段是乙型肝炎病毒X基因,编码框无误.结论 成功构建乙型肝炎病毒X基因重组质粒pQE30-HBx.     

人促血小板生成素(TPO)原核表达载体pQE30-TPO的构建

目的：获得人血小板生成素全长cDNA克隆，并构建重组表达载体pQE30-TPO。方法：利用RTPCR技术从人胎肝细胞mRNA中扩增目的基因，将扩增产物克隆至pMD18-T载体，经菌落PCR鉴定后，DNA序列分析重组质粒pMD18－T－TPO。构建并鉴定原核表达载体pQE30-TPO。结果：构建了重组克隆载体pMD18-T-TPO和重组表达载体pQE30-TPO，序列分析表明，获得的TPO cDNA序列与国内外报道的人促血小板生成素核苷酸序列完全一致。结论：成功构建了重组表达载体pQE30-TPO，为TPO的进一步研究奠定了基础。     

新的人内源性逆转录病毒NP9基因的分子克隆与病毒蛋白表达

目的:研究新近发现的人内源性逆转录病毒NP9基因与自身免疫性疾病的相关性及其可能的作用机制,构建该基因的蛋白表达系统. 方法:提取自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的总RNA,利用RT-PCR 技术,扩增NP9基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体pQE30中,然后提取质粒,酶切鉴定;最后经IPTG诱导,原核表达重组子在M15宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE与Western 印迹分析与鉴定.结果:应用RT-PCR 技术,从系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的总RNA中扩增到一条大小约为250 bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为NP9基因,具有一个完整的开放阅读框架;将pQE 30-NP9重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达NP9重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹技术鉴定证实:在相对分子量约9kD处见明显的病毒特异性的高表达条带.结论:已成功克隆了新的人内源性逆转录病毒NP9基因,并经IPTG诱导,在M15宿主菌中表达了相应的病毒蛋白,为进一步研究该逆转录病毒与自身免疫性疾病的相关性奠定基础.     

鸡成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体胞外段原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建重组原核表达载体以获得鸡成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体（FGFR-1）胞外段活性蛋白，为进一步研制FGFR-1蛋白质肿瘤疫苗打下基础。方法利用RT—PCR技术，从鸡胚肝中扩增出鸡的FGFR-1胞外段基因的cD—NA，用内切酶消化后插入原核表达质粒pQE30中。经过琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，体外转化大肠埃希菌，用RT—PCR和免疫印迹方法鉴定是否能够正确表达，同时利用Ni—NTA琼脂柱层析法纯化复性重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实PCR扩增的cDNA及构建的重组原核表达质粒pQE30-FGFR-1正确，并在大肠埃希菌中正确表达。经纯化后，进行SDS-PAGE电泳显示得到1条分子量约40ku的蛋白质条带。结论成功构建鸡FGFR-1胞外段原核表达载体并获得重组活性蛋白。     

人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中的表达差异及其原核表达和鉴定

目的研究一种新的人类β3-糖基转移酶β3GnT8/β3GalT7在恶性血液系统肿瘤细胞中mRNA水平的表达情况,并在原核体系中克隆和表达。方法运用半定量RT-PCR方法研究人β3GnT8/β3GalT7在13种恶性血液系统肿瘤细胞中的表达谱,以其中表达该基因最高的THP-1细胞的cDNA为模板,克隆目的基因,构建重组表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。经超声裂菌,尿素溶解包涵体,过Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化,透析复性浓缩后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot验证。结果 K562、U937、THP-1和NB4细胞株均较高效表达β3GnT8/β3GalT7,其中THP-1细胞株表达最高;并成功构建原核表达载体pQE30-β3GnT8/β3GalT7,表达出相应的重组蛋白。结论人β3GnT8/β3GalT7在13株细胞中表达有显著差异,并获得大量较纯的目的蛋白,其分子量与预测相符,为单克隆抗体制备及进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

HBsAg和人微小病毒B19 VP2联合抗原的克隆及表达

目的构建乙肝表面抗原-人微小病毒B19VP2融合蛋白的原核表达系统，并检测其表达蛋白的抗原反应性。方法用PCR扩增乙肝表面抗原（HBsAg）基因及B19病毒VP2基因，分别重组入pGEM-T，构建出pGEM-T-HBs及pGEM-T-VP2并测序分析；测序证实序列正确后，将pGEM-T-HBs中的HBs基因克隆入pQE30表达载体中，得到pQE30-HBs；再将pGEM-T-VP2中的VP2基因克隆入pQE30-HBs中，得到pQE30-HBs-VP2后转化至BL21（DE3）宿主菌中，并以IPTG诱导表达融合蛋白，以Western-blot鉴定。结果pQF30-HBs-VP2可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达，Western-blot检测结果显示所表达融合蛋白均可与抗-HBs和抗-VP2结合反应。结论成功构建pQE30-HBs-VP2原核表达载体，且其表达的重组蛋白具有良好的HBsAs和VP2蛋白的双重抗原的反应原性。从而建立了表达B19和HBV的联合抗原表达系统，同时给HBV和B19病毒重组联合疫苗的研制和复合诊断试剂提供了抗原参考。     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。