新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定

目的 建立一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR）,用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌。方法 选取新生隐球菌和格特隐球菌IGS中变异度最高的Ⅰ区（IGS1）为靶点,经ClustalW2多重比对,并结合Oligo6软件在不同序列位点设计针对新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌的引物用于多重PCR分析。通过51株新生隐球菌（VNⅠ-VNⅣ和VNB基因型）和41株格特隐球菌（VGⅠ-VGⅣ基因型）对该方法进行验证,并将该方法与已报道的CGB显色培养和采用特异性引物GPA1A、CLA4D和SOD1gattii扩增格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的单一引物PCR方法进行比较。结果 基于IGS的多重PCR分析成功鉴定所有92株新生隐球菌和格特隐球菌,对其他常见致病酵母的扩增均阴性,显示所设计引物较高的特异性;已报道的基于GPA1A和CLA4D引物PCR分别在鉴定2株和1株格特隐球菌时出现假阳性结果;CGB培养基在鉴定1株格鲁比变种和1株新生变种时出现假阳性结果。上述方法在鉴定时均未出现假阴性结果。结论 建立的多重PCR可快速准确地鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种、AD杂合子和格特隐球菌,且优于已报道的单一引物PCR 或CGB显色培养法。     

鸽粪中新生隐球菌的分离和鉴定

采用ＧＡＥＣ培养了１４４份私人和公共养鸽场所的鸽粪标本,从中共分离得３２株新生隐球菌,阳性率达２２．２％。３７℃生长良好。尿素试验均为阳性。血清因子分型结果证实阳性标本均为新生隐球菌新生变种,全是Ａ血甭型,动物接种后能重新分离出该菌。病理证实具致病性。     

在CGB培养基上生长的A型和D型新生隐球菌

新生隐球菌是临床上重要的致病真菌,在免疫缺陷的患者如艾滋病患者中引起播散性脑膜炎。新生隐球菌有两个变种,并分为5个血清型。文献报道新生隐球菌新生变种的血清型为A、D和AD型,在CGB培养基上不生长;格特变种的血清型为B和C型,能够在CGB培养基上生长。作者报告了3株来自鸽排泄物,能在CGB培养基上生长,血清型为A或D型的新生隐球菌。     

新生隐球菌生态学研究

目的:研究中国环境中新生隐球菌变种的生态学特点.方法:采集10个城市(3组)鸽粪标本620份和江西贵溪地区澳洲赤桉标本819份;采用咖啡酯玉米山梨醇琼脂(cAcA)培养基分离新生隐球菌,并对菌株进行CGB培养,酚氧化酶、尿素酶、血清型、交配型试验和形态学观察.结果:①不同纬度地区鸽群的新生隐球菌标本阳性率为G1[40°～50°北纬(N)]13%,G2(30°～40°N)50%,G3(20°～30°N)29%,G2显著高于G1(P＜0.01);3组鸽群阳性率基本相同(P＞0.05),平均为81%.②环境分离358株全部37℃生长、酚氧化酶阳性、CGB培养阴性;1株尿素酶阴性;其中101株均为α交配型和A血清型,提示全部为grubii变种;发现环境分离菌株荚膜变异并与其他真菌的自然黏附现象.③从江西贵溪生长的澳洲赤桉未分离到新生隐球菌格特变种.结论:中国环境中以grubii变种为主的新生隐球菌的生态学特点与其所在的地区纬度明显相关:由澳洲赤桉分离新生隐球菌格特变种的研究仍然需要继续进行.     

新生隐球菌不同变种所致小鼠原发性皮肤感染的比较

目的：探讨新生隐球菌不同变种在原发性小鼠新生隐球菌皮肤感染中的作用。方法：按照我们建立的原发性皮肤隐球菌感染模型的方法，将新生隐球菌新生变种标准野生株B3501与格特变种标准株ATCC32609分别皮内接种于免疫抑制与非抑制的BALB／c小鼠，皮损真菌培养与组织病理检查确证感染。观察2种隐球菌感染的病程，比较皮损形成与消退的平均时间。结果：2种变种的新生隐球菌皮下接种于BALB／c小鼠后，可以在免疫抑制与非抑制的BALB／c小鼠皮肤上产生丘疹、结节、溃疡、传染性软疣样皮损，皮损可以自愈，真菌培养与病理确证为隐球菌感染。2种菌株只在免疫正常小鼠的皮损形成时间上存在差异。结论：新生变种与格特变种的新生隐球菌均可以造成BALB／c小鼠相似的皮肤感染。推测2种变种对原发性皮肤感染的致病力可能无差异，新生变种发病较多可能与其分布有关。     

PCR-RFLP鉴别念珠菌、曲霉和隐球菌的探讨

为快速鉴别３类医学上重要真菌－念珠菌、曲霉和隐球菌,应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）的分子生物学说法方法对白念珠菌、克柔念珠菌、季地蒙念珠菌、近平滑珠菌、热带念珠菌、乳念珠菌、新生隐球菌格梯变种、新生隐球菌新生变种、罗伦隐球菌格梯变种、新生隐球菌新生变种、罗伦隐球菌１、工霉、黄曲霉和杂色曲霉进行体外研究。新生隐新生变种、罗伦隐球菌、曲霉隐球菌放增出３１０ｂｐ经ＰＣＲ含珠菌、     

墨西哥隐球菌脑膜炎患者中新生隐球菌格特变种的首次报导

近来据文献报导新生隐球菌格特变种(Cryptococcus neoformans var.gattii)可发生在艾滋病患者及非流行区,且与新生隐球菌新型变种(Cryptococcus neoformans var.neoformans)所致隐球菌脑膜炎的临床经过有所不同,因此有必要对隐球菌脑膜炎的病原体的鉴定、分布和临床特点进行研究。作者对此作了研究。 患者来源于墨西哥国立神经病学、神经外科学研究所。1989～1994年共有20例隐球菌脑膜炎患者,隐球菌从患者脑脊液中分离。用二     

新生隐球菌AD血清型是新生变种?

新生隐球菌根据传统的分类方法和以往的观点,血清型AD型新生隐球菌一直被视为新生隐球菌新生变种\,但事实上,AD型新生隐球菌无论在地区分布、致病特征等方面,均与新生隐球菌新生变种中的A型和D型有明显不同^[2,3].本文采用变性梯度胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术和核酸序列分析,首次发现新生隐球菌AD型28S rDNA基因型与新生隐球菌新生变种的A、D型不同,而与新生隐球菌格特变种B、C型完全一致,现报道如下.     

在布琼布拉与AIDS相关的隐球菌病的流行病学研究

以往的研究表明AIDS合并新生隐球菌新型变种感染在中非国家的发生率高于欧洲,以致该地一旦发现隐球菌病患者即疑合并有AIDS。此外还提出除鸽粪外,居室内灰尘、空气中也有该菌存在,作者为此在布隆迪首都布琼布拉对隐球菌的传染源进行了研究。作者取800个样本,来自AIDS伴有隐球菌病的患者的居室、病房及附近未住人的房屋中空气、家具、墙壁、地板等处的尘埃,架子上的蜘蛛网,患者曾接触过鸽舍的     

新生隐球菌变种问ITS序列差异的研究

目的 利用真菌核糖体基L大1内转录间隔区(ITS)序列分析和系统进化学分析来研究新生隐球菌上海变种的地位及变种问ITS序列的差异.方法 采用真菌通用引物ITS1、ITS4对12株新生隐球菌不同变种标准株的ITS片段进行PCR扩增和测序,结合基因库等数据库中11株新生隐球菌标准株的ITS序列,用CLUSTAL W1.83软件多重比对分析序列的差别,MEGA3.1软件处理数据绘制系统进化树.结果 新生隐球菌变种之间ITS序列存在明显差异,存在6种亚型;gattii变种ITS序列存在4种亚型.中国发现的新生隐球菌上海变种S8012与gattii变种在表型及分子生物学研究均存在显著的差异,但仍属于变种内差异.结论 我国发现的上海变种S8012归入gattii变种的ITSC型,原gattii变种RV20186归人gattii变种的ITSF型.     

新生隐球菌28S rDNA的基因型特征与序列分析

目的 探讨新生隐球菌各变种、血清型与基因型的关系。方法 新生隐球菌标准株10株、新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10以及临床分离株19株,采用变性梯度胶电泳(DGGE)结合DNA序列分析,对以上菌株的28S rDNA片段进行研究。结果 经过DGGE和DNA序列分析,所有新生隐球菌新生变种(A、D型)具有一致的基因带型和序列,格特变种(B、C型)具有不同于新生变种的独特一致的带型和序列;AD型的基因型和序列与格特变种完全相同,新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10(D型)的基因型类同于新生变种;19株临床分离菌在DGGE上可分为2型,17株与A、D型完全相同,2株与B、C型相同。结论 DGGE结合DNA序列分析,对于探讨新生隐球菌各变种、血清型的基因型特征、关系具有重要价值;我国非艾滋病隐球菌病感染以新生变种为主,AD型在系统发育上更类同于格特变种,而不是新生变种;本研究不支持A血清型为新生变种以外的新变种即grubii变种的观点。     

墨西哥城鸟粪、水果和蔬菜中分离的新生隐球菌及其变种

新生隐球菌存在于各种自然来源,包括鸽粪、水果与蔬菜,如宠物的粪便及动物园饲养鸟的粪便、热带树木木屑、苹果、石榴、木瓜、胡萝卜和马铃薯等,而新生隐球菌gattii变种也曾从树木如某些热带橡树(Eucalypeus camaldulensis)及蝙蝠的粪便、马蜂的巢穴中分离出,其中在世界范围报导鸽粪还是其主要来源。但对     

非洲布隆迪地方与艾滋病相关的隐球菌患者室内分离出新型隐球菌

许多报告提及不少非洲国家与艾滋病(AIDS)相关的隐球菌病的发病率很高。因此,中非国家的许多学者将隐球菌感染视为AIDS的一个指征。新型隐球菌及其变种一向只能发现于户外的鸽、鸡等粪中,但室内的灰尘、空气中也可分离到。本文作者对布隆迪城市的20例与AIDS相关的隐球菌病患者室外土壤及尘埃标本作了检查,同时也检查了3例患者室周围的鸽粪;另外,对19例患者     

播散性隐球菌病

报告1例免疫功能正常的播散性隐球菌病.患儿女,11岁.全身包括肺、淋巴结、骨髓、肝脾、脑及皮肤等多器官受累,表现为痤疮样皮损.患儿临床症状进展缓慢,全身中毒症状轻微,嗜酸性粒细胞升高.皮损、淋巴结组织病理检查示组织细胞内、外大量隐球菌酵母细胞,PAS染色阳性.皮损、骨髓、淋巴液真菌培养阳性,菌种鉴定为新生隐球菌,经PCR扩增测序为新生隐球菌grubii变种.     

新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

A型新生隐球菌质粒克隆库的构建及其特征分析

新生隐球菌是一种条件致病菌，当机体免疫力减低时就可能侵犯人体，引起严重的隐球菌病，特别是隐球菌性脑膜炎的死亡率极高。隐球菌属包括１７个种７个变种，然而能够致病的只有新生隐球菌及其变种，且以血清型Ａ型最常见。我们以Ａ型新生隐球菌标准菌为实验菌株，构建了质粒克隆库，这是进一步进行分子生物学研究的基础，如在核酸水平探索致病机理，建立快速诊断方法等。一、材料和方法（一）菌株和质粒：①Ａ型新生隐球菌标准株Ｄ４８由世界卫生组织（ＷＨＯ）提供，本研究室保藏；②质粒ＰＵＣ１８及宿主菌ＪＭ１０３由复旦大学遗传学研…     

荚膜在小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染中的作用

目的探讨新生隐球菌多糖荚膜在小鼠原发性皮肤新生隐球菌感染中的作用。方法按照笔者建立的原发性皮肤隐球菌感染模型构建方法,将新生隐球菌标准野生株B3501与荚膜缺陷株cap64分别皮内接种于免疫抑制与非抑制的BALB/c小鼠,皮损真菌培养与组织病理检查确证感染。观察2种隐球菌感染的病程,比较皮损形成与消退的时间。结果野生株与荚膜缺陷株新生隐球菌皮下接种于BALB/c小鼠后,均可以在免疫抑制与非抑制的BALB/c小鼠皮肤上产生结节、丘疹、溃疡、传染性软疣样皮损,皮损可以自愈,真菌培养与病理确证为隐球菌感染。2种菌株感染的病程差异无显著性意义。结论野生株与荚膜缺陷株新生隐球菌均可以造成BALB/c小鼠相似的皮肤感染。荚膜可能不是小鼠皮肤隐球菌感染的主要毒力因子。     

新生隐球菌菌株中常同时含有不同倍体的细胞

新生隐球菌是严重威胁艾滋病患者的致病真菌之一。以往认为大多数新生隐球菌为单倍体 ,二倍体罕见。近来通过激光扫描细胞计数器 (ＬＳＣ)和其他技术 ,研究了大量新生隐球菌菌株 ,发现单倍体菌株中有少量双倍体存在。菌种来源于千叶大学的真菌研究中心和微生物毒学中心的保存株及刚从鸽粪中分离的新生隐球菌。于含 1%酵母浸膏、1%蛋白胨、1%葡萄糖(ＹＰＧ )液基中 30℃振荡过夜至对数生长期。用Ｓｋｅｒｍａｎ显微操作器分离每一菌株的单个大、小细胞至土豆葡萄糖琼脂培养基 30℃培养。长出的菌落转种至沙氏培养基斜面。用 70 %乙醇固定来自…     

80株中国大陆新生隐球菌环境株表型和分子特征的初步研究

目的了解中国大陆地区新生隐球菌环境株的分布情况,及其表型和基因型特征。方法采用CACA培养基培养1372份来自中国大部分地区私人和公共养鸽场所的鸽粪标本,分离出新生隐球菌,并对其表型和基因型特征进行分析。结果共分离出80株新生隐球菌,分离阳性率约为5．5％,所有菌株37℃生长良好,有完整荚膜,尿素酶试验阳性。ITS序列分析证实分离出的新生隐球菌均属于血清型A。M13-PCR显示,其基因型为我国及东南亚地区特征性的VNIC型,显示了与临床株的高度一致性。结论中国大陆地区的新生隐球菌临床株与环境株显示了高度的同源性,提示对于易感人群,阻断与相应环境的接触可有效预防新生隐球菌的感染。     

新生隐球菌产黑素野生株和白化突变株的比较研究

新生隐球菌是一重要条件致病菌,其黑素对毒力的影响已经得到广泛的证实,而酚氧化酶是催化产生黑素的酶类, CNLAC1是编码新生隐球菌酚氧化酶的结构基因, Willimson等分离纯化了该酶 [1],并据其 N末端氨基酸序列克隆了编码其合成的 cDNA序列和染色体基因 [2];自然界中存在野生株和天然突变株,本研究应用 PCR技术检测天然变异株突变情况,旨在进行野生产黑素株与白化突变株的比较研究。 泳道 1为 Marker,泳道 2为野生株,泳道 3为 突变株 (引物 3)图 2 PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶 结构基因 泳道 1为 Marker,泳道 2为野…