导致高水平氨基糖苷类抗生素耐药的新型16S rRNA甲基化酶研究进展

氨基糖苷类抗生素通过与细菌30S核糖体的16S rRNA亚单位结合，导致读码错误，干扰蛋白合成从而阻止细菌生长。氨基糖苷类抗生素作为一类高效、广谱的抗生素，因其具有浓度依赖性的快速杀菌、可与细胞壁活性抗菌药物产生协同作用的特点，一直是临床上治疗革兰阴性菌所致严重感染的重要药物。但是随着该类药物在临床上的广泛应用，     

16S rRNA甲基化酶导致的氨基糖苷类抗生素高水平耐药研究进展

16S rRNA甲基化酶能够造成对包括阿贝卡星在内的所有氨基糖苷类抗生素耐药,并且为高水平耐药。自2003年在革兰阴性杆菌临床分离株中发现第一个质粒介导的16S rRNA甲基化酶ArmA以来,已发现7种质粒介导的16S rRNA甲基化酶,包括ArmA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、RmtE和NpmA。16S rRNA甲基化酶基因通常和ESBL基因位于同一可转移的质粒上,造成多重耐药。世界各地在革兰阴性杆菌临床分离株中检测出16S rRNA甲基化酶,而我国分离的临床分离株中只检测出ArmA和RmtB。16S rRNA甲基化酶是导致革兰阴性杆菌临床分离株对氨基糖苷类药物高水平耐药的主要原因。     

鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的分布与耐药性分析

目的分析湖北省肿瘤医院临床分离鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性,并研究其16S rRNA甲基化酶基因arm A和rmt B的分布。方法收集该院2009年3月—2010年5月临床分离的鲍曼不动杆菌,采用K-B法进行药敏试验,用PCR法筛选16S rRNA甲基化酶基因arm A、rmt B,并对阳性标本进行测序。结果 56株鲍曼不动杆菌中arm A基因阳性21株(37.5%),未检出rmt B基因菌株。arm A基因阴性菌株对氨基糖苷类抗生素的耐药率显著低于arm A基因阳性菌株。结论近年来该院鲍曼不动杆菌分离率逐年增高。16S rRNA甲基化酶基因arm A在鲍曼不动杆菌广泛存在,且对多种抗生素耐药,应引起临床医师高度关注。     

16S rRNA甲基化酶导致的氨基糖苷类抗生素高水平耐药研究进展

16S rRNA甲基化酶能够造成对包括阿贝卡星在内的所有氨基糖苷类抗生素耐药,并且为高水平耐药。自2003年在革兰阴性杆菌临床分离株中发现第一个质粒介导的16S rRNA甲基化酶ArmA以来,已发现7种质粒介导的16S rRNA甲基化酶,包括ArmA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、RmtE和NpmA。16S rRNA甲基化酶基因通常和ESBL基因位于同一可转移的质粒上,造成多重耐药。世界各地在革兰阴性杆菌临床分离株中检测出16S rRNA甲基化酶,而我国分离的临床分离株中只检测出ArmA和RmtB。16S rRNA甲基化酶是导致革兰阴性杆菌临床分离株对氨基糖苷类药物高水平耐药的主要原因。     

整合子介导的大肠埃希菌临床菌株多重耐药研究

目的　了解大肠埃希菌多重耐药菌株中 1、2类整合酶基因的携带情况,研究整合子与抗生素多重耐药的相关性。方法　对 102株大肠埃希菌临床分离株做药物敏感性分析和整合子的PCR基因检测。结果　102株大肠埃希菌对 11种抗生素的耐药率为:氨苄青霉素(94% )、庆大霉素 ( 88% )、环丙沙星 ( 88% )、阿莫西林 /克拉维酸 ( 70% )、头孢唑啉 ( 62% )、头孢他啶(50% )、哌拉西林(41% )、哌拉西林 /他唑巴坦(38% )、头孢哌酮 /舒巴坦(29% )、丁胺卡那 (24% )和泰能 (2% )。102株大肠埃希菌中 51%找到不同插入大小的整合子,插入基因盒大小范围是 650bp到 2 600bp;intⅠ1整合酶基因检出率为 85%,PCR扩增出 280bp大小的intⅠ1基因片段,而未检测到intⅠ2整合酶基因。结论　1类整合子在大肠埃希菌多重耐药菌株中最常见,整合子的存在与细菌的多重抗生素耐药有密切关系。     

整合子与大肠埃希菌耐药性的相关性研究

目的调查大肠埃希菌中Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子的存在情况,分析细菌携带的整合子与大肠埃希菌耐药性的关系。方法测定87株大肠埃希菌对抗菌药物的敏感性;应用简并引物聚合酶链反应（PCR）方法,同时扩增整合子5′保守区的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因,对阳性PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ作限制片段长度多态性（RFLP）分析进行整合子分类。结果 30株大肠埃希菌检测出Ⅰ类整合子,未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合子阳性菌株对抗菌药物的耐药率普遍比整合子阴性菌株高。结论大肠埃希菌临床分离株的耐药性强,细菌的多重耐药与Ⅰ类整合子相关。     

大肠埃希菌耐药性分析

目的：了解大肠埃希菌对常用抗生素的耐药性以及不同来源大肠埃希菌耐药性的差异，以指导临床合理用药。方法：应用WHONET5分析我院2000年1月-2002年7月临床分离的430株大肠埃希菌的药敏结果。结果：大肠埃希菌对氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林-克拉维酸、复方磺胺甲嗯唑、环丙沙星、庆大霉素、头孢唑啉和头孢呋辛的耐药率分别为87％、78％、80％、67％、65％、53％、55％和42％；对头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶和氨曲南的耐药率分别为23％、18％、4％和18％；对哌拉西林-三唑巴坦、头孢吡肟、头孢西丁、亚胺培南、阿米卡星和呋喃妥因的耐药率分别为22％、15％、22％、0、15％和20％。痰液标本中的大肠埃希菌耐药率显著高于其他各类标本中分离者。结论：大肠埃希菌对青霉素类、磺胺类、喹诺酮类和庆大霉素，第一代、第二代头孢菌素等均已高度耐药，临床不宜选用；哌拉西林-三唑巴坦、第四代头孢菌素、头霉素类、碳青霉烯类、阿米卡星和呋喃类耐药率较低，临床可选用；不同来源的大肠埃希菌耐药率存在差异，痰标本中细菌耐药率最高，其余无明显差别。     

产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌中整合子的检测

目的探讨大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶对抗生素的耐药情况,以及整合子的存在状况,为临床合理用药提供依据。方法收集河南省人民医院临床分离大肠埃希菌,对头孢西丁耐药株以酶提取物改良三维试验筛选高产AmpC酶株;多重PCR和DNA测序分析质粒AmpC基因型;用PCR-限制片段长度多态性（RFLP）初筛整合子并分型,PCR扩增整合子的可变区并测序。结果 126株大肠埃希菌中,检出产质粒介导AmpC酶14株（26.9%）,对筛出的耐药菌株采用琼脂对倍稀释法检测耐药性;多重PCR扩增分析示：其基因型均为CMY-2型。8株耐药菌株检出1类整合子,序列分析显示存在aadA4、aadA5、aadB、cm lA、cm lA1、和dfr17基因盒,它们分别介导对氨基糖苷类抗生素、氯霉素和甲氧苄明的耐药。结论治疗产质粒介导AmpC酶的细菌感染时,应以第四代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素为首选。我院大肠埃希菌临床分离株产质粒介导AmpC率较高,其基因型为CMY-2型,而相关耐药基因盒并未位于整合子上。     

16S rRNA甲基化酶在氨基糖苷类抗生素耐药革兰阴性菌中的分布

目的了解6种编码16SrRNA甲基化酶的基因在氨基糖苷类抗生素耐药革兰阴性菌中的流行情况。方法收集本院2007年10～12月分离的211株阿米卡星和庆大霉素耐药革兰阴性菌,采用PCR检测其中6种甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA）的分布。对16SrRNA甲基化酶基因阳性的菌株,用ERIC-PCR进行同源性分析。结果211株阿米卡星和庆大霉素耐药革兰阴性菌中,91．5％（193／211）被检出16SrRNA甲基化酶基因,其中133株含armA（133／211,63．0％）,60株含rmtB（60／211,28．4%）。阿米卡星MIC≥512mg／L、庆大霉素MIC≥128mg／L的104株肠杆菌科细菌中,甲基化酶基因检出达100％,且armA和rmtB的检出相仿（分别为49与55株）。阿米卡星MIC≥512mg／L、庆大霉素MIC≥128mg／L的94株铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中,甲基化酶检出94．7％（89株）,以armA（84株）为主。未检测到rmtA,rmtC,rmtD和npmA基因。ERIC-PCR结果显示该类基因并非单克隆传播。结论几乎所有临床分离的阿米卡星MIC〉512mg／L的革兰阴性菌中都能检出armA或rmtB基因。     

多重耐药大肠埃希菌中I类整合子的研究

目的分析多重耐药大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的流行情况和分子特性。方法对81株多重耐药大肠埃希菌用PCR法扩增细菌总DNA上的Ⅰ类整合子，对大小相同的Ⅰ类整合子进行酶切分析，对纯化后的Ⅰ类整合子作DNA测序，将DNA序列在GenBank中搜索，确定Ⅰ类整合子可变区基因盒的种类和排列。结果在48株（59．3％）细菌的总DNA上检测到Ⅰ类整合子，Ⅰ类整合子的大小约为600～3000bp，48株细菌各含1～2个Ⅰ类整合子，大小相同的Ⅰ类整合子有相同的酶切图谱，整合子中最常见的基因盒为dfr17（甲氧苄啶耐药基因）、aadA5（链霉素、大观霉素耐药基因），最主要的基因盒排列为dfr17-aadA5。结论整合子在多重耐药大肠埃希菌中广泛流行，整合子是介导细菌多重耐药性的重要分子机制。     

阴沟肠杆菌16SrRNA甲基化酶基因分布

目的：了解湖南邵阳地区耐氨基糖苷类抗菌药物的阴沟肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因分布特点及其与氨基糖苷类抗菌药物耐药性的关系。方法收集2012年8月至2014年5月邵阳地区新宁县人民医院、武岗市人民医院、邵阳县人民医院和邵阳医学高等专科学校附属医院临床样本中分离的241株阴沟肠杆菌,采用API20E进行菌种鉴定,同时用纸片扩散法进行体外药物敏感性试验。采用聚合酶链反应（ PCR）进行armA、npmA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD基因检测,分析耐药基因与耐药表型的关系。结果241株阴沟肠杆菌中200株对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素和奈替米星4种氨基糖苷类抗菌药物耐药,其耐药率分别为41．9％、68．5％、70．1％和63．5％。基因检测结果提示,241株阴沟肠杆菌检出2种16S rRNA甲基化酶基因,分别为armA（96株,39．8％）和rmtB（17株,7．1％）,未检出npmA、rmtA、rmtC和rmtD基因。结论16S rRNA甲基化酶与氨基糖苷类抗菌药物的耐药性有相关性。不同地区分离的对氨基糖苷类药物耐药的阴沟肠杆菌菌株携带16S rRNA甲基化酶的基因型有一定差异,湖南邵阳地区阴沟肠杆菌以携带armA基因为主。     

革兰阴性菌中16SrRNA甲基化酶基因的检测

目的 了解大连2所医院临床分离革兰阴性菌中介导高水平氨基糖苷类抗生素耐药的16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtB的流行情况,并研究其耐药机制.方法 收集临床分离的耐阿米卡星的革兰阴性杆菌134株.PCR法筛选2种甲基化酶基因armA及rmtB;PCR产物进行测序.质粒提取、接合试验及转化试验确定armA及rmtB基因定位.琼脂稀释法测定阳性菌株、结合子和转化产物对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素3种氨基糖苷抗生素的MIC值.结果 134株耐药菌株中,21株鲍曼不动杆菌检出armA基因,5株大肠埃希菌和5株肺炎克雷伯菌检出rmtB基因.质粒抽提试验及接合试验rmtB阳性菌获得成功.接合子及转化产物DH5a(pMDarmA)均获得高水平耐氨基糖苷类抗生素的特性. 结论 大连2所医院检测到16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB阳性菌株.armA基因存在于鲍曼不动杆菌中;rmtB基因位于大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的质粒上.armA和rmtB可以导致细菌对氨基糖苷类抗生素的高水平耐药.     

16SrRNA甲基化酶基因在产ESBLs肠杆菌科细菌中的分布

目的了解临床分离的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的革兰阴性肠杆菌科细菌中16SrRNA甲基化酶基因的分布情况。方法对临床分离的70株革兰阴性肠杆菌科细菌用VITEK．32型全自动微生物分析系统进行细菌鉴定,用纸片扩散法检测ESBLs,并用聚合酶链反应（PCR）检测armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA6种16SrRNA甲基化酶基因,对检测的阳性产物进行测序,并通过GenBank比对DNA序列。结果70株产ESBLs革兰阴性肠杆菌中,9株16SrRNA甲基化酶基因阳性,其中5株检出armA基因,4株检出rmtB基因,2株同时检出armA和rmtB基因,rmtA、rmtC、rmtD、npmA4种基因扩增均为阴性。结论不同地区医院16SrRNA甲基化酶基因的分布情况各不相同。     

革兰阴性杆菌16S rRNA甲基化酶基因检测及作用研究

目的分析上海中医药大学附属普陀医院临床分离的革兰阴性杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行情况及革兰阴性杆菌的氨基糖苷类耐药机制。方法收集临床分离的对阿米卡星和/或庆大霉素耐药的革兰阴性杆菌53株。采用聚合酶链反应（PCR）法检测16S rRNA甲基化酶基因：armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA;PCR阳性产物测序分析。构建PET32-armA和PET32-rmtB的重组质粒并转化入宿主菌BL21中。纸片扩散法（K-B）检测临床分离16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株和重组菌对5种氨基糖苷类药物的敏感性。结果 53株耐药菌中5株鲍曼不动杆菌、2株肺炎克雷伯和1株阴沟肠杆菌检出armA基因,2株大肠埃希菌检出rmtB基因。获得PET32-armA和PET32-rmtB的重组BL21菌株。PET32-armA和PET32-rmtB的重组菌均获得氨基糖苷类抗菌药物耐药性。结论本院临床样本检测到16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB阳性菌株,armA基因存在于鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌中;rmtB基因位于大肠埃希菌中。将armA和rmtB基因转入非耐药的宿主菌中可以诱导其对氨基糖苷类抗菌药物的耐药。     

Loop-mediated isothermal amplification assay for 16S rRNA methylase genes in Gram-negative bacteria

Using the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method, we developed a rapid assay for detection of 16S rRNA methylase genes (rmtA, rmtB, and armA), and investigated 16S rRNA methylase-producing strains among clinical isolates. Primer Explorer V3 software was used to design the LAMP primers. LAMP primers were prepared for each gene, including two outer primers (F3 and B3), two inner primers (FIP and BIP), and two loop primers (LF and LB). Detection was performed with the Loopamp DNA amplification kit. For all three genes (rmtA, rmtB, and armA), 10² copies/tube could be detected with a reaction time of 60 min. When nine bacterial species (65 strains saved in National Institute of Infectious Diseases) were tested, which had been confirmed to possess rmtA, rmtB, or armA by PCR and DNA sequencing, the genes were detected correctly in these bacteria with no false negative or false positive results. Among 8447 clinical isolates isolated at 36 medical institutions, the LAMP method was conducted for 191 strains that were resistant to aminoglycosides based on the results of antimicrobial susceptibility tests. Eight strains were found to produce 16S rRNA methylase (0.09%), with rmtB being identified in three strains (0.06%) of 4929 isolates of Enterobacteriaceae, rmtA in three strains (0.10%) of 3284 isolates of Pseudomonas aeruginosa, and armA in two strains (0.85%) of 234 isolates of Acinetobacter spp. At present, the incidence of strains possessing 16S rRNA methylase genes is very low in Japan. However, when Gram-negative bacteria showing high resistance to aminoglycosides are isolated by clinical laboratories, it seems very important to investigate the status of 16S rRNA methylase gene-harboring bacilli and monitor their trends among Japanese clinical settings.     

介导氨基糖苷类高水平耐药16SrRNA甲基化酶armA基因的基因环境分析

目的探讨介导氨基糖苷类高水平耐药基因armA在不同种属中的基因环境。方法 BLASTN比对分析GenBank数据库中armA基因所处的基因环境。分析armA基因分布的种属、地域及其侧翼序列特征。结果所有的armA基因均位于插入序列ISCR1的下游。armA基因在肠杆菌科细菌中广泛检出,在肠杆菌科细菌中其侧翼序列结构保守。结论不同国家、地区,不同菌属中报道的armA基因环境有极大的相似性。     

Emergence of 16S rRNA methylase gene armA and cocarriage of bla(IMP-1) in Pseudomonas aeruginosa isolates from South Korea

Of the 100 multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from a Korean hospital, 14 isolates that were resistant to all aminoglycosides tested carried 16S rRNA methylase gene armA. Fourteen armA-positive isolates were classified into 8 pulsotypes. Seven armA-positive isolates cocarried bla(IMP-1). This study is the first report of occurrence of armA in P. aeruginosa.     

16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

目的比较细菌16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用。方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16SrRNA、16S-23SrRNA基因进行PCR扩增。扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心（NCBI）上进行比对分析,确定菌种。结果在所分析的19种临床血流感染常见细菌中,16SrRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA成功鉴定17种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平。结论16S-23SrRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标。     

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株（共9种4组）分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株（共41种）分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。