着床丝氨酸蛋白酶-2(ISP2)蛋白在小鼠卵子和早胚组织中的表达及其定位

目的:了解ISP2蛋白在小鼠卵细胞和早胚组织中的表达情况。方法:收集小鼠未成熟卵、成熟卵、受精卵和着床前胚泡,利用特异性抗ISP2抗体,采用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术对ISP2在卵细胞和早期胚胎组织中的表达模式以及亚细胞定位进行检测分析。结果:在小鼠未受精卵、受精卵和着床前胚泡中均能检测到特异的ISP2蛋白信号;通过激光共聚焦显微镜观察到ISP2在细胞膜上的信号强于其在细胞质。结论:ISP2蛋白在小鼠卵子和早胚组织中均有表达,并主要分布在细胞膜上。     

激光共聚焦显微镜观察小鼠卵母细胞及早期胚胎中微丝的分布

目的:观察微丝在小鼠卵细胞及早期胚胎中的分布情况,为进一步明确微丝在受精卵发育中的作用机制打下基础。方法:采用免疫荧光化学法结合激光共聚焦显微技术对卵细胞的微丝分布进行观察。结果:在小鼠MII期卵母细胞中微丝分布于卵细胞的皮质区,集中在纺锤体处。在小鼠1-细胞期受精卵中微丝集中分布于卵细胞与极体的连接处。在2-细胞期受精卵中的微丝则集中分布在卵细胞的分裂沟处。用松弛素B(CB)解聚小鼠体内受精卵的微丝,细胞形态及分裂受到严重影响。结论:微丝在小鼠卵母细胞及早期胚胎中有着独特的分布,其可能参与多种功能。     

水通道蛋白3在小鼠早期胚胎发育过程中的表达

目的 了解水通道蛋白3(aquaporin3,AQP3)在小鼠早期胚胎发育中的表达分布情况.方法 建立昆明小鼠控制性超排卵模型,收集小鼠四细胞期、八细胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚,采用免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜对AQP3在小鼠早期胚胎中的表达模式及亚细胞定位进行检测分析.结果 在小鼠早期胚胎的4个时期中均能检测到特异性AQP3荧光信号,激光共聚焦显微镜观察到AQP3的分布部位在各时期不完全相同,在四细胞期胚胎及八细胞期胚胎主要定位于卵裂球核膜,桑葚期胚胎主要定位于细胞膜,而早期囊胚主要定位于滋养层细胞膜及细胞质.结论 AQP3对小鼠早期胚胎的发育可能具有潜在的调控作用.     

14-3-3蛋白在小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中的表达与定位

目的:研究小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中14-3-3蛋白的表达及亚细胞定位。方法:采用Western blot方法鉴定小鼠受精卵和2-细胞期胚胎14-3-3蛋白的表达,利用间接免疫荧光技术观察其在细胞中的定位。结果:在小鼠受精卵和2-细胞期胚胎中,全部表达14-3-3蛋白,并且为同一亚型;14-3-3蛋白主要定位于受精卵的细胞质及2-细胞期胚胎中的细胞质和细胞核。结论:14-3-3蛋白正常表达于小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中,其定位可能影响胚胎的早期发育。     

Notch信号通路在小鼠卵巢皮层组织的表达变化

目的:探索Notch信号通路在调控卵巢生殖干细胞增殖和衰老中的作用。方法:分别提取3日龄、2月龄、12月龄及20月龄小鼠卵巢总RNA,q PCR法和免疫组织化学法分别检测Notch通路信号分子受体Notch1及靶基因Hes1、Hes5,生殖细胞标志基因Mvh、胚胎干细胞标志物Oct4的m RNA及蛋白的表达情况。双免疫荧光检测卵巢皮质层中Mvh和Notch1的共表达情况。结果:Notch1、Hes1、Hes5、Mvh及Oct4这5个基因的m RNA表达水平随着小鼠生殖年龄增长呈现由高到低的一致性动态变化;Notch1、Jagged1(Notch1配体)及Hes1的蛋白表达水平随着鼠龄增长逐渐减弱;双免疫荧光结果显示Mvh和Notch1共表达趋势随着鼠龄增长而减弱。结论:Notch信号通路活性在小鼠卵巢组织及卵巢上皮组织中的表达随着鼠龄的增长而逐渐减弱,与对应的生殖干细胞标志基因的表达水平呈现一致性,Notch信号通路参与卵巢生殖干细胞增殖的调控。     

促血管生成素-1,-2基因在小鼠着床期子宫内膜的表达

目的:检查Ang-1/-2蛋白在小鼠胚胎着床期子宫内膜的分布及mRNA的表达,以研究Ang-1/-2基因在胚胎着床过程中所起的作用和生物学意义。方法:取D2,D4,D6和D8昆明种小鼠子宫内(蜕)膜,分别用免疫组织化学S-P法和原位杂交技术,检查着床期子宫内膜中Ang-1/-2蛋白的表达及其mRNA的转录水平。并用计算机图像分析技术检测不同时期子宫内膜中Ang-1/-2表达的平均光密度值。结果:免疫组化显示,Ang-1蛋白在基质细胞、上皮细胞和血管壁中表达,而Ang-2蛋白则在腺上皮细胞及基质细胞中表达,两者随着妊娠天数的增加而表达增强(P<0·01)。原位杂交显示,Ang-1mRNA自D2起即表达于基质细胞中,D4血管壁胞浆中也出现阳性表达;而Ang-2mRNA自D2起则表达于基质细胞和腺上皮,D4血管壁胞浆中也出现阳性表达。Ang-1/-2mR-NA表达强度在D6,D8逐渐增加。平均光密度值差异有显著性(P<0·01)。结论:Ang-1/-2基因在小鼠胚胎着床期血管新生和血管重塑过程中起重要作用,从而有助于囊胚成功着床。     

Emx2和Emx2OS在小鼠胚胎生殖嵴中的表达

目的:探讨转录因子Emx2和Emx2反义非编码长链RNA(EMX2 opposite strand/antisense RNA,Emx2OS)在小鼠生殖嵴发育过程中的表达模式以及对原始生殖细胞发育的作用。方法:分别收集孕11.5~14.5 d小鼠的生殖嵴,通过原位杂交、qRT-PCR和免疫荧光方法,观察分析Emx2和Emx2OS在生殖嵴中的表达定位及其表达水平的变化。结果:在孕11.5~14.5 d雌性和雄性小鼠胚胎生殖嵴中均检测到Emx2OS的表达,而且其表达模式与Emx2高度一致;在小鼠胚胎原始生殖细胞减数分裂的启动以及性别决定的时间点(孕12.5 d),雌性胎小鼠生殖嵴中Emx2和Emx2OS的表达量都显著上调(P0.001)。结论:Emx2和Emx2OS在胎小鼠生殖嵴中呈同步表达模式,并可能参与调控原始生殖细胞减数分裂的启动。     

骨形态发生蛋白4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制

目的:探讨骨形态发生蛋白4(BMP4)/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制。方法:取3日龄昆明雌性小鼠卵巢体外培养,添加重组BMP4,并以不添加BMP4为对照,采用HE染色和TUNEL法,检测BMP4在原始卵泡存活和发育中的作用;采用免疫组织化学、Westernblotting与RT-PCR检测BMP4对原始卵泡中p-Smad1/5/8、sohlh2及c-kit表达的影响。结果:①BMP4组卵巢直径明显变大(1.17±0.24 mm vs 0.65±0.13 mm,P<0.05),原始卵泡数(45.3±4.2枚)明显低于对照组(55.0±5.0枚)(P<0.05),而初级卵泡的数(25.3±2.5枚)明显多于对照组(19.0±1.0枚)(P<0.05)。②TUNEL结果显示BMP4组凋亡卵母细胞比例明显低于对照组(P<0.05)。③免疫组织化学、Western blotting与RT-PCR结果显示,与对照组相比,BMP4组原始卵泡卵母细胞中p-Smad 1/5/8、Sohlh2及C-kit的表达均显著升高(P<0.01)。结论:BMP4/Smad信号通路可促进小鼠原始卵泡向初级卵泡转变,并抑制卵母细胞的凋亡;其可能通过上调Sohlh2及C-kit基因的表达而发挥作用。     

14-3-3蛋白在小鼠受精卯及2-细胞期胚胎中的表达与定位

目的：研究小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中14-3-3蛋白的表达及亚细胞定位。方法：采用Western blot方法鉴定小鼠受精卵和2-细胞期胚胎14-3-3蛋白的表达，利用间接免疫荧光技术观察其在细胞中的定位。结果：在小鼠受精卵和2-细胞期胚胎中，全部表达14-3-3蛋白，并且为同一亚型：14-3-3蛋白主要定位于受精卵的细胞质及2-细胞期胚胎中的细胞质和细胞核。结论：14-3-3蛋白正常表达于小鼠受精卵及2-细胞期胚胎中，其定位可能影响胚胎的早期发育。     

锌指转录因子Slug在早孕小鼠子宫内膜的表达

目的:初步探讨锌指转录因子Slug在早孕小鼠胚胎植入过程中的作用。方法:用RT-PCR和免疫组织化学方法分别检测未孕及妊娠1-7d小鼠子宫内膜Slug在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果:RT-PCR半定量结果显示,早孕小鼠子宫内膜组织Slug的表达高于未孕小鼠子宫内膜组织,且随着妊娠天数的增加呈现逐渐增加的趋势,到妊娠4d达最高。进一步通过免疫组化也显示小鼠子宫内膜有Slug蛋白表达,且其表达规律与RT-PCR结果基本一致。结论:Slug在妊娠早期子宫内膜持续表达,可能参与了胚泡植入过程。     

Downregulation of gene expression and activity of GRIM-19 affects mouse oocyte viability,maturation, embryo development and implantation

PurposeTo investigate the expression of GRIM-19 (Gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19) in mouse oocytes and preimplantation embryos, and to study the effect of GRIM-19 on the developmental competence of mouse oocytes and embryos.MethodsGRIM-19 was evaluated at both mRNA and protein levels. The expression of GRIM-19 gene was downregulated in mouse oocytes cultured in vitro by specific small interfering RNA (siRNA) injection, while the activity of GRIM-19 was decreased by microinjection of a GRIM-19 antibody into the cytoplasm of germinal vesicle (GV) oocytes. Oocytes matured in vitro were then fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), followed by observation and evaluation of fertilization rate, cleavage rate, blastocyst formation rate and implantation rate.ResultsGRIM-19 is expressed throughout oocyte maturation and preimplantation embryo development stages. GRIM-19 was localized primarily in the cytoplasm of all cells examined. Downregulation of gene expression and activity of GRIM-19 resulted in decreased oocyte viability, potency of oocyte maturation, embryo development and implantation.ConclusionsGRIM-19 may play important roles in mouse oogenesis and early embryonic development and implantation.     

Isolation of the human <Emphasis Type="Italic">ePAB</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">ePABP2</Emphasis> cDNAs and analysis of the expression patterns

Purpose  Identification of the unique genes playing critical roles in human embryo cleavage. Methods  Isolation of human ePAB cDNA using human ovary cDNA libraries and mouse ePAB amino acid sequences, followed by analysis of its expression pattern in various adult tissues and stages during early oocyte development excluding ePABP2. Results  Human ePAB encodes a 330-aa protein and is located on chromosome 20q12-q13.1. The amino acid sequence is 72% homologous with that of mouse ePab. Human ePAB has only three RRMs and lacks a PABP domain; the expression pattern is nonspecific in adult tissues and detected in all stages, from oocyte to blastocyst. Human ePABP2 encodes a 282-aa protein and is located on chromosome 16q24.3. The amino acid sequence is 68% homologous with mouse ePabp2. Conclusions  We identified human ePAB and ePABP2 cDNA. Human ePAB cDNA is not expressed specific to the ovary. Biological discrepancies exist between the human and the mouse. Capsule   We successfully isolated the human ePAB and ePABP2 cDNAs and analyzed the expression patterns in humans.     

卵泡液中白血病抑制因子(LIF)和血清中E_2在早期胚胎发育中的作用

目的:阐述卵泡液中白血病抑制因子(LIF)和血清中E2在早期胚胎发育中的作用。方法:利用临床62例控制性超促排卵(COH)IVF-ET患者治疗过程中测定的血清E2数据和取卵时收集到的卵泡液,采用ELISA法测定卵泡液中LIF含量,分析LIF在取卵日不同E2组中的差异,并进一步分析其在卵母细胞、胚胎发育中的作用。结果:LIF在E2=1500-4000pg/ml组最高,在E2<1500pg/ml组中表达最低;在不同年龄组表达无差异。LIF<15pmol/L和≥15pmol/L组间受精率、可用胚胎率均存在显著性差异。LIF浓度与受精率、可用胚胎率成正相关。结论:受精率及早期胚胎的质量可能与卵泡液中LIF含量有关。卵泡液中LIF的浓度受周围血E2的影响;合适的E2浓度有利于卵泡液中LIF的提高。     

AP-1蛋白在胚胎着床前后小鼠子宫内膜的表达

目的 :研究子宫内膜原癌基因AP 1蛋白在小鼠胚胎着床前后的动态变化 ,了解AP 1在胚泡着床中的作用。方法 :采用Immuno blot和Western blot方法检测AP 1蛋白的表达。结果 :AP 1蛋白的表达高峰出现在小鼠早孕的第 4天、第 5天 ,一直维持到妊娠第 7天 ,每毫克组织的积分光密度值分别为 6 0 .2± 4 .2 1,5 2 .6± 7.0 9,5 0 .2± 5 .89和 5 0 .0±3.6 1。结论 :AP 1蛋白参与了胚胎着床过程中的信号传导并可能与胚胎的早期分化有关。     

T淋巴瘤侵袭与转移诱导因子1在早孕小鼠蜕膜的表达动态过程

目的:探讨T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T-lymphoma invasion and metastasisi nducing proteinI,Tiam1)在早孕小鼠子宫内膜中的表达规律。方法:采用RT-PCR和Western blotting方法分别检测早孕小鼠子宫内膜中Tiam1mRNA和蛋白的表达水平。结果:①Tiam1mRNA的表达量随妊娠天数的增加逐渐增高,到妊娠第5日表达量达到峰值,于妊娠第6日、第7日开始逐渐降低;②Tiam1蛋白表达与其mRNA表达规律基本一致。结论:Tiam1在妊娠早期子宫内膜中持续表达,可能参与小鼠胚胎植入过程。     

Survivin在早孕小鼠子宫内膜中的表达

目的:探讨Survivin在早孕小鼠子宫内膜中的动态表达及在胚胎着床中的作用。方法:用FQ-PCR及免疫组化方法分别检测未孕及妊娠d2-7各组小鼠子宫内膜Survivin基因和蛋白的表达。结果:FQ-PCR检测妊娠组Survivin mRNA的表达明显高于未孕组(P<0.01),并且随着妊娠天数的增加子宫内膜Survivin mRNA的表达逐渐增加,到孕d6达到高峰,随后下降,但孕d7仍明显高于未孕组(P<0.01)。免疫组化检测Survivin蛋白在子宫内膜的表达规律与FQ-PCR结果一致。结论:早孕小鼠子宫内膜着床期Survivin mRNA和蛋白均高表达,然后下降,提示Survivin可能通过抗细胞凋亡,促细胞增殖和血管形成的作用,参与胚胎着床。