基于多重串联式PCR基因碟片研发利什曼原虫检测技术

目的 本研究基于多重串联式 PCR基因碟片（MT - PCR）技术,建立我国口岸重点关注的杜氏利什曼原虫(Leishmaniasis donovani)、婴儿利什曼原虫(Leishmaniasis infantum)、热带利什曼原虫(Leishmaniasis tropica)和硕大利什曼原虫(Leishmaniasis giganteum)高通量检测方法。方法 根据利什曼原虫基因组学结果,对比分析不同利什曼原虫,针对ITS - 1、ITS - 2、P0、RACK基因设计引物,同时设计品系特异性引物,使用巢式荧光定量 PCR 检测各个基因。结果 4个基因组的扩增产物都可以形成明显的特异熔解峰,4个基因组的扩增曲线差异明显。ITS - 1、P0、ITS - 2、RACK的检测限均可达到103 copies /μl,批内和批间重复变异系数都小于5%。针对4种利什曼原虫检测的灵敏度均为100%,特异性为99.42%,准确性为99.55%。结论 MT - PCR能够用于利什曼原虫高通量检测工作,有益于丰富传染病检测途径,提高口岸输入性传染病检测效率。     

湖北钉螺微卫星锚定PCR产物序列分析

目的 分析4个种群湖北钉螺中微卫星序列及其两侧序列的特点.方法 以(CA)8RY为引物对湖北钉螺基因组DNA进行微卫星锚定PCR(SSR-PCR)扩增,对全部159个扩增产物进行T克隆并测定其中82个片段的核苷酸序列.结果 SSR-PCR的扩增产物是湖北钉螺基因组DNA上的散在区域,不是微卫星序列,但扩增产物中含有微卫星序列,测序的82个片段中36个克隆片段含有微卫星序列.微卫星序列其侧翼序列有一定的保守性,同一个微卫星的侧翼序列多数情况下是相同的.(GA/CT)n、(TTAGGG/CCCTAA)n两类微卫星在4个钉螺种群中均有发现,(CAA)n仅在福建福清种群中发现,(TCTCTG)n仅在安徽贵池种群中发现,(GAA～TTC)n、(CAA/TTG)n、(CAT)n三种微卫星序列仅在四川普格种群中发现.结论 SSR-PCR扩增的不是微卫星,其结果的分析应当类似于随机扩增多态性DNA.因此SSR-PCR不能十分有效体现微卫星作为分子标记的优势,应当根据微卫星的侧翼序列设计针对微卫星的引物,对微卫星进行PCR扩增并进行分析.     

杜氏利什曼原虫L-脯氨酸的运输及其调节

我们研究了利什曼原虫吸收L-脯氨酸的时间过程以及pH值、温度、环已胺、叠氮钠(NaN3)和2,4-二硝基酚(2,4-DNP)及其他氨基酸(其中包括D-脯氨酸),对杜氏利什曼原虫吸收L-脯氨酸的影响,现将研究结果报道如下。1.L-脯氨酸吸收的时间过程:杜氏利什曼原虫吸收L-脯氨酸的量在一定时间限度内是随着时间的延长而增加,前2min内呈线性速度增长。在20min时,杜氏利什曼原虫原鞭毛体及无鞭毛体积累脯氨酸的量分别为140及11nmol/1×108细胞。显然,原鞭毛体吸收L-脯氨酸的速度比无鞭毛体快得多。本实验表明约大10倍以上。另外,吸收L-脯氨酸的量与细胞…     

2015-2016年贵州省手足口病非EV71、非CVA16肠道病毒型别鉴定和分析

目的 探讨2015-2016年贵州省手足口病非EV71(Enterovirus 71,EV 71)、非CVA16(Coxsackievirus A16,CVA16)肠道病毒株的病原构成及优势型别。方法 共收集2015-2016年贵州省儿童手足口病疑似患者肛拭子350例标本,应用实时荧光定量PCR法筛选出非EV71、非CVA16型肠道病毒,采用 RT-PCR法扩增病毒VP1区序列,PCR阳性扩增产物进行测序,对测得序列进行型别鉴定并与国内外各型代表株进行核苷酸同源性分析,构建系统进化树。结果 从收集到的手足口病疑似患者肛拭子标本中,共分离到21株其他肠道病毒,分别为:CVA5、CVA7、CVA9、CVB3(Coxsackievirus B3,CVB3)、 CVB4 、E11(Echovirus11,ECHO11)、 E17各1株,CVA10 、CVB1各2株,CVB5、E7各5株。通过系统发育树揭示,分离到的同型别毒株之间具有同源性,而非同型别的毒株与国内外各代表株之间具有同源性。结论 贵州省引起手足口病的非EV71、非CVA16型肠道病毒型别分布较广,包括CVB组,CVA组和ECHO病毒,其中CVB5、E7为非EV71、非CVA16型肠道病毒主要病原体。     

我国食品来源金黄色葡萄球菌种群结构分析

目的了解我国食源性金黄色葡萄球菌(金葡菌)的种群结构。方法通过全基因组测序方法对2006-2020年我国16个省份收集的763株食源性金葡菌进行多位点序列分型、葡萄球菌蛋白A编码基因(spa)和葡萄球菌染色体mec基因盒(SCCmec)分型, 使用BioNumerics 7.5软件创建基于ST类型的最小生成树。国外进口食品分离到的金葡菌31株被纳入基因组系统发育树的构建。结果 763株金葡菌共鉴定出90个ST型和160个spa型别, 其中20种为新ST型别。72个(72/90, 80.0%)ST型属于22个克隆群, 其中主要型别为CC7、CC1、CC5、CC398、CC188、CC59、CC6、CC88、CC15和CC25, 占82.44%(629/763)。其中优势克隆群中ST型和spa型别随着时间的变化呈多态性变化。耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的阳性率为7.60%, 共鉴定出7种SCCmec型别, 以ST59-t437-Ⅳa(17.24%, 10/58)、ST239-t030-Ⅲ(12.07%, 7/58)、ST59-t437-Ⅴb(8.62%, 5/58)、ST338-t437-...     

肠道病毒71型SHZH03株5′-UTR区遗传进化分析

目的构建肠道病毒71型SHZH03、SHZH98、SHZH-001以及具有中枢神经毒性的MS株的5′-UTR序列的系统发育树,研究我国肠道病毒71型的神经毒性和分子流行病学。方法以肠道病毒71型SHZH03株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR方法,扩增5非编码区(5′-UTR)序列,将其克隆至pGEM(-T载体中,对其进行序列测定,与我国早期分离的肠道病毒71型SHZH98、SHZH-001以及具有神经毒性的肠道病毒71型标准株MS的5′-UTR序列进行比较分析。结果 SHZH03株的5′-UTR序列全长743bp,与SHZH98株的5′-UTR序列的同源性为99.2%,与具有中枢神经毒性的BrCr株的5′-UTR序列的同源性为94.2%。结论我国分离的SHZH03株和SHZH98株的5′-UTR序列同源性高,而与具有中枢神经毒性的MS株的5′-UTR序列有较大差异。     

陕西省定边县鼠疫疫区啮齿动物巴尔通体感染情况调查

目的了解陕西省定边县鼠疫疫区啮齿动物巴尔通体感染情况及携带种类,为巴尔通体感染的预防控制提供科学依据。方法 2015年在定边县鼠疫疫区的2个乡镇捕获啮齿动物,无菌取鼠脾,分离培养巴尔通体,疑似菌株提取DNA,PCR扩增glt A基因,测序并根据序列应用Mega 6.06软件进行系统发育分析,确定巴尔通体属种。结果共捕获3种223只啮齿动物,分离巴尔通体78株,感染率为34.98%,其中主要啮齿动物长爪沙鼠的感染率为34.72%;序列分析表明定边县鼠疫疫区共检出4个巴尔通体种群:伊丽莎白巴尔通体(B.elizabethae)、格拉汉姆巴尔通体(B.grahamii),另外2个种群与泰勒巴尔通体(B.taylorii)、文森巴尔通体阿鲁潘亚种(B.vinsonii subsp.arupensis)亲缘关系较近,有待进一步确认。结论陕西省定边县鼠疫疫区啮齿动物中有巴尔通体感染,存在人群感染的风险。     

吉林省2013年肠道病毒71型VP1编码区基因特征分析

目的为了解吉林省2013年肠道病毒71型(EV71)流行株基因学特征。方法对吉林省2013年手足口病来源的EV71阳性分离物进行VP1编码区逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,并对扩增产物进行核苷酸序列测定,使用Mega4和Bioedit软件对扩增序列进行基因亲缘关系和氨基酸位点变异分析。结果吉林省2013年分离到的7株EV71同属于C4a基因亚型,并且在VP1编码区第22位氨基酸位点均由谷氨酰胺(Q)突变为组氨酸(H),这一结果与2008年安徽阜阳株突变一致;有2株在VP1编码区第289位点由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)。结论吉林省2013年的7株EV71流行株与C4a代表株位于同一分支,属于C4a基因亚型,且与2008年阜阳株(EU703813-Fuyang-08/2-C4a)亲缘关系最近,而且发生了氨基酸位点变异。     

2008年人肠道病毒71型的多个传播链在甘肃省流行

目的研究2008年中国甘肃省手足口病（Hand,Footand Mouth Disease,HFMD）患者中,人肠道病毒71型（Human Enterovirus71,HEV71）的分子进化特征。方法采集甘肃省门诊就诊的HFMD患者粪便、疱疹液、咽拭子标本进行病毒分离,然后对阳性病毒分离物进行HEV71特异性逆转录一聚合酶链反应鉴定,随机选取20株HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析,与其它38株各基因型和基因亚型的HEV72代表株构建基因亲缘性关系树。结果20株甘肃省HEV72分离株,与1998年以来在中国（未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区,下同）分离的HEV71在核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高,尤其与2008年中国流行的HEV71同源性最高,与C4亚型代表株聚为一支,属于C4基因亚型C4b进化分支。但20株HEV71之间在VP1区核苷酸和氨基酸水平上有一定差异,同源性分别为92．5％～100．0％和96．9％～100．0％。在亲缘进化树中显示,这些HEV71分离株处在不同的簇中,表现为20株HEV71分离株至少属于7条病毒传播链。结论2008年甘肃省流行的HEV71属于Ct基因亚型C4b进化分支,并且存在多个传播链。它们与2008年中国其它省流行的HEV71在基因亲缘关系和流行时间关系上都很接近,说明甘肃省HEV71不是独立进化的,而是与中国流行的HEV71在共同进化。     

恙虫病东方体山东分离株Sta56基因全序列扩增及酶切分析

目的明确山东恙虫病东方体（Ot）分离株Sta56基因全序列与其他已知的序列之间的遗传变异关系。方法对从山东省费县恙虫病患者、黑线姬鼠、小盾纤恙螨体内分离的3株Ot分离株Sta56基因全序列进行聚合酶链反应（PCR）扩增；选取4种内切酶HinfⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ、PstⅠ对PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP）；对代表株XDM2株Sta56基因全序列测序，运用Clustal X（5、0）和PHYLIP软件对测得的序列与GenBank中已知的Ot序列构建系统发育树，进行比较分析。结果患者分离株B-16、黑线姬鼠分离株FXS2和小盾纤恙螨分离株XDM2均扩增出接近1．6kbp的目的条带。Ot山东分离株PCR扩增产物经HhaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、RstⅠ酶切后图谱一致，但与国际参考株Gilliam、Karp、Kato株的RFLP图谱均不相同；虽与日本地方株Kawasaki株的酶切图谱有相似之处，但存在酶切位点的突变。序列同源性分析结果显示，山东地区代表株XDM2株Sta56基因全序列与Kawasaki型相应的序列同源性最高，为97％，氨基酸序列同源性为92％。结论经Sta56基因全序列分析，仇山东分离株基因型虽与日本Kawasaki型相似，但也存在差异。     

辽宁省风疹野病毒基因特征分析

目的 了解辽宁省现阶段流行的风疹野病毒基因特征,为风疹的控制和消除提供科学依据.方法 用Vero/Slam细胞从2007-2008年采集的风疹暴发和散发患者标本中分离到22株风疹野病毒(Rubclla Virus,RV),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)针对RV分离株的E 1基因739个核苷酸片段进行PCR扩增,再对扩增产物进行核苷酸序列测定,与世界卫生组织(WHO)RV基因型参考株进行分子流行病学比较分析.结果 核苷酸和氨基酸同源性比对及构建亲缘关系树结果显示,22株RV分离株属1 E基因型,核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%～100.0%和99.1%～100.0%;与1 E基因型参考株序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0%～99.1%和99.1%～100.0%结论辽宁省分离的22株RV均为1 E基因型,并且可能是辽宁省现阶段的优势基因型.     

2014年-2015年北京某区H3N2亚型流感病毒HA基因特性分析

目的了解北京市门头沟区H3N2亚型流感病病毒HA基因变异规律和进化趋势。方法随机选择2014年-2015年流感病原学监测中分离到的H3N2型毒株10株,采用RT-PCR法扩增病毒HA基因后序列测定,并与WHO推荐疫苗株进行比对、构建系统进化树。结果 2014年-2015年流感监测期间,北京市门头沟区人群中流感病毒以H3N2型占优势,通过分离到的10株病毒HA基因绘制种系发生树,表明这些毒株与WHO推荐的疫苗株A/Texas/50/2012相比,处于同一大分支上,不同的小分支上。结论北京市门头沟区2014年-2015年H3N2流感病毒HA基因特性与疫苗株虽然接近,但当年疫苗株大部分滞后流行株。     

2005-2009年大连市流感病毒血凝素基因遗传特性分析

目的分析大连市2005-2009年流感病毒血凝素(HA)基因变异情况。方法采用MDCK细胞分离培养季节流感H1N1亚型28株;H3N2亚型9株;B型(Yamagata系)24株,采用RT-PCR法分节段扩增各毒株血凝素基因,并进一步对各片段进行核苷酸和氨基酸序列测定分析。结果 2005-2009年,大连市分离到的甲型H1N1病毒变异较大,其中2009年分离的一株H1N1亚型毒株A/liaoningxigang/136/2009(H1)与该年WHO推荐的疫苗株相比,抗原决定簇B区上有4个位点发生了突变,属于新的变种。2005、2007年分离的H3N2流感病毒株,与疫苗株相比序列同源性较高,并未发生大的变异;2007-2008年流行的B型Yamagata系病毒与疫苗株B/Shanghai/361/02相比,有7个氨基酸位点发生改变,其中两个位于抗原决定簇,并于196位增加一个糖基化位点。结论各年度WHO推荐的疫苗株与流行株之间匹配性不完全一致,每年由于核苷酸序列的变化而引起了不同程度的抗原性漂移。     

江苏省2012年麻疹病毒的基因特征分析

目的对江苏省2012年麻疹病毒(measles virus,MV)进行分离,并分析其基因特征。方法对江苏省2012年麻疹咽拭子进行病毒分离,麻疹病毒分离株针对N基因进行PCR扩增,并对该PCR产物进行序列测定,结合从基因库下载的中国MV毒株序列以及世界卫生组织(WHO)MV基因型参考株一起进行分子流行病学研究。结果通过比较核苷酸和氨基酸同源性和构建亲缘关系树发现,江苏省2012年MV分离株属H1a基因型,但序列相互间存在差异。此外,通过分析江苏省2012年MV分离株的遗传距离发现,MV毒株序列同源性和亲缘关系树分析结果一致。结论江苏省2012年流行的麻疹同属H1a基因型,是由H1a基因型MV的多个传播链引起的;且MV毒株间存在序列差异,说明在江苏省流行的MV发生了一定程度的变异。     

江苏省2011年流行性腮腺炎病毒分子流行病学分析

目的:分离江苏省2011年流行性腮腺炎病毒(Mumps Virus,MuV),并分析其基因特征。方法:对江苏省2011年腮腺炎咽拭子进行病毒分离,对MuV分离株针对SH基因进行PCR扩增,并对该PCR产物进行序列测定,结合从基因库下载的中国MuV毒株序列以及世界卫生组织(WHO)MuV基因型参考株一起进行分子流行病学研究。结果:通过比较核苷酸和氨基酸同源性和构建亲缘关系树发现,江苏省2011年MuV分离株属F基因型,但序列相互间存在差异。此外,通过分析江苏省2011年MuV分离株的遗传距离发现,MuV毒株序列同源性和亲缘关系树分析结果一致。结论:江苏省2011年流行的MuV同属F基因型,是由F基因型MuV的多个传播链引起的。并且2011年的MuV毒株间存在序列差异,说明在江苏省流行的MuV发生了一定程度的变异。     

天津市手足口病分子流行病学分析

目的分析天津市手足口病病原学分布及肠道病毒71型(EV71)分子流行病学特点。方法采集天津市各医院2008—2010年手足口病住院患者粪便标本2 377份,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道病毒核酸;选取部分EV71阳性标本分离病毒,采用RT-PCR扩增其VP1基因,进行序列测定和同源性分析,建立系统发生树。结果 2 377份手足口病粪便标本中,肠道病毒总阳性率为70.72%(1 681/2 377),其中EV71占48.30%,CV-A16占37.36%,其他EV占14.34%;31株EV71分离株与C4亚型的C4a分支参比株具有最高核苷酸序列同源性,同源性为95.7%～99.2%,在系统发生树上均归属于C4a分支。结论天津市2008—2010年手足口病主要病原体为EV71,其流行株为C4亚型中的C4a病毒株。     

天津市2007-2010年流感监测及H3亚型毒株HA1基因特性分析

目的 了解2007-2010年天津市流感流行特点及季节性流感H3N2亚型HA1基因变异特性.方法 采用MDCK细胞培养法分离流感病毒,选取14株H3亚型流感毒株进行RT-PCR扩增HA1片段,产物纯化后进行核苷酸序列测定,测定结果与WHO全球流感疫苗株序列进行同源比对,绘制种系发生树.结果 采集咽拭子标本4220份,分...     

布鲁菌16S rDNA基因遗传分析

目的通过分析临床分离的布鲁菌、其他盐杆菌科细菌以及临床常见致病菌的16SrDNA基因片段的差异并构建16SrDNA系统发育树,为进一步研究布鲁菌打下基础。方法 PCR扩增临床分离株的16SrDNA并测序;从EMBL下载常见盐杆菌科细菌和临床上常见致病菌的16SrDNA序列。利用CLUSTALX和MEGA程序进行16SrDNA比对并构建系统发育树。结果成功扩增了临床分离菌株的16SrDNA,得到测序结果,比对临床分离菌株和相关菌株后,发现了特异序列5′-ATCCCGGTCGCGGTTAGTGG-3′;系统发育树表明不同种的布鲁菌间的距离非常接近;布鲁菌和醋菌属的进化距离较近,但是和其他的盐杆菌的进化距离较远。结论在布鲁菌16SrDNA中存在特异序列5′-ATCCCGGTCGCGGTTAGTGG-3′,有可能作为探针来快速检测布鲁氏菌。