新基因TSBAG的生物信息学分析及其在小鼠睾丸组织中的表达

目的：筛选与精子发生相关的睾丸特异性新基因,并探讨其在精子发生过程中所起的作用。方法：将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,通过杂交信号的比较,筛选出差异表达的基因。用生物信息学软件对该基因进行生物信息学分析。RT-PCR分析该基因在小鼠不同发育阶段睾丸、小鼠不同组织中的表达。结果：通过4日龄、9日龄、18日龄、35日龄、54日龄和6月龄小鼠睾丸的芯片信号比较筛选出一个差异表达功能未知的新基因(GenBank登录号：BC049770),全长891 bp,含有702 bp的完整ORF,编码一个233个氨基酸、相对分子量为26．938 kD的蛋白质,我们将其命名为TSBAG(testis-specific BAG-like protein)。亚细胞定位预测显示,TSBAG基因可能在细胞核中表达。EBI功能域预测发现,在蛋白质序列8-62处有一个BAG功能域。RT-PCR分析表明,TSBAG基因特异性表达于小鼠睾丸组织中且具有时序性表达。TSBAG蛋白在人的同源基因GenBank登录号为AY349359,在233个氨基酸区域内有83%的同源性。结论：TSBAG基因在小鼠睾丸组织中特异性表达,且与小鼠精子发生过程一致。     

哺乳动物P1精蛋白基因表达的研究

目的:研究哺乳动物P1精蛋白基因在大鼠和小鼠中的表达。方法:用RT-PCR法制备大鼠P1精蛋白(rP)cDNA,用小鼠P1精蛋白(mP1)DNA重组质粒(pUC8)制备mP1cDNA,rPcDNA和mP1cDNA经迪高辛标记后作为探针,用Northern杂交等技术分析基因表达情况。结果:rPcDNA与大鼠睾丸RNA有杂交反应,而与肝、脑RNA无交叉反应;rPcDNA和小鼠睾丸RNA有交叉反应;mP1cDNA探针与性成熟不同阶段小鼠睾丸RNA杂交结果表明:小鼠性成熟过程中,在睾丸出现圆形精子细胞后mP1基因开始转录,而翻译成蛋白质是在性成熟小鼠睾丸内出现长形精子细胞后。结论:哺乳动物P1精蛋白的表达有器官特异性,是睾丸特异表达的基因,P1精蛋白基因在进化上保守,因而在大、小鼠睾丸中均能检测到杂交讯号;精蛋白基因的表达表现为翻译延迟,该基因在圆形精子细胞阶段开始转录,而在长形精子细胞阶段翻译成蛋白质。     

SEPT11基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达特征

目的初步探讨Septin11(SEPT11)基因在精子发生中的作用。方法通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光等方法检测SEPT11在不同周龄野生型小鼠以及成年睾丸支持细胞激素受体(Ar)特异性敲除小鼠(SCARKO)和Ar全敲除(ARKO)小鼠睾丸中的表达特征。结果 SEPT11基因小鼠出生2周内高表达,随后表达水平降低,出生6周后出现并与未释放的成熟精子共定位且高表达。与野生型小鼠相比,SEPTIN11在SCARKO小鼠和ARKO小鼠睾丸中表达降低(P0.01),m RNA水平显著升高(P0.01);SEPTIN11在成熟精子中定位于尾部。结论 SEPT11基因在小鼠出生时表达最高;SEPTIN11在小鼠成熟精子中定位于尾部;Ar的敲减提高了SEPT11的表达。     

胱蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生基因在小鼠睾丸和附睾中的表达

目的:研究胱蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生(cystatin-related epididymalspermatogenic, Cres)基因在生后不同发育阶段小鼠睾丸及附睾中的表达规律。方法:采用实时荧光定量PCR及间接免疫荧光技术检测Cres mRNA及其蛋白在生后14 d、20 d、22 d、28 d、35 d、49 d、70 d及400 d小鼠睾丸及附睾中的表达变化。结果:在小鼠睾丸中,Cres mRNA在青春期前低水平表达,此后逐渐升高,成年期达到峰值,老年期有所下降;Cres蛋白主要定位于延长精子细胞,免疫染色强度主要取决于生精细胞的发育阶段,而与小鼠的发育阶段无关。在小鼠附睾中,Cres mRNA在青春期前表达量较低,此后逐渐升高,老年期达到峰值;Cres蛋白定位于附睾头部近端上皮细胞及头部中段管腔液和部分上皮细胞中,附睾头部远端及体、尾部均未检测到Cres蛋白。结论:Cres基因在小鼠睾丸和附睾中的表达呈现明显的年龄变化趋势,且其在睾丸和附睾中分别具有阶段特异性表达和区域特异性表达的特点,提示Cres基因可能参与精子发生、成熟过程的调控。这为今后生殖药理学与生殖毒理学的分子水平研究提供了新的线索。     

人与大小鼠精子中精蛋白mRNA的分析

目的 :研究人与大小鼠精子中精蛋白 m RAN存在情况。方法 :应用 RT-PCR法分别从人、大鼠和小鼠精子总 RNA中扩增得到精蛋白 (protamine) c DNA片段。结果 :人、大鼠和小鼠精子中均存在精蛋白基因相应的 m RNA,并发现头部畸形率高的精子中精蛋白 m RNA明显减少。结论 :精子的 m RNA有可能代表精子发生过程中某些基因的表达情况     

uPAR在大鼠睾丸第一精子发生波中的表达变化

目的:探讨uPAR在大鼠精子发生中的作用。方法:取出生后d0、d5、d10、d15、d21、d28、d35、d42、d49、d56SD大鼠睾丸组织,采用实时荧光定量分析法检测各年龄组大鼠尿激酶受体(uPAR)mRNA表达,并用Western印迹法检测各年龄组大鼠uPAR蛋白表达。结果:大鼠睾丸组织uPARmRNA表达与蛋白表达有相似的趋势:刚出生时表达水平较高,后逐渐下降,约在d15达最低,到d28时开始增加,到d35时到达高峰,随后d42下降,之后保持一定的水平。双变量回归相关分析显示,uPARmRNA表达与蛋白表达为中度正相关。结论:大鼠睾丸uPAR表达在第一精子发生波中出现2个高峰,第一高峰在刚出生时,说明uPAR与精子发生的启动有着密切联系。第二高峰是在出生第5周,这说明uPAR可能参与精子排放过程中的组织重塑及精子变态过程。     

锌指蛋白(ZNF)185在小鼠不同发育阶段睾丸中的表达

目的:研究锌指蛋白(ZNF)185在小鼠不同发育阶段睾丸中的表达。方法:从小鼠脑、肝、卵巢和不同发育阶段睾丸组织中提取总RNA,采用半定量RT-PCR法检测ZNF185的表达;制备小鼠不同发育阶段睾丸冰冻切片,应用免疫细胞化学分析法检测ZNF185蛋白的定位。结果:①ZNF185在睾丸中的表达显著高于脑、肝和卵巢组织。②ZNF185在小鼠性成熟前组睾丸中的表达显著低于性成熟期和老年期,而性成熟期和老年期之间差异不显著。③在性成熟前,ZNF185主要定位于睾丸间质细胞和类肌细胞;在性成熟期和老年期小鼠中,ZNF185主要定位于睾丸间质细胞、类肌细胞和精子。结论:ZNF185在小鼠性成熟后睾丸中的表达升高,定位更广泛。     

小鼠Y染色体编码基因mRNA在成熟精子中保留情况的研究

目的:探讨成熟精子中Y染色体编码基因mRNA的保留情况。方法:从小鼠Y染色体长臂和短臂上选择10个重要基因,应用RT-PCR方法分析这些基因在成熟精子、睾丸、雄脑和雌脑中的表达。结果:所选基因在睾丸中均有表达,而成熟精子只有Dby基因表达。结论:成熟精子对所选的10个Y染色体编码基因mRNA选择性地保留,在小鼠成熟精子中仅仅保留了Dby的mRNA。     

小鼠睾丸支持细胞标志蛋白表达的研究

目的:探寻小鼠睾丸支持细胞不同发育阶段和功能状态下的特异性标志蛋白。方法:通过对小鼠睾丸组织进行免疫组织化学染色和实时定量(real-time)RT-PCR,观察受精后16 d胚胎(E16)到出生后6周的雄性小鼠睾丸组织蛋白和m RNA表达。结果:雄激素受体(AR)在出生后1周、2周、6周小鼠的睾丸支持细胞、外周小管肌样细胞、间质细胞细胞核内都有表达,且表达量逐渐增强,但在E16不表达;Wilms肿瘤基因(WT1)在E16、出生后1周、2周、6周的睾丸支持细胞细胞核内表达,但不表达于其它细胞;苗勒氏管抑制素(AMH)在E16、出生后2周的睾丸支持细胞胞质中表达,而在出生后6周不表达;β-链蛋白(β-catenin)和胞质紧密粘连蛋白-1(Zo-1)是血睾屏障特异性蛋白,出生后2周时它们分布于整个曲细精管,而出生后4周时规则地分布于靠近外壁的一圈,此时它们的血睾屏障已经完全建立。Real-time PCR分析睾丸组织m RNA表达,佐证了这些结果。结论:WT1可以作为支持细胞的特异性标志,而AMH则标记不成熟的睾丸支持细胞;AR单独不适合作为睾丸支持细胞的标志物,但与其他标志物结合,可能可区分睾丸支持细胞的成熟与否。而通过β-catenin和Zo-1染色,可以判断血睾屏障是否完全形成,为支持细胞是否成熟提供判断标记。     

小鼠精母细胞在体外分化为精子细胞

目的:探讨未成熟小鼠生精细胞在体外培养条件下的分化情况。方法:用支持细胞(TM4)条件培养液培养出生后14d的BALB/c小鼠睾丸细胞,对照组采用添加1%胎牛血清的MEM培养液维持细胞存活,在不同时段收获细胞,实时定量RT-PCR分析精子细胞特异性基因Tnp2表达的变化。结果:实时定量RT-PCR显示,在体内,Tnp2的表达随小鼠日龄增长而升高,与精子细胞发生过程同步;在睾丸细胞体外培养过程中,Tnp2的表达在TM4条件培养液培养d5显著升高(P<0.05),而对照组始终无变化。结论:在TM4条件培养液的作用下,小鼠精母细胞在体外分化为精子细胞。     

Expression of CCM2 and CCM3 during mouse gonadogenesis

Purpose

Three cerebral cavernous malformation (CCM) proteins, CCM1, CCM2, and CCM3, regulate cell-cell adhesion, cell shape and polarity, and most likely cell adhesion to extracellular matrix. Recently, CCM2 and CCM3 are known to be expressed in control and varicocele-induced rat testes, but little is known about these proteins during gonadogenesis. This led us to study the CCM proteins during the mouse gonadogenesis.

Methods

Neonatal (PND 0), postnatal, and adult mice testes and ovaries were obtained from mice. CCM2 and CCM3 expression were analyzed during mouse testicular and ovarian development by immunohistochemistry and quantitative real-time PCR.

Results

The results showed that in both sexes, Ccm2 and Ccm3 mRNA and protein were first detectable after gonadogenesis when the gonads were well differentiated and remained present until the adult stage. In the testis, CCM2 and CCM3 expression were restricted to the nuclei of Sertoli cells, suggesting a conserved role in testicular differentiation. In the ovary, the CCM2 and CCM3 proteins were localized in the cytoplasm of oocytes, suggesting an unexpected role during oogenesis. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) results showed that expression of Ccm2 and Ccm3 genes could play a role in the regulation of mouse gonadogenesis translational activation upon testicular and ovarian development.

Conclusions

The localization of CCM2 and CCM3 proteins show their different functions for CCM2 and CCM3 which may have important roles in testicular and ovarian differentiation. In conclusion, CCM2 and CCM3 may be involved in establishing the differential expression pattern in developing mouse testis and ovary.     

Isolation and expression analysis of the human RNH2 gene encoding ribonuclease inhibitor 2

Ribonuclease inhibitor 1 (RI-1) is a cytoplasmic protein that inhibits a variety of pancreatic-type mammalian Rnases by forming a very tight, reversible 1:1 complex. Recently a novel gene encoding ribonuclease inhibitor 2, Rnh2 has been isolated in mouse. The expression pattern of the mouse Rnh2 is specific to testis, especially in the spermatogonia. Then it has been suggested that the mouse Rnh2 gene may play critical roles in mouse spermatogenesis. In this study, we isolated the human RNH2 cDNA and analyzed its expression pattern. The human RNH2 is also expressed limited to testis, and then it is suggested that the human Rnh2 gene may also play critical roles in human spermatogenesis.     

Temporal expression of the transgenic human protamine gene cluster

OBJECTIVE: To ascertain the fidelity of expression of the genes from the transgenic human sperm-specific nuclear packaging protamine-1-->protamine-2-->transition protein-2 (PRM1-->PRM2-->TNP2) locus. DESIGN: Controlled human transgene study. SETTING: Basic science laboratory. ANIMAL(S): Age-matched transgenic and nontransgenic mice. INTERVENTION(S): Transgenic mice containing the human protamine locus were mated. One testis from each offspring was frozen at -80 degrees C and the other was preserved in formalin. MAIN OUTCOME MEASURE(S): The temporal expression of the human and mouse protamines was evaluated by Northern blot analysis. Orientation of the transgenic locus was determined by Southern blot analysis. Tissue morphology was assessed histologically. RESULT(S): Conservation of transgenic morphology was confirmed. Head-to-tail integration of the PRM1--> PRM2-->TNP2 locus was shown. Temporal expression of the mouse and human protamine genes was maintained in the transgenic state. CONCLUSION(S): These results show that the head-to-tail concatomer of the PRMI-->PRM2-->TNP2 locus contains all the necessary elements for appropriate temporal expression while maintaining testicular structure and function.     

小鼠胚泡着床相关基因的差减筛选

目的:筛选新的小鼠胚泡着床相关基因。方法:对孕4.5 d小鼠着床和非着床位点的子宫内膜组织进行PCR差减。获得了2个新的在小鼠胚泡着床位点高表达的EST(EST8和EST81)。结果:EST8在孕4.5 d小鼠着床位点、肝脏中表达较高,在非着床位点和卵巢中亦有微量表达。EST81主要在孕4.5 d小鼠子宫着床组织和卵巢中表达,其它各种组织中也有微量表达。用PCR方法获得了相应的全长。cDNA,长度分别为1665bp和1364bp。结论:用差减筛选获得的两种cDNA是孕小鼠着床相关基因,其功能有待进一步研究。