杀伤细胞及相关免疫细胞在血液系统恶性肿瘤应用研究

过继性免疫细胞治疗是生物治疗的一种,应用的效应细胞可以分为两大类,一类包括淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、自然杀伤细胞（NK）、树突状细胞（DC）,这些细胞可以直接从外周血中分离,经相关因子诱导刺激获得.CIK细胞技术已比较成熟,目前广泛用于临床,并取得较好成效.另一类细胞为肿瘤抗原特异性T细胞包括肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,两者均是被肿瘤抗原激活的细胞毒性T细胞,具有识别自身MHC,高度特异性等特点.我们就CIK及相关免疫细胞在血液系统恶性肿瘤应用研究现状作一综述.     

体外培养的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞相互作用的研究

目的 观察同源的树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞于体外同一培养体系共同培养时的相互影响,为临床联合应用DC和CIK细胞进行肿瘤生物治疗提供依据.方法 用无血清培养基进行DC和CIK细胞的体外培养制作,共同培养1 w后,检测CIK细胞免疫表型、杀瘤活性的变化以及DC分泌IL-12的变化.结果 DC与CIK细胞的共培养会增加CIK细胞的CD3CD56双阳性细胞的比例和非特异性增强对K562细胞的杀伤活性;同时增强DC分泌IL-12的能力.结论 体外共培养DC与CIK细胞可相互增强抗肿瘤免疫活性.     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞抗肿瘤效应研究

树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是肿瘤免疫治疗的两个重要部分,DC是人体内专职抗原递呈细胞,CIK是高效肿瘤杀伤细胞,前者识别病原,启动获得性免疫系统,后者通过发挥自身细胞毒性与分泌性细胞因子杀伤肿瘤,两者联合可以更好的杀伤肿瘤细胞,被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望。     

NDV联合负载胃癌细胞抗原DC-CIK对胃癌细胞的杀伤效果及机制

目的探讨新城疫病毒（NDV）联合负载胃癌细胞抗原（Ag）的树突状细胞（DC）及细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对胃癌细胞的杀伤效果及机制。方法用人外周血单个核细胞诱导培养DC及CIK,体外培养人胃癌细胞SGC-7901,反复冻融法制备胃癌细胞Ag悬液冲击致敏DC,CIK与负载胃癌细胞Ag的DC共培养。建立胃癌裸鼠模型,将其随机分为四组各6只。PBS组瘤内注射PBS100μl／只;NDV组瘤内注射NDV0．25ml／只;Ag-DC-CIK组瘤内注射负载抗原的DC诱导的CIK细胞0．2ml／只;NDV＋Ag-DC-CIK组先瘤内注射NDV0．25ml／只,1d后再注射负载抗原的DC诱导的CIK细胞0．2ml／只;各组均隔日注射1次,共3次。14d后测量肿瘤体积,计算抑瘤率。观察肿瘤坏死情况并评分。结果NDV＋AS—DC-CIK组肿瘤平均体积小于NDV组和Ag—DC-CIK组,抑瘤率、肿瘤坏死面积评分高于NDV组和Ag-DC—CIK组;P均〈0．05。结论NDV和负载胃癌细胞Ag的DC-CIK能协同杀伤胃癌细胞,杀伤效果强于二者单用效果;其机制为NDV可增加胃癌细胞的抗原性,为CIK细胞提供更多靶点。     

骨髓瘤独特型抗原负载树突细胞介导的抗肿瘤效应研究

目的:研究骨髓瘤独特型抗原(Idiotype,Id)负载树突细胞(DC)对同源细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体外抗瘤活性的影响。方法:采集健康供者外周血单个核细胞(PBMNC)用常规方法诱导DC和CIK细胞,将骨髓瘤OPM-2细胞培养上清提取的Id冲击或未冲击的DC与CIK细胞共培养(CIK、DC加CIK、Id-DC加CIK),用流式细胞术分析细胞表型,MTT法检测体外效应细胞杀伤活性。结果:在(5～20):1效靶比范围内, CIK细胞对OPM-2和K562细胞的杀伤率分别为(24．47±3．00)％～(40．64±1．62)％和(23．36±1．51)％～(42．52±2．06)％。DC加CIK及Id—DC加CIK对OPM-2和K562细胞的杀伤活性均高于CIK组,差异有统计学意义(P<0．05);而在相同效靶比之下,Id-DC加CIK对OPM-2细胞的杀伤活性最强,差异有统计学意义(P <0．05)。结论:CIK细胞对骨髓瘤细胞有强的杀伤活性,经Id负载的DC与CIK细胞共培养能进一步增强其特异性杀伤活性,对骨髓瘤可能有免疫治疗作用。     

树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养对白血病耐药细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨负载P-糖蛋白(P-gp)高表达的多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞冻融抗原的树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养对MDRK562/A02杀伤作用的影响。方法提取健康人骨髓单个核细胞,常规诱导出DC及CIK,将K562/A02细胞冻融物作为抗原冲击的DC,与CIK共培养作为实验组,抗原不冲击的DC与CIK共培养作为对照组,以CIK及DC单独培养分别作为空白对照组1和空白对照组2。光镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT法检测杀伤活性。结果实验组、对照组细胞增殖活性均大于CIK组(P<0.05)。实验组对K562/A02、K562的杀伤活性在效靶比5∶1、10∶1、20∶1时分别为(42.90±0.67)%、(49.85±0.28)%、(63.36±0.46)%和(23.56±0.43)%、(26.11±0.34)%、(34.46±0.35)%,均高于对照组及空白对照组1(P<0.05);实验组对K562/A02的杀伤活性高于K562和MCF7(P<0.05)。结论DC与CIK共培养物是一种增殖活性和细胞毒活性高于CIK的免疫活性细胞,而经冻融抗原冲击的DC与CIK共培养能明显提高对MDRK562/A02的杀伤活性。     

DC与CIK或LAK联合对结肠癌细胞株SW480杀伤作用的研究

[目的]研究树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导或未诱导的杀伤细胞(CIK)或淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)对结肠癌细胞株SW480的杀伤活性.提供DC联合CIK或LAK治疗结肠癌的实验依据.[方法]取人外周血分离出单个核细胞(PBMNC),诱导生成DC、CIK、LAK细胞;流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后的表型变化;以CIK+DC细胞、CIK细胞、LAK+DC细胞及LAK细胞作为效应细胞,SW480为靶细胞,以15∶1、30∶1、45∶1为效靶比,LDH释放法测定细胞杀伤试验活性;ELISA检测杀伤试验中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、IL-12、IL-17的分泌水平.[结果]流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后,其表面分子HLA-DR、CD40、CD80和CD86表达分别平均为90.23％、73.68％、85.96％、57.55％,与未经肿瘤抗原冲击DC比较,DC成熟的表面标志分子表达明显增加(P＜0.01).相同效靶比下,CIK+DC细胞组对SW480的杀伤作用最强,明显高于其他细胞组(P＜0.01);CIK+ DC细胞组在效靶比为45∶1时,杀伤活性最强(P＜0.01);单独CIK细胞组的杀伤活性明显高于LAK+DC细胞组(P＜0.01);LAK+ DC细胞组的杀伤活性明显高于单独LAK细胞组(P＜0.01).效靶比为45∶1时,各杀伤试验细胞组上清液中IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17的分泌量,CIK+DC细胞组的IFN-γ、IL-12的分泌量显著高于其他细胞组(P＜0.05);LAK+DC、单独LAK细胞组IL-2的分泌量明显高于CIK+DC、单独CIK细胞组(P＜0.05);单独CIK细胞组IFN-γ的分泌量明显高于LAK+DC、单独LAK细胞组(P＜0.05).[结论]CIK+DC细胞组对SW480的杀伤活性明显强于单独CIK、LAK+ DC组、单独LAK细胞组.其机制可能是,SW480抗原致敏的DC分泌IFN-γ、IL-12等刺激、诱导CIK细胞的活化和增殖,明显增强CIK细胞杀伤SW480的活性.     

树突状细胞瘤苗对老年非小细胞肺癌自体癌细胞的杀伤作用

目的研究老年非小细胞肺癌（NSCLC）患者的树突状细胞（dendritic cell,DC）瘤苗对细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokines-induced killers,CIK）的促生长作用,及CIK在体外对患者自身肿瘤细胞的杀伤作用。方法提取老年NSCLC患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,分别培养成DC与CIK;将患者自身的肿瘤组织分离,培养出肿瘤细胞,制备肿瘤细胞冻融物作为抗原,用于负载DC,制备成Ag-DC,同时以单纯DC作为对照,各组DC经OK-432激活后,流式细胞仪检测DC表面分子的表达;将DC与CIK共培养,制备成DC-CIK、Ag-DC-CIK,同时以单纯CIK作为对照,四氮唑盐（MTT）法测定各组CIK对自身肿瘤细胞的杀伤力。结果负载肿瘤细胞冻融抗原的Ag-DC其表面CD1a、CD80、CD86、CD83、人类主要组织相容性抗原（HLA-DR）的表达上调,明显高于未负载肿瘤抗原的DC（P〈0.05）。各组DC与CIK共培养后,Ag-DC-CIK的增殖速度明显加快,其中CD3＋CD56＋细胞的含量增加,对自身肿瘤细胞的杀伤力亦明显加强,其作用均强于其他各组DC-CIK及CIK（P〈0.05）。结论老年NSCLC患者PBMC来源的DC在负载自身肿瘤细胞冻融抗原后,可分化为成熟DC,该DC可促进CIK的增殖,提高CIK对自身肿瘤细胞的杀伤力。     

树突状细胞增强细胞因子诱导的杀伤细胞抗神经胶质瘤细胞作用及机制研究

目的探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）与树突状细胞（DC）共培养后DC-CIK混合细胞抗神经胶质瘤细胞的免疫作用。方法分离健康人外周血单个核细胞,分别于体外诱导DC和CIK,然后共培养成DC-CIK细胞。实验分DC组、DC-CIK组、DC-T组和CIK组。Elisa试剂盒检测各组培养上清中IL-12和IFN．1的含量,流式细胞仪检测细胞表型,CCK一8法体外检测对神经胶质瘤细胞的杀伤活性。结果DC-CIK组培养上清中IL-12和IFN-1的含量分别为（110．24±2．22）mg／L和INF·Y／（913．46±20．64）mg／L,明显高于其它三组（P〈0．05）。DC—CIK组cDi细胞（61．34-1．31）％、CD3／CD56细胞（29．4±1．03）％也明显增加（P〈0．05）。对神经胶质瘤细胞的杀伤活性,DC—CIK组为（54．67±2．62）％,与DC组（19．44±1．07）％、DC—T组（21．27±1．85）％和CIK组（36．52±2．06）％比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论DC—CIK细胞能诱导明显的神经胶质瘤细胞杀伤活性,为颅内肿瘤的免疫治疗提供了依据。     

脐带血DCs对CIK细胞杀伤活性的影响研究

目的：探讨相同来源脐带血DCs对CIK细胞杀伤活性的影响作用。方法：采用相同来源的脐带血单个核细胞分别制备树突状细胞，CIK细胞，用流式细胞术检测免疫表型，MTT法检测CIK和CIK＋DC对K562，HL－60两种肿瘤细胞株的杀伤活性。结果：脐带血DC高表达CD1a,HLA-DR,CD80,CD86等抗原，CIK细胞是以CD3^ T细胞为主的异质性细胞群体，随培养时间延长CD3^ CD56^ 细胞比例明显升高，DC不改变CIK的免疫表型，但能明显促进其对K562和HL－60的杀伤活性（P＜0．05），结论：适量DC能增强CIK的杀伤活性，为DC的免疫治疗提供了新的思路。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞杀伤作用

目的探讨树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞的杀伤作用。方法采用胃癌患者自身血液中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),经体外诱导分别扩增出DC和CIK细胞,二者共同培养后,利用MTT法检测DC细胞联合CIK细胞体外杀伤人胃癌细胞株(MNK-45、MNK-28、SG-7901)的活性。结果DC与CIK细胞共培养后得到的细胞群高表达CD3 CD56 ,平均值达到(56.74±7.63)%。通过彼此相互作用诱导出的细胞群体对胃癌细胞株MNK-45、MNK-28、SG-7901有杀伤作用,且杀伤活性随着效靶比的增加而增强。结论DC与CIK细胞共培养后有很强的增殖能力,对胃癌细胞具有杀伤活性,且其杀伤作用与胃癌细胞类型无相关性。     

DC—CIK坌田胞治疗研究

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine—inducedkillor，CIK）是一类新型抗肿瘤效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖，与以往报告的一些抗肿瘤效应细胞相比，CIK细胞杀瘤活性更强、杀瘤谱更广。树突状细胞（dendritic cell，DC）是最有效的专职抗原提呈细胞，成熟的DC细胞可通过Ⅱ型组织相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途径提呈肿瘤抗原，     

脐血DC与CIK共培养对白血病K562细胞杀伤活性的影响

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）与同源树突状细胞（DC）共培养后DC—CIK细胞的增殖活性、表型的变化及其对白血病K562细胞杀伤活性的影响。方法采集健康产妇分娩正常足月胎儿脐血50ml,密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞培养。收集非贴壁细胞用于诱导培养CIK,贴壁细胞诱导分化出成熟DC;将成熟DC和CIK按1：5的比例混合培养3d,用MTT法检测Dc—CIK共培养细胞对白血病K562细胞杀伤活性。结果DC与CIK共培养后,DC—CIK细胞群的增殖活性和杀伤活性明显高于单纯CIK。结论DC—CIK共培养可明显提高CIK增殖活性和细胞毒作用。     

脐血DC-CIK共培养体外抗肿瘤效应及趋化性的实验研究

目的探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）与同源树突状细胞（DC）共培养后对人白血病K562细胞、人淋巴瘤raji细胞、人乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用及CIK细胞的趋化性。方法采集健康产妇分娩的正常足月胎儿脐血,分离单个核细胞,诱导培养CIK、DC细胞。将成熟DC和CIK混合培养3d,用MTT法检测CIK、DC-CIK对K562、raji、MCF-7细胞的杀伤活性;趋化试验检测CIK细胞的趋化性。结果 CIK、DC-CIK细胞对K562、raji、MCF-7细胞均具有较强的杀伤作用,DC-CIK杀伤活性明显高于CIK。趋化试验显示,IL-8、MCP-1作用后穿过微孔滤膜的细胞数明显高于阴性对照。结论 DC-CIK共培养可明显提高CIK对K562、raji、MCF-7细胞的杀伤作用,IL-8、MCP-1对CIK细胞存在趋化性。     

树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床观察

形成慢性乙型肝炎的重要原因之一是树突状细胞（DC）功能缺陷。已知DC是功能最强的抗原递呈细胞，也是惟一能激活初始型T淋巴细胞的抗原递呈细胞，在T淋巴细胞介导的细胞免疫中起重要作用。当用特异性病毒抗原负载DC时，有可能通过诱导抗原特异细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性而特异性杀伤表达病毒抗原的靶细胞。     

三种来源CIK细胞体外增殖及杀伤活性比较

目的为白血病的治疗提供理论依据。方法用Fieoll两步分离法分别从正常人、非霍奇金淋巴瘤患者外周血和脐血中分离获得单个核细胞;细胞因子诱导培养成细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）。流式细胞仪检测CIK的免疫表型,MTT法测定其对白血病K562细胞的杀伤活性。结果三种不同来源的单个核细胞均可诱导成CIK,脐血来源的CIK其扩增效率和杀伤活性均优于其他两种来源,差异有显著性（P〈0．01）。结论脐血来源的CIK细胞体外增殖快,杀伤活性强;脐血具有来源方便、免疫原性弱、含有大量造血干细胞、单个核细胞提取率高、输注时移植物抗宿主病（GVHD）发生率低等优点,白血病治疗时可优先考虑。     

nTreg对DC和CIK细胞疫苗治疗黑色素细胞瘤小鼠的影响

目的探讨自然调节性细胞(nTreg)对基于树突状细胞(DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞疫苗治疗黑色素细胞瘤小鼠疗效的影响。方法制备出小鼠的黑色素瘤动物模型40只。制备删除nTreg的CIK细胞、未删除nTreg的CIK细胞及输入DC和CIK细胞后再去除nTreg的细胞,并将各组细胞输入动物模型内,观察各组细胞体外杀伤活性及动物模型生存情况。结果第1组制备的DC和CIK疫苗杀伤黑色素瘤细胞活性最强,平均杀伤活性为(98.32±6.24)%,显著高于第2组(45.53±9.13)%和第3组(51.27±8.24)%(P<0.05)。对照组小鼠肿瘤体积显著升高,治疗B和C组在第8、12天肿瘤生长被抑制,治疗A组在第6天肿瘤被抑制,第8、12天肿瘤大小显著降低。对照组小鼠在30 d内全部死亡,治疗A组仅在第3、6天分别死亡1只,治疗B组30 d内有5只存活,治疗C组30 d有3只存活,均显著高于对照组(均P<0.05)。结论 nTreg会抑制DC和CIK疫苗杀伤肿瘤细胞活性以及治疗肿瘤疗效。     

K562细胞可溶性抗原负载树突状细胞体外诱导CTL作用的研究

目的探讨经K562细胞裂解物冲击致敏的外周血单个核细胞衍生的树突状细胞（DC）的生物特性及体外诱导抗原特异性CTL应答的能力。方法采集健康人抗凝外周血分离单个核细胞，贴壁细胞用含rhGM—CSF、rhIL-4、TNF—α的RPM1640＋10％FBS培养基体外诱导培养产生DC，5天收获细胞并将细胞分组：A组：未负载抗原DC；B组：加入K562细胞裂解液脉冲DC。7天后用流式细胞仪检测成熟DC免疫表型，并将非贴壁细胞（淋巴细胞）作为效应细胞与各组DE共育，以产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。12天用LDH释放试验测定对K562细胞的杀伤活性。并用ELISA方法测定细胞上清液中IL-12的含量。结果（1）经细胞因子联合体外诱导的各组DC较培养前在数量，形态及免疫表型上差异有统计学意义，CD86、CD83、CD40、CD1a表达增加，其中经K562细胞裂解液冲击的DC的CD83CD86表达率明显升高。（2）效应细胞与K562细胞混合培养时，负载K562细胞裂解液的DC刺激后的T细胞比单独DC刺激后的T细胞对K562细胞的杀伤作用更明显。（3）负载K562细胞裂解液的DC细胞培养上清液中产生IL-12含量较未负载抗原的DC明显增加。结论用GM—CSF、IL-4以及TNF—α诱导培养健康人外周血单个核细胞可以得到成熟的DC，且经K562细胞裂解液致敏可以进一步促进DC的成熟并体外诱导特异性杀伤靶细胞的CTL。     

DC联合CIK免疫治疗术后晚期恶性肿瘤84例疗效观察

目的观察树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）免疫治疗84例术后晚期恶性肿瘤患者的疗效。方法对84例恶性肿瘤术后患者,分别采用手术切除的肿瘤组织作为致敏DC的肿瘤抗原,分离患者外周血单核细胞培养成DC和CIK,分别回输患者体内,行免疫治疗。1～3个疗程评价疗效及疾病控制率（DCR）、卡氏行为状态评分（KPS）,观察血清肿瘤标志物（AFP、CEA、CA125、CA199）水平。结果84例中,CR1例、PR27例、sD43例、PD13例,DCR为84．5％,KPS较治疗前评分超过20分者占59．5％（50／84）。84例血清AFP、CEA、CA125、CA199水平均较治疗前明显下降（P均〉0．05）。结论DC联合CIK能有效增强术后晚期恶性肿瘤患者的免疫能力,对恶性肿瘤有明显的治疗作用。     

自体DC、CIK回输联合干扰素治疗慢性乙肝的临床观察

目的观察自体树突状细胞（DC）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）联合干扰素治疗慢性乙肝（CHB）的临床疗效。方法将320例CHB患者随机分为两组各160例,对照组采用自体DC、CIK治疗,观察组采用自体DC、CIK联合干扰素治疗。治疗前后检测两组的肝功能、HBV-DNA定量及HBeAg定量。结果与治疗前比较,两组治疗后ALT、AST、TBIL、HBV-DNA定量、HBeAg定量均明显下降（P均〈0.01）,以观察组下降明显（P均〈0.05）。结论自体DC、CIK可有效地清除乙肝病毒,改善CHB患者的肝功能及细胞免疫;自体DC、CIK联合干扰素疗效更佳。