siRNA沉默CXCR4基因对食管鳞癌细胞EC9706体外侵袭能力的影响

目的:探讨siRNA沉默CXCR4基因对食管鳞癌EC9706细胞系体外侵袭能力的影响.方法:化学合成两对针对CXCR4基因的干扰序列siRNA1和siRNA2和一对荧光标记的阴性对照siRNA,转染人食管鳞癌EC9706细胞.荧光显微镜下观察转染效率,于转染后48 h采用半定量RT-PCR和Western Blot法检测各组细胞CXCR4 mRNA和蛋白表达水平的变化,Boyden侵袭小室检测各组细胞体外侵袭能力的变化.结果:与未转染组和转染阴性对照siRNA组相比,EC9706细胞转染两对CXCR4 siRNA48 h后,CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05),转染siRNA1组CXCR4 mRNA和蛋白下降尤为明显,未转染组和转染阴性对照siRNA组之间无明显差异(P>0.05).Boyden侵袭小室结果显示,转染CXCR4siRNA1和CXCR4 siRNA2组细胞穿膜数与未转染组和转染阴性对照siRNA组相比明显下降(P<0.05),未转染组和单纯转染脂质体转染试剂组之间无明显差异(P>0.05).结论:siRNA沉默CXCR4基因降低EC9706细胞CXCR4的表达和侵袭能力,为...     

RNA干扰沉默桩蛋白对食管鳞癌EC9706细胞体外侵袭能力的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)沉默桩蛋白(Paxillin)基因表达对人食管鳞癌EC9706细胞系体外侵袭能力的影响.方法:将食管鳞癌EC9706细胞分为正常对照组、转染siRNA对照组以及Paxillin siRNA组,通过RTPCR和Western Blotting方法检测转染48 h后3组细胞Pariilin、FAK和MMP-2 mRNA和蛋白的表达;通过侵袭小室实验观察3组细胞体外侵袭能力的变化.结果:3组细胞中Palillin、FAK和MMP02 mRNA及蛋白的表达水平相比,差异具有统计学意义(mRNA:F＝7 021、388、20 147.737和5 992.522,P<0.001;蛋白:F=4 454.293,10 003.335和3 802.389,P〈0.001),正常对照组及转染siRNA对照组细胞Paxilliu、FAK和MMP-2 mRNA及蛋白的表达均高于Paxillin siRNA组(P<0.05);3组穿膜细胞数比较,差异具有统计学意义(F=288.741,P(0.001),正常对照组及转染siRNA对照组的穿膜细胞致高于Paxillin siRNA组(P<0.05).结论:RNAi沉默Ptaiilin基因表达可以使EC9706细胞的体外侵袭能力降低.     

RNA干扰对EC9706细胞mTOR表达及细胞生长与凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人食管癌EC9706细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达及细胞生长与凋亡的影响.方法:设计合成mTOR siRNA,采用低、中、高浓度(50、100与150 nmoL/L)的mTOR siRNA分别转染EC9706细胞24、48与72 h.同时设无义对照组(转染无义对照siRNA)、空白对照组(转染空脂质体)及正常对照组(不转染).采用免疫细胞化学与原位杂交法分别检测各组EC9706细胞中mTOR蛋白与mRNA的表达;应用MTT法检测细胞增殖,计算细胞生长抑制率;应用TUNEL法检测转染24 h时细胞凋亡,计算凋亡指数(AI).结果:转染24、48与72 h,6组细胞mTOR蛋白和mRNA的表达差异均有统计学意义(mTOR蛋白:F=24.14,45.78,59.19,P均＜0.001;mTOR mRNA:F=41.42,69.74,43.71,P均＜0.001),细胞生长抑制率差异亦有统计学意义(F=143.85,172.98,155.01,P均＜0.001);低、中、高浓度组转染不同时间点间比较,mTOR蛋白(F=42.23,29.46,50.22,P均＜0.001)、mTOR mRNA(F=6.48,8.50,4.80,P均＜0.05)及细胞生长抑制率(F=78.77,76.14,52.28,P均＜0.001)差异均有统计学意义.mTOR siRNA转染组EC9706细胞mTOR蛋白与mRNA的表达均低于各对照组,且mTOR蛋白及mRNA的表达随mTOR siRNA浓度的增加及转染时间的延长而减弱(P＜0.05).不同浓度mTOR siRNA转染组EC9706细胞生长抑制率均高于各对照组,且细胞生长抑制率随mTOR siRNA浓度的增加和转染时间的延长而升高(P＜0.05).转染24 h,6组细胞AI相比,差异有统计学意义(F=442.96,P＜0.001),mTOR siRNA转染组AI均高于各对照组,且高浓度转染组AI高(P＜0.05).结论:mTOR siRNA可有效抑制EC9706细胞mTOR蛋白与mRNA的表达,且能抑制EC9706细胞的增殖并促进其凋亡.     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

目的 采用RNAi抑制食管癌EC9706细胞株MTA1基因的表达,观察对食管癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 用脂质体包裹转染沉默MTA1表达的siRNA表达载体人食管癌细胞EC9706.定量RT-PCR和免疫印迹分别检测MTAl mRNA和蛋白表达情况;划痕损伤实验和细胞体外侵袭实验分别测定迁移和侵袭的影响.结果 定量RT-PCR检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低;转染沉默MTA1的siRNA表达载体组的食管癌细胞划痕未愈合,穿透Matrigel的细胞数量明显减少,与未转染组、转染空载体组和转染无关序列siRNA载体组比较差异有显著性(P<0.05).结论 RNA干扰介导的MTA1基因表达沉寂可有效降低食管癌细胞侵袭和迁移;MTA1基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点.     

PTEN反义寡核苷酸对EC9706细胞增殖、凋亡和PTEN、mTOR表达的影响

目的:探讨PTEN反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡和PTEN、mTOR表达的影响.方法:利用阳离子脂质体介导PTEN的ASODN和无义寡核苷酸(N-ODN)转染食管癌EC9706细胞,终浓度为3、6和12μmol/L的ASODN为实验组,终浓度12 μmol/L的N-ODN为N-ODN对照组,不进行转染的为空白对照组.运用MTT法、TUNEL检测空白对照组、N-ODN对照组及3种浓度的ASODN作用24、48及72 h后食管癌EC9706细胞增殖和凋亡情况;采用免疫细胞化学技术及原位杂交方法检测各组EC9706细胞中PTEN蛋白、mTOR蛋白和mRNA的表达.结果:①随PTEN ASODN转染浓度(F3μmol/L=784.774,F6μmol/L=242.884,F12μmol/L=412.105,P均＜0.001)和时间(F24 h=60.676,F48 b=57.703,F72 h=51.841,P＜0.001)的增加,食管癌EC9706细胞的增殖增强.②随PTEN ASODN转染浓度(F3μmol/L=36.655,F6μ=mol/L47.594,F12μmol/L=85.264,P均＜0.001)和时间(F24h=4.860,F48 h=4.901,F72 h=8.153,P＜0.001)的增加,食管癌EC9706细胞的凋亡下降.③随PTENASODN转染浓度(F3μmol/L=45.634,F6μmol/L=66.399,F12μmol/L=72.763,P均＜0.001)和时间(F24h=4.065,F48 h=3.985,F72 h=5.446,P＜0.001)的增加,PTEN的蛋白表达降低;mRNA的表达也降低(F3μmol/L=23.357,F6μmol/L=43.272,F12μmol/L=51.402,P均＜0.001;F24h=3.933,F48 h=4.084,F72 h:4.528,P＜0.001).④mTOR蛋白(F3μmol/L=19.422,F6 μmol/L=30.000,F12 μmol/L=62.168,P＜0.001;F24 h=5.340,F48 h=9.150,F72 h=21.056,P＜0.001)和mRNA(F3μmol/L=19.414,F6 μmol/L=46.571,F12μmol/L=68.634,P＜0.001;F24 h=4.815,F48 h=12.165,F72 h=7.858,P＜0.001)的表达随PTEN ASODN转染浓度和时问的增加而增强.⑤上述各指标中均以12 μmol/LASODN作用72 h的效应最强(P均＜0.05).结论:PTEN ASODN促进食管癌EC9706细胞增殖、抑制凋亡,下调PTEN蛋白和mRNA的表达,上调mTOR蛋白和mRNA的表达.     

调控CIAPIN1基因表达对食管癌细胞生长及侵袭性的影响

目的 采用重组慢病毒CIAPIN1表达载体和CIAPIN1沉默载体感染食管癌EC9706细胞,观察调控CIAPIN1基因表达对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及体外侵袭转移的影响.方法 构建CIAPIN1表达慢病毒载体和CIAPIN1 siRNA慢病毒载体,包装得到重组慢病毒;分别感染食管癌EC9706细胞,筛选得到稳定C...     

调控Livin基因表达对食管癌EC9706细胞生物学行为的影响

目的:探讨调控Livin基因表达对食管癌EC9706细胞生长速度、细胞凋亡以及放射线敏感性的影响.方法:取EC9706细胞,分7组,siRNA组、Livinα组、Livinβ组分别用脂质体包裹法转染沉默Livin表达的siRNA载体pSUPER-neo-Sli1、Livinα表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα及Livinβ表达载体pIRES2-AcGFP-Livinβ;Livinα/β组同时转染pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,空siRNA载体组转染pSUPER-neo,空表达载体组转染pIRES2-AcGFP,空白对照组不转染.取各组细胞,荧光定量RT-PCR法检测Livin mRNA表达情况,MTT法测定细胞生长曲线,TUNEL法检测细胞凋亡,同时检测Caspase-3 活性及放射线敏感性.结果:与空白对照组比较,空表达载体组、空siRNA载体组细胞倍增时间、凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性差异均无统计学意义(P＞0.05).与空白对照组比较,Livinα组、Livinβ组和Livinα/β组细胞倍增时间、凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性均降低(P＜0.05);siRNA组细胞凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性增加(P＜0.05),细胞倍增时间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:调控EC9706细胞Livin基因的表达,可有效改变细胞的生物学行为;Livin基因可能成为肿瘤治疗的新靶点.     

调控CIAPIN1基因表达对食管癌细胞生长及侵袭性的影响

目的 采用重组慢病毒CIAPIN1表达载体和CIAPIN1沉默载体感染食管癌EC9706细胞,观察调控CIAPIN1基因表达对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及体外侵袭转移的影响。 方法 构建CIAPIN1表达慢病毒载体和CIAPIN1 siRNA慢病毒载体,包装得到重组慢病毒;分别感染食管癌EC9706细胞,筛选得到稳定CIAPIN1基因高表达和低表达的细胞。实验分为CIAPIN1表达组、CIAPIN1 siRNA组、无关siRNA对照组和空白对照组。采用RT-PCR和蛋白质印迹法分析CIAPIN1基因和蛋白的表达,MTT实验检测细胞增殖,流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化, Boyden小室检测细胞侵袭转移。 结果 与空白对照组、无关siRNA对照组和CIAPIN1 siRNA组比较,CIAPIN1高表达组细胞生长受到抑制(P<0.05);S和G₂/M期细胞比例减少,G₀/G₁期细胞比例增加(P<0.05);平均细胞凋亡率增加(P<0.05),穿透Matrigel的平均细胞数减少(P<0.05)。 结论 以慢病毒为载体介导的CIAPIN1基因高表达可有效抑制食管癌EC9706细胞增殖、促进细胞凋亡和降低细胞侵袭迁移能力。     

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

食管癌相关基因2对EC9706细胞恶性增殖的抑制作用

目的探讨食管癌相关基因2(esophageal cancer related gene2,ECRG2)对EC9706食管癌细胞恶性增殖的抑制作用及其机制。方法利用DNA重组技术,构建ECRG2真核表达质粒(pcDNA3.1ECRG2),在食管癌EC9706细胞中转染并表达ECRG2蛋白,观察细胞的生长状态,比较平板集落和软琼脂克隆形成能力的改变,分析ECRG2对EC9706恶性表型的影响。进一步采用WesternBlot检测p53、p21的改变。结果转染表达ECRG2后,EC9706细胞的生长受到干扰,细胞的增殖速度受到抑制,实验组细胞平板集落形成率为18%,而对照组为55%,两者间差异显著(P<0.05);肿瘤细胞的停泊非依赖能力降低,实验组软琼脂克隆体积小且形成个数(8±1.88)明显少于对照组(14.3±3.13),差异显著(P<0.05)。WesternBlot分析表明,EC9706细胞转染表达ECRG2后伴随着p53、p21蛋白表达上升。结论转染表达ECRG2蛋白能够部分逆转食管癌EC8706细胞的恶性表型,其过程可能与p53、p21通路密切相关。