米非司酮通过调节岩藻糖基转移酶IV的表达抑制胚胎体外黏附

目的:探讨米非司酮对人胚胎细胞JAR与人子宫内膜细胞RL95-2之间黏附的影响及其调控的分子机制。方法:采用黏附实验分别观察RU486以及岩藻糖基转移酶IV(FUT4)对JAR细胞与RL95-2细胞之间黏附的影响。采用RT-PCR以及Western blotting检测米非司酮对RL95-2细胞以及流产妇女子宫内膜中FUT4表达的调控。结果:①米非司酮抑制JAR细胞与RL95-2单层细胞之间的黏附;②米非司酮抑制RL95-2细胞以及流产妇女子宫内膜中FUT4基因和蛋白的表达;③FUT4质粒转染RL95-2细胞后,调节JAR细胞与RL95-2单层细胞之间的黏附。结论:米非司酮通过调节FUT4的表达抑制胚胎体外黏附。     

黄芩、白术通过调节岩藻糖基转移酶Ⅳ、Ⅶ的表达促进胚胎体外黏附

目的:探讨黄芩、白术对胚胎体外黏附的影响及其调控的糖分子机制。方法:培养人子宫内膜细胞(RL95-2)和人绒毛膜细胞(JAR),并经米非司酮诱导后建立着床障碍模型。通过黏附实验观察不同浓度黄芩、白术水煎液对胚胎黏附率的影响,采用RT-PCR、Western blotting检测着床相关寡糖合成关键酶的表达变化。结果:黄芩、白术50 mg/L治疗组胚胎黏附率较模型组显著升高(P0.05),着床相关的岩藻糖基转移酶Ⅳ、Ⅶ(FUT4、FUT7)的m RNA及蛋白表达显著增加(P0.001)。结论:中药黄芩、白术可通过上调FUT4、FUT7的表达促进胚胎体外黏附。     

人α1,3-岩藻糖基转移酶VII荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定绿色荧光蛋白为报告基因的pIRES2-EGFP-FUT7真核表达载体。方法:采用RT-PCR方法获得α1,3-岩藻糖基转移酶VII(FUT7)全长基因,克隆至pMD18-TSimple载体后,将FUT7亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体并进行鉴定。通过脂质体转染到子宫内膜RL95-2细胞中,荧光显微镜下观察并经RT-PCR检测FUT7的表达。结果:测序及酶切鉴定证明获得人全长FUT7基因,FUT7基因正确插入pIRES2-EGFP中,在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白在RL95-2细胞中的表达,半定量RT-PCR检测结果显示FUT7的表达明显增加。结论:成功构建了绿色荧光蛋白为报告基因的FUT7真核表达载体,并检测到在RL95-2细胞中的表达,为研究FUT7及其合成的糖抗原sLex在胚胎着床中的作用奠定了基础。     

肝素结合表皮生长因子通过诱导人子宫内膜细胞骨桥蛋白的表达促进人滋养层细胞的体外侵袭

目的:探讨肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)对人子宫内膜细胞RL95-2与人滋养层细胞Be Wo体外黏附和铺展的影响及其作用机制。方法:利用免疫荧光法观察骨桥蛋白(OPN)在RL95-2细胞中的表达定位,采用RT-PCR和Western blotting检测HB-EGF对RL95-2细胞中OPN表达水平的影响,并通过黏附和铺展实验观察HB-EGF对Be Wo球状体细胞在RL95-2单层细胞上侵袭活性的影响。结果:OPN在RL95-2细胞膜表面高表达,HB-EGF能诱导RL95-2细胞中OPN的表达,并促进Be Wo细胞球在RL95-2细胞上的黏附和铺展。结论:HB-EGF可能通过上调子宫内膜细胞膜OPN的表达而促进滋养层细胞的体外侵袭活性。     

sLe~x在小鼠胚泡植入早期子宫内膜中的表达及作用

目的:探讨唾液酸化的路易斯寡糖(sLex)在胚泡植入早期小鼠子宫内膜的表达及作用。方法:①应用免疫组化方法对sLex在小鼠妊娠早期子宫内膜的表达进行定位,免疫印迹法以另一侧为自身对照,检测妊娠d1-5小鼠子宫内膜sLeX的表达情况。②向妊娠小鼠一侧子宫角注射sLeX单克隆抗体,观察其对胚胎着床的影响。结果:妊娠d1-5小鼠子宫内膜组织中,sLeX表达量逐渐增加,在植入窗口期(d4)达高峰;子宫角注射抗体后对胚泡植入有明显的抑制作用。结论:在小鼠胚泡植入早期,sLex参与了胚泡的植入过程,在胚泡和子宫内膜的识别过程中发挥重要的作用。     

骨桥蛋白在肝素结合表皮生长因子样生长因子介导的小鼠胚胎对子宫内膜黏附和扩展中的作用研究

目的:探讨肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)对小鼠胚胎黏附和扩展中的作用机制。方法:建立小鼠胚胎与小鼠子宫内膜细胞共培养模型,分A、B、C、D、E共5组,分别加入不同浓度的HB-EGF(0μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L),于倒置显微镜下统计各组胚胎黏附率及扩展率;用免疫组织化学法检测小鼠子宫内膜细胞骨桥蛋白(OPN)的表达及定位,Western blotting法测定各浓度HB-EGF对子宫内膜细胞OPN表达水平的影响,并分析其与HB-EGF的关联。结果:OPN在小鼠子宫内膜细胞高表达,主要分布于胞质中,随HB-EGF浓度升高,小鼠子宫内膜细胞中OPN的表达增强,小鼠胚胎对子宫内膜的黏附和扩展率也逐渐增高。结论:HBEGF可能通过上调小鼠子宫内膜细胞OPN的表达,促进小鼠胚胎对子宫内膜的黏附和扩展。     

RNA干扰抑制EZH2基因表达对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:利用RNA干扰技术靶向沉默EZH2基因,检测其对子宫内膜癌细胞增殖、迁移能力及上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:实时荧光定量PCR、Western blot检测EZH2在子宫内膜细胞ESC及子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达差异。利用化学技术合成小分子siRNA转染子宫内膜癌细胞,靶向抑制EZH2基因表达。CCK-8、Transwell小室检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2增殖、迁移能力变化。Western blot检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中EMT相关蛋白E-cadherin、α-catenin、N-cadherin和Vimentin的表达变化。结果:(1)EZH2在子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达明显高于子宫内膜细胞ESC(P0.01)。(2)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞增殖、迁移能力降低(P0.01)。(3)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞中上皮标志物E-cadherin和α-catenin的蛋白表达水平上调(P0.05),间质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平下调(P0.01)。结论:EZH2在子宫内膜癌细胞中高表达,siRNA靶向沉默EZH2基因可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化。     

白细胞抑制因子(LIF)对离体小鼠子宫内膜岩藻糖基转移酶(FuT7)表达的影响

目的:探讨白血病抑制因子(LIF)对小鼠子宫内膜细胞岩藻糖基转移酶(FuT7)因子表达的影响。方法:分别用含LIF和抗LIF-抗体(LIF-Ab)培养液孵育子宫内膜细胞10h,通过PCR、免疫荧光和免疫印迹方法分析各组培养液中FuT7因子的表达。结果:PCR结果显示:与空白对照组比,LIF对离体子宫内膜细胞FuT7基因表达有上调作用(0.26±0.02vs0.18±0.01),而LIF-Ab可抑制子宫内膜细胞FuT7的表达(0.14±0.04vs0.18±0.01)。免疫荧光和免疫印迹结果同样显示经LIF孵育后,子宫内膜细胞FuT7蛋白量有所增加。结论:LIF在体外可调控子宫内膜细胞FuT7表达,并有可能借此来调控着床阶段特异表达的sLeX寡糖抗原量,继而影响整个着床调控网络。     

TRAIL在小鼠胚胎着床过程中子宫内膜的表达

目的:检测TRAIL在小鼠胚胎着床过程中子宫内膜的表达,探讨它在蜕膜细胞凋亡中的作 用。方法:采用RT-PCR及免疫组化技术检测妊娠d 1-8小鼠子宫组织TRAILmRNA及蛋白的表 达情况。结果:妊娠d 1-8的小鼠子宫组织均有TRAIL mRNA的表达,且着床期间的表达较着床前 明显增加(P<0．05)。妊娠d 1-3,小鼠子宫内膜无TRAIL蛋白表达;妊娠d 4,TRAIL表达在小鼠胚 胎定位、黏附点的子宫内膜腔上皮细胞;妊娠d 5-6,TRAIL定位于胚胎着床点附近的蜕膜细胞中; 妊娠d 7-8,TRAIL表达在与子宫蜕膜邻近的胚胎滋养层细胞中。结论:在小鼠胚胎着床过程中, TRAIL诱导子宫内膜腔上皮细胞凋亡可能是胚胎跨越上皮屏障的重要机制之一,且TRAIL诱导的 蜕膜细胞和胚胎滋养层细胞的凋亡在滋养层细胞对子宫内膜的适度侵入过程中起重要作用。     

小鼠囊胚在子宫内膜体外共培养模型上着床的超微结构观察

目的:进一步证明已建立的体外着床模型的可行性。方法:将妊娠d4的小鼠囊胚培养在已建立的体外子宫内膜共培养模型上,电镜观察胚胎植入时囊胚与子宫内膜上皮细胞相互关系的超微结构。结果:小鼠囊胚能正常脱透明带、黏附和扩展。扫描电镜见黏附在子宫内膜上的囊胚呈椭圆形或扁平形;胚胎表面具微绒毛;在胚胎与子宫内膜细胞接触点可见胚胎滋养细胞黏附于胞饮突上。透射电镜观察显示,胚胎滋养细胞通过微绒毛黏附于上皮细胞上,有些滋养细胞通过微绒毛开始植入,局部滋养细胞与上皮细胞形成紧密连接。胚胎滋养细胞与上皮细胞间形成许多镶嵌连接。超微结构显示粗面内质网、线粒体、溶酶体和核糖体非常丰富。结论:小鼠囊胚在子宫内膜体外模型上生长发育良好,该胚胎与子宫内膜共培养系统是研究胚胎着床机理的理想体外模型。     

腺病毒介导的PTEN cDNA对子宫内膜癌细胞凋亡的影响

目的研究外源性PTEN cDNA的表达对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。方法用细菌内同源重组法构建含野生型抑癌基因PTEN cDNA的复制缺陷型腺病毒Ad-PTEN,蛋白印迹法鉴定转染Ad-PTEN后,子宫内膜癌细胞系RL95-2细胞中PTEN蛋白的表达。将RL95-2细胞随机分成3组: (1)空白对照组:仅用培养基而不加腺病毒;(2)Ad-CMV组:转染复制缺陷型空载体腺病毒Ad-CMV; (3)Ad-PTEN组:转染复制缺陷型腺病毒Ad-PTEN,前两组均为对照组。采用细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻检测、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)测定及染色体DNA片段化检测这3种方法,从不同角度检测PTEN蛋白的表达对RL95-2细胞凋亡的影响。结果经Ad-PTEN介导的PTEN cDNA能够在RL95-2细胞中持续有效地表达。Ad-PTEN组转染后24、48、72、96 h,RL95-2细胞中细胞膜PS外翻细胞分别占(6．09±1．01)％、(9．98±2．17)％、(11．74±2．65)％、(27．69±8．67)％,各个时间点分别与两个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0．05);RL95-2细胞中活化caspase-3细胞分别占(2．6±0．5)％、(18．0±4．4)％、(21．8±5．1)％、(33．7±9．9)％,各个时间点分别与两个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0．05)。Ad-PTEN转染后48 h,RL95-2细胞中出现特异性的染色体DNA梯状条带。结论腺病毒介导的PTEN cDNA能够有效地在RL95-2细胞中表达,并诱导其凋亡,为子宫内膜癌的基因治疗提供了理论基础。     

Hormonal regulation of galectin 3 in trophoblasts and its effects on endometrium

Previous studies had shown important functions of galectin 3 (Gal-3) in endometrium during embryo implantation, in regulation of endometrial cell proliferation and adhesion by interacting with integrin β3. In this study, we investigated hormonal regulation of Gal-3 in trophoblasts and its extracellular effects on endometrium. We used BeWo and RL95-2 cells as a model of trophoblastic and endometrial epithelial cells, respectively, to create an in vivo model of embryo implantation. Our results indicated that 17β-estradiol (E2), progesterone (P4), and human chorionic gonadotropin (hCG) induced the expression of Gal-3 and promoted its secretion from BeWo cells. The exogenous Gal-3 inhibited cell proliferation and induced apoptosis of endometrial cells (RL95-2 cells) through activation of integrin β1. We further validated the proapoptotic effect of Gal-3 secreted by trophoblastic cell on endometrial cells by culturing RL95-2 cells with Bewo cells and measuring the apoptotic rate. Our analysis provides new insight into the critical roles of Gal-3 in embryo implantation.     

乙酰肝素酶与绒毛膜癌侵袭能力的关系

目的 通过研究乙酰肝素酶（Hpa）在绒毛膜癌高、低侵袭力细胞系及正常早孕绒毛组织中的表达情况,探讨Hpa与绒毛膜癌侵袭能力的关系。方法 通过Matrigel体外侵袭实验检测不同侵袭力绒毛膜癌细胞系JEG-3和JAR的体外侵袭能力;应用免疫细胞化学方法及蛋白印迹法（westem blot）检测Hpa蛋白在不同绒毛膜癌细胞系及正常早孕绒毛组织中的表达,并进行相关性分析。结果 （1）JEG-3细胞的穿膜细胞数[（191±17）个]较JAR细胞的穿膜细胞数[（106±13）个]明显增多,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）Hpa蛋白在绒毛膜癌细胞JEG-3、JAR中均有表达,且主要定位于细胞质。（3）在正常早孕绒毛组织、JEG-3细胞和JAR细胞中均可检测到Hpa蛋白,JEG-3细胞中Hpa蛋白的表达量（1．560±0．180）明显高于JAR细胞Hpa蛋白的表达量（0．610±0．170）,绒毛膜癌细胞系中Hpa蛋白的表达量又显著高于正常早孕绒毛组织Hpa蛋白的表达量（0．190±0．008）,两两比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（4）相关性分析显示,Hpa蛋白的表达量与绒毛膜癌细胞体外侵袭能力呈正相关关系（r=0．89,P〈0．05）。结论 Hpa蛋白在绒毛膜癌细胞中表达较正常绒毛组织高;Hpa蛋白在滋养细胞中的表达随滋养细胞侵袭能力的增加其表达上调;滋养细胞产生过量的Hpa对基底膜蛋白的水解作用在绒毛膜癌的侵袭、转移中发挥重要作用。     

核苷酸还原酶小亚基反义寡核苷酸对人绒毛膜癌细胞体外生长的影响

目的　探讨核苷酸还原酶小亚基 (RRM2 )反义寡核苷酸 (ASODN)对人绒毛膜癌细胞株JAR细胞体外生长的影响。方法　以脂质体为载体 ,将人工合成的分别位于RRM2mRNA核苷酸序列第 6 2 6～ 6 4 5 (编码区 )和第 15 72～ 15 91(3′端非编码区 )位点且全程硫代修饰的两条ASODN片断 (前者称ASODN1,后者称ASODN2 )导入JAR细胞中 ,用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法检测细胞存活率 ,免疫印迹法和RT PCR技术检测ASODN对RRM2蛋白和mRNA表达的影响。结果　 (1)ASODN1对JAR细胞的抑制作用呈剂量和时间效应 :10 0nmol/LASODN1作用后JAR细胞的生长抑制率为 (8 10±1 18) % ;随着ASODN1浓度的增加细胞生长抑制作用增强 ,ASODN1浓度为 4 0 0nmol/L时其细胞生长抑制率为 (2 7 70± 3 6 8) % ,与ASODN1浓度为 0时 [(0 16± 0 12 ) % ]比较 ,差异有极显著性 (P =0 0 0 0 )。 2 0 0nmol/LASODN1作用 2 4h后 ,细胞生长抑制率为 (13 98± 1 4 5 ) % ;4 8h[为 (18 90±4 85 ) % ]达到高峰 ,72h抑制作用 [为 (19 5 3± 5 0 0 ) % ]不再明显增强 ,分别与作用时间为 0时 [(0 16± 0 31) % ]比较 ,差异均有极显著性 (P =0 0 0 0 )。 (2 )JAR细胞RRM2蛋白和mRNA的表达 :2 0 0nmol/LASODN1作用 12h ,RRM2蛋白和mRNA表达水平开始下降