人胚胎干细胞培养及其cDNA文库的构建

目的 构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础.方法 培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切消化产生粘端.用Sepharose CL2B柱分离纯化及除去小分子cDNA片段,与Uni-ZAP XR噬菌体连接,体外转化XL1-blue MRF菌,建成cDNA文库并计算重组效率.对cDNA文库进行扩增,测定扩增文库的滴度.阳性重组子用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定插入片段的大小.结果 构建成含1.2×106重组子的人胚胎干细胞cDNA文库,重组子插入外源DNA片段长度不小于1000 kb.结论 已成功构建人胚胎干细胞cDNA文库,适合用于筛选目的基因克隆.     

胚胎干细胞自我更新的信号转导途径和体外培养系统的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑堪胚之前的早期胚胎细胞，或从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞以及体细胞核转移至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞.自1981年Evans和Kaufman等成功地分离、建立了小鼠胚胎干细胞系以来，历经将近20年，第一株人ES细胞系在美国威斯康星大学成功建立。同年，另一研究小组用流产胎儿性腺成功地分离和培养了人胚胎生殖细胞系（embryonic germ cells，EG细胞）.     

不同来源的人间质干细胞分离与基本生物学特性研究

目的：分离并比较人胚胎骨髓、成人骨髓和新生儿脐血来源间质干细胞（MSC）的生物学特性,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法： 用贴壁方法分离三种来源的间质干细胞,观察其形态与生长曲线,并用流式细胞仪测定其表面标志.结果： 骨髓标本均可成功分离出MSC,但是人胚胎骨髓MSC增殖能力要明显强于成人骨髓MSC,而脐血分离MSC没有得到成功.结论： 人胚胎骨髓MSC是很好的组织工程种子细胞,成人骨髓MSC的增殖能力相对较弱,应用受到一定的限制.脐血MSC分离与扩增有待进一步研究.     

自体骨髓干细胞移植的研究进展

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。按生存阶段顺序分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是受精后胚胎内细胞团的衍生物。成年人和动物的许多组织和器官内,始终保留着未被分化的于细胞,即为成体干细胞。由丁成体干细胞的材料来源不像胚胎干细胞会毁坏所使用的胚胎,而且容易获得组织替代,冈而成体干细胞有着比预想更为广阔的应用前景。至今,科学家已成功分离到造血干细胞、神经干细胞、骨髓间质干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肠干细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞、前列腺干细胞、嗅觉干细胞、角膜干细胞、胎盘干细胞,骨骼肌干细胞、心脏干细胞等。但目前研究和应用最广泛的是骨髓来源的骨髓干细胞（Bone Marrow Stem cells,BMS）。     

悬滴法检测小鼠胚胎干细胞AKP的表达

目的 采用悬滴法和传统细胞爬片法对胚胎干细胞等呈集落样生长的细胞进行检测.方法 取3.5天昆明小鼠胚胎放在KSOM培养液中,体外培养24h后,将孵出的ICM放在铺有饲养层的胚胎干细胞培养液中,4～5 d待ICM呈柱状生长时,消化传代,并应用悬滴法和普通爬片法检测小鼠胚胎干细胞AKP表达.结果 分离、培养的小鼠胚胎干细胞体积小,细胞核大,细胞界限不清,呈集落样生长.应用悬滴法和普通爬片法对其进行AKP染色后,小鼠胚胎干细胞呈蓝紫着色.结论 悬滴法与传统的细胞爬片法相比,可以减少细胞丢失,利用较少的细胞即可成功的检测,明显提高了小鼠胚胎干细胞检测成功率.     

人脑神经干细胞的分离培养和鉴定

目的 探讨人脑神经干细胞的分离培养和鉴定方法。方法 采用无血清培养液从人胚胎脑皮质分离和培养神经干细胞，并应用免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向化潜能的鉴定。结果 鉴定表明从人胚胎脑皮质分离培养的细胞具有神经干细胞的特征，并可在体外增殖，经诱导可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。结论 从人胚胎脑皮质成功分离培养了神经干细胞，它是研究细胞诱导分化的良好模型。     

利用细胞饲养层分离培养大鼠胚胎干细胞

目的 从大鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞.方法收集大鼠的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,5～6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态、分化过程及细胞核型的检测.结果细胞集落性生长,符合胚胎干细胞的特征.结论大鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

大鼠胚胎神经干细胞的培养及分化的观察

目的探索大鼠胚胎神经干细胞的培养、传代和冻存、复苏的方法,以及观察胚胎神经干细胞在自然条件下分化为神经元细胞和神经胶质细胞的过程.方法从胚胎大鼠脑组织中分离得到神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定.诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)检测以作细胞鉴定.结果成功培养出大鼠胚胎神经干细胞,并对其进行传代、冻存及复苏,培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞.结论大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏,并具有多向分化潜能.     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞，制成饲养层，用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好，增殖快，易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好，当培养4~5 d时，其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后，各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。     

人卵母细胞孤雌激活获得囊胚国内首报

孤雌激活是对卵母细胞在第二次减数分裂中期(MII)进行刺激,使之保持二倍体状态下发生有丝分裂获得早期胚胎发育.人卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚,可为人类干细胞建系提供崭新的来源,由此产生的胚胎干细胞称为孤雌胚胎干细胞.此研究已在许多哺乳动物物种中进行,如小鼠、牛、猴已获得囊胚,并在小鼠和猴成功进行了干细胞建系,目前成为多国科学家的关注与研究热点.     

牛胚胎干细胞建系的现状与展望

胚胎干细胞是能在体外培养中保持自我更新和多分化潜能的细胞。因此,牛胚胎干细胞系是基因工程、治疗性克隆、发育生物学、人类疾病动物模型研究的良好实验载体。公认的胚胎干细胞系已在小鼠和灵长类动物中建立。虽然关于牛类胚胎干细胞的报道也已有不少,但是真正的牛胚胎干细胞建系尚未获得成功。本文将综述当前牛胚胎干细胞建系的研究进展并对其中存在的问题,如胚胎分离胎龄、牛胚胎干细胞识别与鉴定、培养条件和与分化相关细胞因子和信号通路等,进行探讨并提出可能采取的解决办法。     

胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展

自1981年英国的Evans等[1]和美国的Martin[2]相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来,胚胎干细胞体外诱导分化的研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前,已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心     

妇产科概论

解剖、生理和组胚学071107人胚胎干细胞建系的研究进展/陈悦洲…∥现代妇产科进展.—2007,16(4).—306~308人胚胎干细胞(hES细胞)体外成功建系,对人类胚胎发生和发育生物学、新药物开发、细胞和组织的移植等研究领域具有重大意义和深远影响。近年干细胞的研究发展很快,已成为生     

转录因子Nkx2-5和GATA-4在胚胎心肌发育早期的作用

移植不同来源的干细胞以修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为目前研究的热点.虽然人们已成功地将非心源性的干细胞(如胚胎干细胞、造血干细胞和骨骼肌卫星细胞等),移植至梗死的心肌区域并观察到它们分化成心肌样细胞,但是对于这一横向分化的具体机制所知甚少.     

牛胚胎干细胞分离克隆的研究

目的从牛原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞。方法采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养的方法，以高糖DMEM添加0．1mM2-巯基乙醇、犊牛血清为培养基，以4-13周龄牛胎儿为实验材料，从牛原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞。结果参与胚胎干细胞分离克隆的4．0例牛胎儿中，一体长6．5cm的雌性胎儿胚胎干细胞传到15代；分离得到的牛胚胎干细胞，经碱性磷酸酶染色，体外分化实验，核型分析证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。结论可以从4-13周龄牛胎儿的原始生殖细胞中分离克隆胚胎干细胞。     

我国医学科研新成果八则

人类胚胎干细胞克隆研究取得重大进展 干细胞是目前国内外生命科学研究的热点和一项前沿课题。我国科研人员从1993年就开始进行胚胎干细胞分离与克隆研究,1995年在国内首次由早期胚胎分离克隆出牛、猪胚胎类干细胞。1997年     

干细胞在组织损伤中应用的研究进展

干细胞是来自胚胎、胎儿或成人的一类具有长期自我复制和多向分化潜能的特殊细胞,分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类.自从1981年Evans等首次成功地从小鼠胚泡内层细胞团中分离出胚胎干细胞以来,干细胞的研究就成为了生命科学中最活跃和最有影响的领域之一.     

携带α-地中海贫血基因人胚胎干细胞系的建立

【目的】 建立携带α-地中海贫血纯合子基因人胚胎干细胞系.【方法】 收集经胚胎种植前遗传学诊断技术诊断为携带α-地中海贫血纯合子基因的囊胚,机械法分离内细胞团,用无血清培养基进行人胚胎干细胞培养,建立携带α-地中海贫血纯合子基因的人胚胎干细胞系?对所得人胚胎干细胞进行α-地中海贫血基因的DNA序列分析与全能性鉴定. 【结果】 本研究共收集44枚PGD筛查后囊胚,分离12个囊胚内细胞团,建立两株人胚胎干细胞系.两株人胚胎干细胞系均携带α-地中海贫血纯合子基因.两株胚胎干细胞系均有正常的染色体核型.OCT-4基因与细胞表面抗原SSEA-3?SSEA-4?TRA-1-60与TRA-1-80的表达,能够向三胚层细胞分化.【结论】 携带α-地中海贫血纯合子基因的人胚胎干细胞具有向三胚层细胞分化的全能性,携带致病基因的胚胎可用于建立携带遗传疾病基因的人胚胎干细胞系.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

组织、器官重建的基础:干细胞

种子细胞是应用组织工程技术重建组织、器官的前提和基础,干细胞已成为最佳种子细胞来源.成体干细胞在动物及临床试验中的成功,证实了组织工程技术的可行性,展示了其广阔的发展前景.而同种异体干细胞的研究以及通用型胚胎干细胞研究的拓展,将为实现组织工程产业化奠定基础.