新生大鼠大脑皮质O-2A祖细胞的体外诱导分化

目的 :探索新生大鼠大脑皮质O -2A祖细胞的体外分离纯化的培养条件 ,并观察其在体外增殖、分化的规律 ;鉴定体外培养的O -2A祖细胞、2型星形胶质细胞及少突胶质细胞。方法 :根据 1型星形胶质细胞、O -2A祖细胞的生长时间差异及细胞的粘附特性不同 ,采用振荡法和差速贴壁法 ,并结合使用生长因子 (PDGF ,bFGF )刺激O -2A祖细胞增殖 ,从而分离纯化、扩增O -2A祖细胞 ;观察O -2A祖细胞在有血清 (D/F + 2 0 %FCS)和无血清 (CDM )培养条件下的分化情况。免疫细胞化学法鉴定O -2A祖细胞(A2B5 )和分化成熟的 2型星形胶质细胞 (GFAP ,A2B5 )及少突胶质细胞 (CNPase)。结果 :①分离纯化的O -2A祖细胞胞体呈椭圆形 ,具有典型的双极或三极突起 ;经免疫细胞化学染色鉴定 ,A2B5抗体标记阳性 ,细胞纯度达 95 % ;②应用有血清的培养基诱导O -2A祖细胞定向分化为 2型星形胶质细胞 ,2型星形胶质细胞的胞体较大 ,突起多而细长 ,GFAP和A2B5抗体标记均为阳性 ;③应用无血清的化学条件培养基诱导O -2A祖细胞定向分化为少突胶质细胞 ,少突胶质细胞的胞体小 ,突起短而细 ,相互交织呈“蜘蛛网”样 ,CNPase抗体标记阳性。结论 :①采用振荡法和差速贴壁法 ,并结合使用生长因子 ,建立了分离纯化O -2A祖细胞的方法 ;②分离纯化的O -2A     

少突胶质祖细胞的体外分离、培养和定向分化

目的探索体外培养获得高纯度少突胶质祖细胞的方法,观察少突胶质祖细胞的形态学特点以及增殖和分化规律。方法选取新生1～2 d SD大鼠,应用选择性分离程序,根据细胞的不同贴壁特性,通过2次细胞选择性贴壁培养和2次不同频率的振荡,分离纯化少突胶质祖细胞。应用物理振荡方法进行细胞传代,进一步纯化细胞。传代细胞分别用无血清和有血清的培养基培养,应用免疫荧光法进行细胞鉴定。结果纯化后的少突胶质祖细胞达95%。在无血清的情况下,少突胶质祖细胞定向分化为少突胶质细胞;在有血清的情况下,定向分化为2-型星形胶质细胞,并且细胞骨形态形成性蛋白质4(BMP4)表达增加。结论应用选择性分离程序,通过振荡分离的方法可以获得高纯度的少突胶质祖细胞。少突胶质祖细胞具有增殖和双向分化的潜能。BMP4参与了祖细胞定向分化的调控。     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化培养

目的获取纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞，用于进一步实验。方法取新生大鼠大脑，用酶消化结合机械吹打方法分离皮质细胞制成细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养融合时，恒温摇床振荡法去除少突胶质细胞、小胶质细胞等，纯化后，观察星形胶质细胞生长变化规律，并通过GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。结果大鼠脑皮质细胞接种后24h全部贴壁，部分细胞已伸出突起；3～5d时细胞增殖最明显，细胞数目增加，体积增大，突起相互交织成网状；原代培养7～10d时细胞基本融合并开始分层生长。振荡纯化处理后，GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可达98％。结论用差速贴壁和恒温振荡方法可获得高纯度皮质源性星形胶席细胸．     

新生大鼠少突胶质前体细胞的培养与鉴定

目的 在体外培养条件下获取纯度较高的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs).方法 原代混合胶质培养,利用振荡法和差速贴壁法分离纯化少突胶质前体细胞,再用无血清化学条件培养基培养.免疫荧光法及膜片钳记录细胞电生理特性进行鉴定.结果 振荡分离后超过90%细胞为NG2阳性OPCs:OPCs电生理特性:输入阻抗Ra相对较高;电压依赖的K 电流具有外向整流特性;对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的小的内向Na 流,不能产生动作电位.结论 振荡法结合差速贴壁可以获得纯度较高的OPCs;OPCs具有区别于神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的独有电生理特性.     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞（OPCs）。方法新生1～2d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立

目的 对传统培养方法进行改良,以获得更高纯度的少突胶质前体细胞(OPCs)。方法 新生1~2 d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质混合胶质细胞原代培养8 d后,采用恒温摇床振荡分离法、差速贴壁法和胰酶消化法结合条件限定培养基纯化培养细胞,台盼蓝染色光学显微镜观察细胞形态;纯化培养2 d后进行A2B5和DAPI免疫荧光染色鉴定和细胞纯度分析。结果 光学显微镜观察发现纯化培养细胞的胞膜完整,细胞无损伤;免疫荧光染色后细胞纯度分析显示,A2B5染色阳性细胞占DAPI染核细胞的百分比为98.14%。结论 通过对传统的混合胶质细胞培养及振荡分离和纯化方法的改进,能够培养出高纯度的OPCs。     

巢蛋白和阶段特异性胚胎抗原-1在O-2A谱系细胞中的表达

目的 观察O-2A（oligodentrocyte-type-2 astrocytes）谱系细胞是否是表达神经干细胞的标志物。方法 取新生大鼠脑皮质体外培养纯化的O-2A祖细胞、少突胶质细胞和2型星形胶质细胞,应用激光共聚焦双重免疫荧光标记技术检测巢蛋白（nestin）和阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）的表达。结果 nestin在O-2A祖细胞和2型星形胶质细胞中表达,在少突胶质细胞中不表达;SSEA-1仅在2型星形胶质细胞中表达。结论 nestin和SSEA-1在O-2A谱系细胞中的表达存在差异,可能具有神经干细胞的特征。     

SD大鼠脑皮层星形胶质细胞的原代培养及纯化方法改良

目的:探讨大鼠大脑皮层星形胶质细胞的培养方法,以获得纯度高的细胞进一步对其进行体外实验研究。方法:在Mc-Carthy方法基础上改用出生后1d的SD大鼠的大脑皮层,结合机械分离和胰酶消化后制备单细胞悬液接种,差速贴壁1h,培养14d以后上摇床以去除混杂细胞,细胞融合后传代,每次传代前都经历胰酶冲洗和差速贴壁,传3代后利用GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果:经过原代传代及纯化,大脑皮层星形胶质细胞体外培养成功,并有较高的纯度。GFAP-FITC免疫荧光染色阳性。结论:经过合理取材、改良纯化方法后,可以更为简便得到纯度很高的星形胶质细胞。     

原浆型和纤维型星形胶质细胞的分离、培养和鉴定

目的 从新生鼠皮层中分离、培养并鉴定原浆型星形胶质细胞(protoplasmic astrocyte,PAS)和纤维型星形胶质细胞(fibrous astrocyte,FAS).方法 新生大鼠皮层分离的混合星形胶质细胞,经差速振荡法得到纯化的PAS和FAS;用免疫组化法分别对两种细胞进行鉴定.结果 观察到两种细胞均特异性的标记为阳性.PAS外观扁平似圆盘状,细胞体较大,突起宽而扁,分支少,均匀排列生长;FAS细胞体较小,呈圆形、卵圆形或多角形,突起较多,细长并有分支,呈交错生长.结论 采用差速振荡法体外纯化培养两种AS,方法可行、有效,同时纯度达95%以上.     

视神经星形胶质细胞原代培养技术研究

目的 介绍一种快速原代培养、分离、纯化视神经星形胶质细胞的方法。方法 对P2期小鼠的视神经进行组织块原代培养,振荡法分离纯化,形态学观察,免疫组织化学染色。结果 培养的星形细胞纯度高,GFAP染色显示98%阳性。结论 组织块原代培养,振荡法分离纯化视神经的星形胶质细胞,对细胞的损伤小、纯度高,是快速得到该细胞的理想途径。     

载脂蛋白D在两型星形胶质细胞和少突胶质细胞中的表达

目的: 通过对载脂蛋白D(ApoD)在分化成熟的两型星形胶质细胞和少突胶质细胞中表达的检测,探讨ApoD等脂代谢相关基因对神经髓鞘生成的调控机制.方法: 用激光共聚焦免疫荧光标记技术检测ApoD在分化成熟的两型星形胶质细胞和少突胶质细胞中的表达情况.结果: 激光共聚焦显微镜检测显示在O-2A谱系来源的成熟2型星形胶质细胞和少突胶质细胞中ApoD标记为阳性,而在T1A谱系来源的成熟1型星形胶质细胞中则未检测到ApoD的表达,从而在蛋白质水平验证本室研究两型星形胶质细胞基因表达谱差异基因芯片结果中ApoD mRNA在T2A中高表达,而在T1A中低表达的现象.结论: ApoD等脂代谢相关基因可能在O-2A谱系发生和分化过程中起重要作用,O-2A谱系与脑内脂质代谢以及神经髓鞘发生内在机制密切相关.     

bFGF对神经干细胞分化为星形胶质细胞的影响

 目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠脊髓来源神经干细胞分化形成星形胶质细胞亚型的影响。方法：悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞。把神经干细胞分为A、B两组,A组加入血清,B组加入血清和bFGF,分化培养7 d后,GFAP抗体标记星形胶质细胞,观察其各亚型的比率和形态特点。结果：神经干细胞分化第7d,A组和B组均形成4种亚型星形胶质细胞,分别为胞体延长型,扁平多角形,星形和双极型。B组中双极型星形胶质细胞的突起长度明显超过A组。结论：bFGF可以显著促进脊髓来源神经干细胞分化成的双极型星形胶质细胞的突起生长。     

Nogo-p4对神经干细胞分化成星形胶质细胞的影响

目的:观察Nogo-p4对神经干细胞分化成星形胶质细胞的影响。方法:体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞,分为A组和B组,在神经干细胞分化过程中A组加入血清,B组加入血清和4μmol/L的Nogo-p4,分化7d后,GFAP抗体标记星形胶质细胞,观察其各亚型的比率和形态特点。结果:神经干细胞分化第7d,A组形成4种亚型星形胶质细胞,分别为胞体延长型,双极型,星型和扁平多角型。B组只能形成3种亚型星形胶质细胞,分别为胞体延长型,双极型和星型。结论:Nogo-p4对神经干细胞分化过程中形成的扁平多角型星形胶质细胞具有选择性抑制作用。     

猪诱导多能干细胞可定向分化为前脑GABA能神经元前体

目的 探讨猪诱导多能干细胞（iPSCs）体外定向分化为GABA能神经元前体的方法体系。方法 猪iPSCs诱导分化为GABA能神经元前体遵循两个阶段,第1阶段,猪iPSCs悬浮培养,第3天时形成类胚体,采用神经诱导培养基NIM（SB431542、DMH1、FGF2）继续诱导,第12天分化为原始神经上皮细胞。第2阶段,使用含Pur、B27的NIM培养基悬浮培养形成神经球,至第21天时形成GABA能神经元前体。CM-DiI标记后,定向移植帕金森（PD）模型大鼠黑质纹状体,检测其在宿主脑内存活、迁移及分化状况。结果 猪iPSCs在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性标记OCT4、Nanog、SSEA1和TRA-160,并且核型分析显示没有其他物种来源细胞污染。第12天经诱导分化获得原始神经上皮细胞能够形成玫瑰花环结构,并表达其表面标记物（PAX6、SOX2 和 Nestin）与神经微管蛋白标志物 Tuj1。第 21 天诱导细胞高表达 GABA 能神经元前体的表面特异性抗原NKX2.1和前脑标志物FOXG1。移植8周后,体内可分化为GABA能神经元与多巴胺能神经元,明显改善PD大鼠运动行为。结论 结合无血清培养基筛选法逐步定向诱导猪iPSCs高效分化为前脑GABA能神经元前体,移植后能够显著改善PD大鼠的运动功能障碍,为诱导GABA能神经元前体移植治疗神经损伤疾病奠定基础。     

脑络欣通药物血清对大鼠胚胎神经干细胞生长分化的影响

目的研究不同浓度脑络欣通药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)生长分化的影响。方法采用细胞培养、血清药理学、免疫组化等方法,观察不同浓度脑络欣通药物血清对大鼠NSC生长分化的影响。结果不同浓度脑络欣通药物血清均可在一定程度上促进大鼠NSC生长,以10%的药物血清作用最明显。不同浓度药物血清均可诱导绝大多数NSC分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。10%药物血清诱导大鼠NSC向神经元方向分化的比例最高,且使分化的神经元在细胞形态学上更为接近发育成熟。结论脑络欣通有促进NSC生长分化的作用。不同浓度脑络欣通药物血清对离体培养大鼠NSC的生长和分化有不同影响,10%药物血清是最佳作用浓度。     

已分化神经干细胞修复成年鼠急性脊髓损伤的实验研究

目的 观察已分化神经干细胞植入成年鼠损伤脊髓后的变化及检查修复脊髓损伤的效果.方法 以胚胎脊髓提取液(FE)诱导细胞/PGA支架复合物分化后,植入成年鼠损伤脊髓,观察分化细胞的存活和发育情况并评估动物的运动功能.结果 FE体外可诱导神经干细胞分化成神经元、星形和少突胶质细胞.植入脊髓后,分化细胞/PGA支架复合物(dNPC)内的细胞成分可以存活并继续成熟,动物BBB评分明显优于对照组.结论 dNPC含有已经分化的细胞,移植后各种细胞成分可以存活并继续成熟,对成年鼠损伤脊髓的结构重建和功能恢复都有一定的作用.     

人胚胎干细胞体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗NOD/SCID糖尿病小鼠

目的 探讨人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID）小鼠的可行性.方法 体外分4阶段诱导hESCs定向分化为胰岛细胞：①诱导分化形成定型内胚层;②诱导胰腺细胞定向分化;③扩增胰腺前体细胞;④促进胰岛细胞成熟.观察诱导各阶段细胞形态变化、免疫荧光鉴定胰十二指肠同源异型盒基因（PDX-1）、胰高糖素（glucagon）、胰岛素（insulin）、C肽（C-peptide）、葡萄糖转运子2（Glut-2）的表达.3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入链脲菌素（streptozotocin,STZ）诱导形成的NOD/SCID糖尿病小鼠一侧附睾脂肪垫内,观察血糖变化.结果 hESCs诱导4阶段细胞表达胰高血糖素、胰岛素、Glut-2;共表达PDX-1和C肽;流式鉴定诱导4阶段胰岛素阳性细胞为17.1％;体外检测有葡萄糖刺激的胰岛素释放反应;3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入NOD/SCID 糖尿病小鼠体内可逆转其高血糖至少12周.结论 体外定向诱导hESCs分化形成的胰腺前体细胞及胰岛细胞分别植入NOD/SCID小鼠可逆转其高血糖.     

大鼠寡突胶质前体细胞的体外培养、鉴定及其生物学特性观察

目的 探讨体外培养条件下寡突胶质前体细胞增殖、迁移及分化特性。方法 取新生1 d SD大鼠大脑皮质混合胶质细胞培养10 d,分离纯化寡突胶质前体细胞。通过BrdU掺入实验对其增殖能力进行测定,采用经典的Transwell模型和重聚球模型对其迁移能力进行检验,并在分化培养基中观察其分化成为成熟寡突胶质细胞的能力。结果 混合培养胶质细胞在培养10 d后出现明显分层现象。初次振荡后,小胶质细胞脱落显示大量聚集成团的寡突胶质前体细胞散布于星形胶质细胞表面。分离的寡突胶质前体细胞NG2、A2B5表达阳性;阿糖胞苷可抑制其增殖(P<0.01);PDGF可明显促进其迁移(P<0.01);在分化培养条件下,MBP阳性的成熟寡突胶质细胞增多(P<0.01)。结论 寡突胶质前体细胞在体外培养条件下可以保持其增殖、迁移和分化的基本特性。     

Ca2＋对小鼠骨髓基质干细胞定向分化为肝细胞的作用

目的研究小鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）向肝细胞定向分化过程中Ca2＋的变化,探讨BMSCs向肝细胞定向分化的机制。方法无菌分离小鼠骨髓,贴壁法纯化和扩增BMSCs。分别添加肝组织提取液、β-神经生长因子（β-NGF）、β-NGF＋尼莫地平诱导BMSCs向肝细胞分化,对照组添加等量营养液。光镜下观察分化细胞的形态;免疫细胞化学染色法检测分化细胞的肝细胞特异性标志物α-1-抗胰蛋白酶（AAT）和清蛋白（ALB）的表达;吲哚靛青绿（ICG）摄取实验鉴定分化细胞的转运功能;流式细胞技术对比检测肝样分化细胞内游离Ca2＋的含量;MTT法检测钙离子拮抗剂尼莫地平对干细胞增殖和定向分化能力的影响。结果肝组织提取液和β-NGF诱导后,分化细胞逐渐变圆、呈肝前体细胞特定形态;分化细胞摄取ICG,呈绿色;分化细胞呈AAT和ALB阳性表达;肝组织提取液组和β-NGF组比较差异无显著意义。β-NGF诱导形成的肝样分化细胞Ca2＋含量显著高于对照组细胞（t=8.757,P〈0.01）。尼莫地平可以阻断BMSCs向肝细胞的诱导分化,抑制干细胞的增殖。结论 Ca2＋对BMSCs的增殖和向肝细胞定向分化具有重要的作用。