霍乱弧菌含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体转染检测

[目的]研究霍乱毒素基因（ctx)在霍乱弧菌O1群埃尔托型，古典型菌株和O139群菌株之间的传递现象。了解含编码霍乱毒素基因的溶源性噬力体（CTXφ）和ctx基因转移中的作用。[方法]从人工构建的供体菌中诱导出带有标记的CTXφ并转染至受体菌，用PCR扩增和Southern杂交等方法检测受体菌，转染子及其质粒的目的基因片段。[结果]从受体菌O395、569B（古典型）和80071（埃尔托型）的转染子中均检出带有供体菌标记的质粒，PCR和Southern杂交结果表明这些质粒是CTXφ的形式。[结论]ctx基因能通过CTXφ在不同霍乱弧菌间进行传递。     

霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析

目的分析广东霍乱弧菌（VC）代表菌株主要毒力基因和管家基因序列。方法PCR扩增霍乱弧菌的主要毒力基因（ctxAB和tcpA）和管家基因（dnaE、hlyA、mdh和recA）、基因测序、对序列进行生物信息学分析。结果不同年代分离的2株埃尔托型（EVC）产毒株和1株0139群VC产毒株的主要毒力基因序列与国内外相关报告比较，ctxA基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为99．7％～100％和98．8％～100％．ctxB基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为98．8％～100％和96．8％～100％，tcpA基因序列与EVC国际标准株N16961 100％同源。3株产毒株的dnaE、hlyA、mdh和recA基因序列同源性分别为99．8％～100％，100％，99．5％～99．8％和100％，氨基酸序列同源性分别为100％．100％，98．5％～99．3％和100％；3株产毒株和O139群VC非产毒株的管家基因序列同源性分别为97．0％～97．2％，91．8％，94．1％～94．4％，96．9％，氨基酸序列同源性分别为100％，94．6％，94．3％～98．5％和99．7％。结论广东省不同年代EVC产毒株和O139群VC产毒株的群体遗传学关系高度密切，而与O139群VC非产毒株较远，O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株。     

霍乱弧菌4种新类型tcpA基因发现及序列分析

目的研究中国霍乱弧菌（VC）毒力协同调节菌毛A亚单位基因（tcpA）的多态性.方法分别进行聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析、型特异引物PCR分型、基因测序及序列分析.结果 200株O1群埃尔托型（EVC）产毒株和100株O139群VC产毒株的tcpA基因均与EVC国际标准株N16961株为同一类型（t2型）.50株EVC非产毒株中只有3株携带tcpA基因,1株为t2型,另2株为2种新类型.20株O139群VC非产毒株均不携带tcpA基因.20株非O1非O139群VC中只有2株携带tcpA基因,且为2种新类型.4种新类型tcpA基因与国外发现的4种类型比较,基因序列及推测的氨基酸序列同源性分别为58.3%～77.5%和61.0%～85.5%;5′端约102bp基因序列基本一致,推测的氨基酸序列完全一致;3′端约210bp基因序列变异最大,推测的氨基酸序列变异也最大.抗原表位分析,C末端差异最大.结论建立快速准确区分不同类型tcpA基因的方法,并发现4种新类型.     

霍乱弧菌含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体转染检测

[目的 ]研究霍乱毒素基因 (ctx)在霍乱弧菌O1 群埃尔托型、古典型菌株和O1 39群菌株之间的传递现象 ,了解含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体 (CTXΦ)在ctx基因转移中的作用。 [方法 ]从人工构建的供体菌中诱导出带有标记的CTXΦ并转染至受体菌 ,用PCR扩增和Southern杂交等方法检测受体菌、转染子及其质粒的目的基因片段。 [结果 ]从受体菌O395、569B(古典型 )和 80 0 71 (埃尔托型 )的转染子中均检出带有供体菌标记的质粒 ,PCR和Southern杂交结果表明这些质粒是CTXΦ的复制形式。 [结论 ]ctx基因能通过CTXΦ在不同霍乱弧菌间进行传递     

手足口病相关柯萨奇病毒A组8型全基因组序列特征分析

目的 研究中国2013-2018年手足口病病例分离的柯萨奇病毒A组8型（CV-A8）全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析。方法 对我国不同地区手足口病患者分离的11株CV-A8的全基因组序列,采用Sequencher 5.0、MEGA 7.0等软件对获取的全基因组序列进行比对和遗传进化分析。结果 序列比对显示11株CV-A8基因组长度在7 393~7 400 bp之间,与原型株比较,在编码区无碱基插入或缺失,在非编码区存在个别碱基的插入或缺失。11株CV-A8毒株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为78.3%~98.6%和92.6%~99.7%;与CV-A8原型株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.3%~98.2%和92.6%~99.7%。对CV-A8的VP1区序列进行了系统发育分析,可将CV-A8分为5个基因型：A、B、C、D和E,本研究11株CV-A8分属于C（1株）、D（2株）、E（8株）3个基因型。11株CV-A8毒株全基因组序列核苷酸和氨基酸同源性分别为81.3%%~98.8%和95.9%~99.5%,P2区进化树图显示,本研究的8株E基因型CV-A8和CV-A4、CV-A14和CV-A16原型株进化距离最近,P3区进化树图显示,本研究8株E基因型CV-A8和CV-A5、CV-A16、CV-A14和CV-A4进化距离最近。结论 本研究中11株CV-A8其衣壳区呈现基因多样性,非衣壳区呈现重组多样性,提示CV-A8正在经历变异动态变化;CV-A8有可能成为手足口病的重要病原体,因此需要进一步加强监测CV-A8。     

小肠结肠炎耶尔森菌基因组中前噬菌体基因结构特征分析

目的了解小肠结肠炎耶尔森菌基因组中前噬菌体和噬菌体元件的携带情况及基因组结构特征。方法利用PHAST软件,对NCBI数据中18株已完成全基因组测序完成图的小肠结肠炎耶尔森菌的前噬菌体区域进行预测,并与参考噬菌体基因组序列进行比对,分析小肠结肠炎耶尔森菌前噬菌体基因的分布及其基因组特征。结果 18株小肠结肠炎耶尔森菌全基因组序列中前噬菌体携带率100%,共预测到141个前噬菌体区域,其中71个是具有完整噬菌体特征的前噬菌体,其余70个属于噬菌体元件。非致病性小肠结肠炎耶尔森菌LC20预测到的噬菌体区域最多,含有9个完整的前噬菌体和7个噬菌体元件,在一定程度上解释LC20菌株染色体基因组大于其余菌株,且含有更多重组及SNP位点的原因。截取71个完整前噬菌体区域的序列信息,与112株NCBI公布的噬菌体基因组序列进行聚类分析显示,共分为两个大簇。预测的前噬菌体与已知噬菌体之间不存在共有的核心基因组。部分前噬菌体区域含有毒力相关基因。结论小肠结肠炎耶尔森菌基因组中的前噬菌体具有基因组多样性,为噬菌体和宿主菌的协同进化研究奠定基础。     

恶性转化人支气管上皮细胞基因组甲基化观察

目的对反式二氢二醇环氧苯并芘（anti-BPDE）和结晶型硫化镍（NiS）恶性转化人支气管上皮细胞（Hu-man bronchial epithelia,16HBE）基因组DNA甲基化状况进行研究,寻找DNA甲基化异常的基因片段,探讨反式-BPDE和NiS的表遗传致癌机制.方法采用限制性指纹识别技术（MSRF）,对反式-BPDE和NiS分别诱导转化及裸鼠成瘤的4种人支气管上皮细胞株基因组进行分析;对异常甲基化基因阳性片断采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较.结果发现结晶型NiS恶性转化人支气管上皮细胞基因组存在高甲基化的DNA片段,其中一基因片段与编码鼻咽癌易感性蛋白ANKRD11基因序列99%同源.另一基因片段与HOXA3基因序列99%同源;未发现反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞基因组DNA异常甲基化基因片段.结论结晶型NiS恶性转化人支气管上皮细胞DNA的高度甲基化可能导致基因表达抑制.可能是结晶型NiS致癌的一种表遗传机制;反式BPDE致癌过程可能与基因组磷酸胞苷酰（CpG）岛甲基化异常关系不明确.     

汉坦病毒江西分离株全基因组序列分析

目的了解江西省汉坦病毒新分离株Jiangxi XinjianRn-07-2011的全基因组特征。方法设计特异性引物,分段扩增毒株的S、M、L全基因,对扩增产物进行序列测定,运用DNAStar、Mega 3.1软件对序列进行拼接和分析。结果全S、M、L基因分别含1 772个、3 651个、6 530个核苷酸,分别编码429个、1 133个、2 151个氨基酸,经序列比对和系统进化分析,该病毒属汉城型汉坦病毒(SEOV),S4亚型。S、M、L 3个基因与SEOV型病毒比较,核苷酸序列同源性分别为88.1%~98.0%、84.0%~96.1%、94.4%~95.9%;氨基酸序列同源性较高,分别为98.2%~100%、98.7%~99.5%、98.2~99.4%。结论测定了江西省新分离株Jiangxi XinjianRn-07-2011的全基因组序列,发现新分离株为SEOV,S4亚型。     

O139霍乱弧菌分子遗传学研究动态

O139霍乱弧菌作为一种新出现的霍乱病原体,有许多重要的分子特征:溶源性噬菌体CTXΦ具有生物特异性免疫机制,而且有不依赖TCP菌毛的普遍性转导的感染方式;VPI毒力岛由噬菌体VPIΦ携带,可以在菌株间水平转移,这些都为设计生物安全性菌苗提出了难题。染色体上的RTX毒素家族具有细胞毒性;SXT携带多种抗生素抗性基因,可以发生位点特异性重组;pTLC,一种静息质粒也与噬菌体的复制等功能有关;该菌携带多种菌毛噬菌体,可能参与遗传交换,这些对O139霍乱弧菌的致病性和流行都将产生影响。     

细粒棘球蚴内蒙株疫苗侯选基因克隆及分析

目的为确定细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白（FABP）基因的特性并为研究其免疫功能奠定基础。方法根据已报道的细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白的基因序列（AY024340和AF321119）设计引物,进行FABP基因扩增。结果成功克隆到细粒棘球蚴内蒙株FABP基因,扩增片段为482bp;序列比对结果显示,细粒棘球蚴内蒙株FABP基因与国内株FABP基因（GenBank登录号为AY024340）序列完全一致,同源性为100%;与国外株FABP基因（GenBank登录号为AF32I119）的同源性为99%。结论细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白有潜在的抗原表位位点,为研究该蛋白的免疫功能及构建FABP核酸疫苗奠定了基础。     

新疆猪戊型肝炎病毒株CHN-XJ-SW33全基因组序列分析

目的测定从新疆南部地区分离的猪戊型肝炎病毒(HEV)株全基因组序列,并在此基础上分析猪HEV与人源HEV的关系。方法设计HEV基因4型通用PCR引物,用逆转录巢式聚合酶链反应法(RT-nPCR)分段扩增猪HEV株CHN-XJ-SW33的全基因组序列;用cDNA末端快速扩增法(RACE)扩增其末端序列;对扩增的目的片段进行克隆测序,并对拼接后的基因组进行序列比对和进化分析。结果除3′poly(A)尾外,CHN-XJ-SW33基因组全长为7 238 nt,由3个开放读码框(ORF1-3)组成,分别编码1 706、674和114个氨基酸。CHN-XJ-SW33全基因组序列与HEV基因1-3型病毒株同源性仅为72.1%~74.9%,而与HEV基因4型病毒株同源性高达82.8%~95.5%,其中与日本人源中国输入型HEV株JKO-ChiSai98C同源性最高,为95.5%。基因进化分析显示,CHN-XJ-SW33属于HEV4a基因亚型。结论猪HEV与人HEV在全基因组核苷酸序列上高度同源,提示基因4型HEV可能由猪传染给人。     

2016年6月至2017年4月辽宁省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因特征分析

目的 本文对2016-2017年辽宁省人感染H7N9禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因遗传进化特征分析。方法 使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对选取的4株H7N9禽流感病毒株HA和NA基因进行扩增并测序,用生物信息学软件分析其基因进化变异特征。结果 2016年6月至2017年4月辽宁省4株毒株的HA和NA基因与WHO最新推荐的A/Hunan/02650/2016疫苗株的同源性最高,其HA基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为99.3%~99.6%,99.8%~100%;NA基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为97.7%~99.7%;98.3%~99.6%。本省所有毒株均属长江三角洲谱系,但主要聚集在两个次分支。4株病毒HA蛋白裂解位点333-342氨基酸序列均为PEIPKGR↓GLF,在338-339位点无连续的多个氨基酸插入(KRTA),属于低致病性禽流感病毒分子特征。HA受体结合位点均出现S138A、G186V、Q226L、T221P氨基酸的突变,NA茎部区均出现“QISNT”缺失,且NA蛋白上相关耐药位点上的氨基酸并未发生突变,3株毒株NA蛋白上糖基化位点第42位发生氨基酸序列NCSH→NCTH突变。结论 2016-2017年辽宁省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因关键位点氨基酸发生突变,使病毒具有双受体结合特性以及毒力增强。     

海宁市霍乱病原学调查检测

目的:为了查清我市水体等外环境及患者中霍乱弧菌的菌型分布特征、毒力基因、药敏等,为霍乱防控提供科学依据。方法:采用GB15984-1995附录A、C及《霍乱防治手册》第五版中有关要求进行调查检测。结果:从外环境标本和患者中共检出霍乱弧菌83株,经血清学鉴定分型,其中:O1群埃尔托霍乱弧菌(Vibriocholerae serotypeO1,b iotype E ltor,EVC)稻叶型38株,占45.78%,O1群EVC小川型16株,占19.28%,O139群霍乱弧菌29株,占34.94%。23株霍乱弧菌噬菌体生物分型以O1群EVC稻叶型1 f居多,占86.96%(20/23);14株霍乱弧菌毒力基因检测结果均为阳性(携带ctx,ace,zot 3种毒力基因);药敏试验O1群、O139群霍乱弧菌对抗菌药物均有不同程度的耐药,其中对磺胺的耐药率高达100%;对头孢噻肟、诺氟沙星、丁胺卡那霉素敏感率高达100%。结论:河水中菌型复杂,O139群、小川、稻叶三型并存,但以O139群为主,占48.94%;井水中检出4株埃尔托霍乱弧菌均为稻叶型;甲鱼塘水中O139群与O1群小川型并存;患者中以O1群EVC稻叶型为主,占88.24%(15/17)。经噬菌体生物分型,以不常见流行株为主,毒力基因检测均为产毒株。     

萍乡地区O139群霍乱弧菌TcpA基因序列分析

目的　探讨O13 9群霍乱JX株的TcpA基因序列 ,分析该株基因的特点。方法　采用PCR扩增技术 ,检测含O13 9群霍乱标本 ,对TcpA基因阳性者进行核苷酸序列测定 ,分析基因变异情况。结果　发现阳性标本中 ,对其中 1株进行了TcpA基因序列测定 ,该序列与TcpAET(O13 9株 )同源性为 10 0 % ,与EVC序列同源性为 96%。结论　本株与O1群 (EVC)遗传关系最近 ,对萍乡地区霍乱防治具有重要意义。     

肠致病性大肠埃希菌EPEC Deng致病岛基因进化特点

目的分析肠致病性大肠埃希菌（EPEC）致病岛（PAIs）基因进化特点。方法EPEC Deng分离自我国婴幼儿腹泻患者粪便标本,鉴定该菌株血清型并进行药敏试验;采用Illumina 2000仪器对菌株进行全基因序列测序,PHAST软件定位菌株原噬菌体(prophages,PPs)在染色体中的位置,MUMmer软件进行共线性分析,构建系统发育树,了解同源基因进化规律。应用PAI_finder软件对基因组进行PAIs预测,了解PAIs核心区域（LEE）和核心基因同源进化规律,并进行遗传多态性分析。结果EPEC Deng菌株归属O119∶H6,药敏结果显示该菌株对环丙沙星、左氧氟沙星及氨苄西林耐药,对其余的抗菌药物均敏感。基因组（染色体）序列大小为5 025 482 bp（GC含量为50.52%）,质粒序列大小为207 564 bp（GC含量为49.50%）。共找到17个PPs,系统发育树分析发现,EPEC Deng株基因组与O26∶H11、O111∶H同源性较高;EPEC Deng株PAIs和核心基因均与RDEC 1和O26∶H413/89 1株具有高同源性;遗传多样性分析结果显示,紧密素（eae）及其受体（tir）多态性丰富,π值均＞0.10,Ⅲ型分泌系统（TTSS）分泌蛋白相对稳定。结论此研究明确了EPEC Deng株基因组及PAIs的进化特点,有助于了解了本土分离的EPEC基因特点。     

霍乱弧菌O139和El Tor菌株tcpA分子特征的研究

[目的]从霍乱弧菌XJ93006、MO45、XJ89079中克隆毒素协同调节菌毛亚单位A（tcpA）基因（包括侧序列）并测序比较。[方法]PCR扩增tcpA片段;克隆该片段;提取质粒经鉴定后测序并利用DNAMAN对该序列进行序列分析,比较。[结果]成功构建XJ93006、MO45、XJ89079 tcpA基因的重组质粒。三株霍乱弧菌及与N16961 tcpA基因及其两侧核酸序列同源性XJ89079和N16961为100%,XJ93006和XJ89079为99.8%,XJ93006和MO45为99.5%,XJ89079和MO45为99.7%。[结论]该研究初步认为我国新疆VC O139与本地EVC关系密切。     

中国新型布尼亚病毒分离株序列基因特征分析

目的分析中国新型布尼亚病毒分离株的基因型分布和进化规律,了解分子流行病学特征。方法利用MEGA6.0软件,对GenBank数据库收录的中国地区分离株的完整S片段基因序列进行分析,构建系统进化树,并分析毒株间的核苷酸和氨基酸的同源性。结果在GenBank数据库收集到248株中国地区新型布尼亚病毒分离株,主要为人源毒株232株,占93.55%,核酸和氨基酸序列同源性分别为94.9%~96.8%和91.4%~95.2%;系统进化树分析显示中国地区流行优势株为C2基因亚型,占58.06%;5种亚型的核苷酸序列和氨基酸序列同源性为94.9%~96.8%、91.4%~95.2%,同亚型毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性为96.3%~99.1%、96.8%~98.6%。与汉坦病毒属和白蛉病毒属亲缘较远,毒株核苷酸序列同源性分别为39.3%~40.2%和47.3%~48.1%,氨基酸序列同源性13.6%~14.4%和22.5%~23.9%。人源毒株与宿主动物分离株高度同源,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为96.3%~97.1%和94.0%~95.7%。结论我国近年来新型布尼亚病毒流行毒株以基因亚型C2为主,存在多种基因亚型间循环交替流行。     

北京市西城区手足口病患儿肠道病毒71型VP1区基因进化分析

目的了解北京市西城区2015年手足口病（HFMD）患儿肠道病毒71型（EV 71）分离株VP1区基因特征,分析其变异情况。方法收集北京市西城区2015年HFMD病原学检测分型鉴定为EV 71的阳性标本,对部分标本进行病毒分离、培养,并通过实时荧光PCR鉴定阳性培养物。EV 71阳性培养物提取病毒核酸,对其VP1区全长序列进行PCR扩增和测序。从Genbank中选取EV 71不同基因型别参考序列,利用生物信息学软件进行同源性和系统进化分析。结果共分离到6株EV 71（Genbank登录号为KU376383-KU376388）,其VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.00%~99.00%和98.00%~100.00%,与参考序列VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.00%~97.00%和93.00%~100.00%。进化分析显示,6株EV 71均为C4a基因亚型。结论 2015年北京市西城区EV 71流行株属于C4a亚型,未出现明显变异。     

父儿传播乙型肝炎病毒S区的基因分型

目的：从乙型肝炎病毒（HBV）S基因155－687段序列,研究携带者父亲与其子所携HBV的基因分型,方法：应用套式PCR扩增S基因片段,直接测序155－687段核苷酸并推衍出其编码的氨基酸序列,与文献中4株分属A,B,C,D基因序列比较。结果：父亲与其子所携带HBV序列与B型同源性最高,核苷酸水平分别达98．3％和97．9％,氨基酸水平分别达100％与99．4％,故父亲与其子所携HBV均属B型,父与子间此段序列的同源性极高,核苷酸与氨基酸同源性分别达99．6％与99．4％,结论：从分子水平证明出生前期HBV你儿传播的存在。