抗纤灵方对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路的影响

目的:研究中药复方抗纤灵对单侧输尿管梗阻(UUO)所致肾纤维化大鼠TGF-β1-Smad通路的影响,借以初步探讨其发挥疗效的作用机制。方法:雄性SD大鼠18只随机分为3组,假手术组、模型组、中药治疗组。用单侧输尿管结扎术建立大鼠肾纤维化模型,抗纤灵治疗两周后检测梗阻肾羟脯氨酸含量;HE染色和电镜观察肾组织病变;采用RT-PCR检测肾组织TGF-β1 mRNA水平;蛋白免疫印迹法检测肾组织转化生长因子I型受体(TβRI)、转化生长因子II型受体(TβRII)、Smad2蛋白表达及磷酸化变化。结果:与假手术组比较,模型组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显增多;病理观察可见肾小球毛细血管基底膜明显增厚,间质成纤维细胞和胶原沉积明显增多;肾组织TGF-β1mRNA及TβRI、TβRII蛋白表达显著增多,Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均显著增多。与模型组比较,中药干预组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显减少;肾小球和肾小管基底膜仅见轻度增厚,间质成纤维细胞和胶原沉积较模型组减轻;肾组织TβRI、TβRII蛋白表达明显下调,Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均明显下调。结论:抗纤灵可抑制单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路,抑制梗阻肾TβRI、TβRII、Smad2蛋白表达及Smad2蛋白磷酸化,从而改善梗阻性大鼠的肾间质纤维化,减少纤维化肾脏中胶原蛋白含量。     

抗纤灵方对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路的影响

目的： 研究中药复方抗纤灵对单侧输尿管梗阻（UUO）所致肾纤维化大鼠TGF-β₁-Smad通路的影响，借以初步探讨其发挥疗效的作用机制。方法: 雄性SD大鼠18只随机分为3组，假手术组、模型组、中药治疗组。用单侧输尿管结扎术建立大鼠肾纤维化模型，抗纤灵治疗两周后检测梗阻肾羟脯氨酸含量；HE染色和电镜观察肾组织病变；采用RT-PCR检测肾组织TGF-β₁ mRNA水平；蛋白免疫印迹法检测肾组织转化生长因子I型受体（TβRI）、转化生长因子II型受体（TβRII）、Smad2蛋白表达及磷酸化变化。结果: 与假手术组比较，模型组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显增多；病理观察可见肾小球毛细血管基底膜明显增厚，间质成纤维细胞和胶原沉积明显增多；肾组织TGF-β₁ mRNA及TβRI、TβRII蛋白表达显著增多，Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均显著增多。与模型组比较，中药干预组大鼠梗阻肾羟脯氨酸含量明显减少；肾小球和肾小管基底膜仅见轻度增厚，间质成纤维细胞和胶原沉积较模型组减轻；肾组织TβRI、TβRII蛋白表达明显下调，Smad2蛋白磷酸化及总蛋白表达水平均明显下调。结论: 抗纤灵可抑制单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β₁-Smad通路，抑制梗阻肾TβRI、TβRII、Smad2蛋白表达及Smad2蛋白磷酸化，从而改善梗阻性大鼠的肾间质纤维化，减少纤维化肾脏中胶原蛋白含量。     

单侧输尿管梗阻大鼠肾脏岩藻糖基转移酶8的表达变化

目的: 探讨岩藻糖基转移酶8(FUT8)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型肾脏中表达及意义。方法: 90只雄性Wistar 大鼠随机分为正常对照组(control组)、假手术组(sham组)和UUO组,分别在术后1 d、3 d、7 d、14 d和21 d处死,检测各组大鼠肾功能情况;PAS与Masson染色观察大鼠肾间质病理形态学改变;RT-PCR和Western blotting检测各组大鼠肾组织不同时点FUT8 mRNA及蛋白的表达;免疫荧光检测大鼠肾组织不同时点FUT8和活化素受体样激酶5(ALK5)的分布以及表达;免疫组化检测大鼠肾脏纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果: 与control组相比,UUO组大鼠血肌酐及尿素氮于术后3 d开始升高(P<0.05),第21 d升至最高(P<0.01);UUO3 d开始肾间质可见明显炎症细胞浸润,14 d出现明显肾小管萎缩,21 d可见明显肾间质纤维化。FUT8的mRNA表达与蛋白水平表达于术后3 d出现上升并随梗阻时间延长逐渐增加(P<0.05),分别于14 d及21 d达到最高峰(P<0.01); ALK5在肾小管的表达与FUT8一致,呈正相关(r=0.87,P<0.05),且两者分布一致,共表达区域随着肾纤维化进展逐渐增加。FN、Col I和α-SMA表达于术后第3 d出现上升并随梗阻时间延长逐渐增加(P<0.05),且与FUT8呈正相关(r=0.80,r=0.76,r=0.89,P<0.05)。结论: 在肾间质纤维化的进展中,FUT8与ALK5表达呈时空一致性升高,可能与肾间质纤维化程度密切相关。     

Sonic hedgehog信号通路在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达变化及意义

 目的：探讨Sonic hedgehog（Shh）信号通路在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾组织中的表达变化及意义。方法：将48只SD大鼠随机分为UUO模型组（n=24）和假手术组（n=24）,梗阻术3、7和14 d后取其梗阻侧肾脏组织。用HE和Masson染色检测肾间质纤维化程度,免疫组织化学染色检测Shh通路分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1及III型胶原的蛋白表达,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测肾组织中TGF-β₁和Shh含量,real-time RT-PCR检测TGF-β₁、I和III型胶原及Shh通路分子mRNA表达。结果：HE和Masson染色显示,梗阻侧肾组织出现明显的纤维化病变,且随时间延长而加剧。TGF-β₁、I和III型胶原含量在梗阻肾中表达明显增高（P<0.05）。同时,Shh信号通路分子Shh、Smo和Gli mRNA和蛋白在梗阻肾中表达明显升高（P<0.05）,而Ptch1 mRNA和蛋白的表达下调（P<0.01）,提示Shh信号被激活。相关分析表明,Shh信号起始信号Shh水平的升高与TGF-β₁含量增加呈明显的相关。结论：UUO大鼠诱导肾间质纤维化发生过程中,Shh信号通路分子被激活,推测可能的机制是活化的Shh信号通路诱导TGF-β₁表达和释放,导致肾间质纤维化。     

结缔组织生长因子在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达

目的：检测大鼠单侧输尿管梗阻（UUO）模型不同时期，肾组织中结缔组织生长因子（CTGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，观察比较在间质纤维化不同阶段，3者的动态变化及关系。 方法： 采用雄性SD大鼠36只，分为假手术组和模型组，模型组行左侧输尿管结扎术，再分3、7、14、21和28 d共6组，每组6只，于各时点处死大鼠，取肾组织，常规HE、Masson染色，按小管间质损害的特征进行半定量评分。免疫组化检测CTGF、TGF-β1和α-SMA表达。 结果： 随梗阻时间的延长，小管间质纤维化加重，28 d间质已基本被纤维化组织所代替。随间质纤维化程度的加重，CTGF和α-SMA表达逐渐增加，两者与小管间质损害积分呈正相关，CTGF与α-SMA的表达之间也呈正相关。TGF-β1表达在7-14 d达高峰后，逐渐减少，但仍高于对照组。 结论： UUO致CTGF表达增加可能与TGF-β升高有关，CTGF可能通过促进间质中肌成纤维细胞的形成而参与肾间质纤维化。     

纤维连接蛋白在肾间质纤维化大鼠肾组织中的表达

背景：纤维连接蛋白表达增加在肾间质纤维化疾病进展过程中发挥着的重要作用。 目的：观察纤维连接蛋白在肾间质纤维化大鼠肾组织中的表达。 方法：72只大鼠随机等分为对照组、假手术组和模型组。模型组建立单侧输尿管梗阻模型;假手术组仅开腹游离左侧输尿管;对照组不做任何处理。 结果与结论：与对照组及假手术组比较,模型组大鼠梗阻时间越长,肾小管间质损害程度越重,纤维化越明显,肾组织中纤维连接蛋白、基质金属蛋白酶9和转化生长因子β1表达即明显增多,且随着梗阻时间延长,肾组织中纤维连接蛋白、基质金属蛋白酶9和转化生长因子β1表达呈持续增加趋势,至造模后第14天达到高峰,与同期对照组、假手术组相比差异有显著性意义(P < 0.01),说明在大鼠肾纤维化形成过程中,纤维连接蛋白的蛋白表达在肾损伤早期即显著增加,并随肾间质纤维化程度加重而逐步升高,从而促进肾纤维化的发生。而基质金属蛋白酶9的高表达可能是加重肾间质损害的因素之一。     

低密度脂蛋白受体相关蛋白在肾间质纤维化模型中的表达

目的:探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白在肾间质纤维化中的表达变化及意义。方法:雄性Wistar大鼠随机分为假手术组,模型3、6、9、12d组和血管紧张素转换酶抑制剂(依那普利)治疗9d组。Masson染色结合半定量评分测小管-间质损伤指数,免疫组化确定低密度脂蛋白受体相关蛋白在肾脏的表达部位;蛋白印迹分析检测肾组织内结缔组织生长因子,低密度脂蛋白受体相关蛋白水平。结果:低密度脂蛋白受体相关蛋白阳性表达主要在肾间质和肾小球系膜区中,在单侧输尿管梗阻模型中随观察时间延长逐渐增加,于第9d达高峰;并且第9d依那普利治疗组大鼠肾内低密度脂蛋白受体相关蛋白水平显著少于模型组(P<0.01);相关分析显示,在模型组中低密度脂蛋白受体相关蛋白和结缔组织生长因子蛋白水平呈正相关(r=0.786,P<0.01);低密度脂蛋白受体相关蛋白水平与肾小管间质损伤指数呈正相关(r=0.800,P<0.01)。结论:低密度脂蛋白受体相关蛋白作为结缔组织生长因子的受体蛋白,在大鼠肾间质纤维化模型中表达增加,可能参与肾间质纤维化过程。     

纤溶酶原激活物抑制剂1 siRNA对大鼠肺纤维化的治疗作用

 目的： 观察纤溶酶原激活物抑制剂1 （PAI-1）siRNA对博来霉素(BLM)诱导的大鼠肺纤维化的治疗作用,并初步探讨其机制。方法： 72只Wister大鼠分为4组,即对照组（control组）、BLM组、BLM+非特异 siRNA 组(BLM+N组)和BLM+PAI-1 siRNA组(BLM+P组)。BLM 5 mg/kg气管内滴入制作肺纤维化模型,control组注入等体积的生理盐水。造模后,于局麻下BLM+P组每周2次气管内注入PAI-1 siRNA 7.5 nmol (0.2 mL);BLM+N组注入相同剂量的非特异siRNA;control组和BLM组注入等体积的生理盐水,28 d共给药8次。分别于第7 d、14 d和28 d每组处死6只,左肺行肺泡灌洗测定PAI-1活性,右中叶肺组织RT-PCR法检测Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）的mRNA表达。结果： 造模后,7 d、14 d和28 d肺泡灌洗液中PAI-1活性持续升高,每周2次气管内注入PAI-1 siRNA可以使肺泡灌洗液中PAI-1的活性降低,与同一时点BLM组比较有明显差异（均P<0.05）;模型组7 d、14 d和28 d  Ⅲ型胶原、α-SMA和TIMP-1的mRNA表达明显增高,BLM+P组3个时点Ⅲ型胶原、α-SMA和TIMP-1的mRNA表达明显减少,分别与同一时点BLM组比较有明显差异（均P<0.05）。结论： 每周2次气管内给予PAI-1 siRNA可以持续减少PAI-1表达。PAI-1 siRNA不但直接抑制肺纤维化进展,而且可以打破基质金属蛋白酶及组织抑制因子之间的平衡。     

结缔组织生长因子在单侧输尿管梗阻大鼠肾脏中的表达及其意义

目的： 观察结缔组织生长因子（CTGF）在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型中的动态表达，探讨CTGF在肾小管间质纤维化中的作用机制。方法： 将48 只Wistar大鼠随机分为UUO组和假手术（SO）组，采用左输尿管结扎术复制UUO模型，于术后1、3、7、14 d分别处死2组大鼠取左肾。采用Masson染色评定肾小管间质损伤程度；逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 方法检测肾组织转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、CTGF、Ⅰ型胶原（ColⅠ）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）mRNA表达；免疫组织化学方法测定TGF-β₁、CTGF、ColⅠ、PAI-1表达；Western blotting方法检测CTGF蛋白表达量的变化。结果: UUO术后1d，梗阻肾TGF-β₁ mRNA表达开始升高，第3-14d时升高更显著（P<0.01），CTGF、ColⅠ、PAI-1 mRNA水平随之逐渐升高。免疫组织化学染色发现，UUO大鼠肾小管和间质区域CTGF表达随病程进展逐渐增强；相关分析显示，UUO术后第7d，CTGF表达量与肾小管间质损伤指数、肾小管间质TGF-β₁、ColⅠ、PAI-1表达强度均呈正相关，相关系数（r）分别为0.62、0.85、0.78和0.76（均P<0.01）。Western blotting结果显示，CTGF蛋白水平在术后第3d开始上升，随病程进展更显著。结论: CTGF可通过促进细胞外基质产生和抑制细胞外基质降解双重途径诱导肾小管间质纤维化的发生和进展。     

低氧刺激结缔组织生长因子表达与肾间质纤维化

目的：观察低氧对结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响，探讨低氧致肾间质纤维化的机制。方法： 单侧输尿管结扎（UUO）9 d大鼠动物模型，用RT-PCR方法检测肾组织中低氧标记分子-低氧诱导因子（HIF-1α）的mRNA水平，免疫组化方法观察假手术组及模型组肾组织中HIF-1α和CTGF的表达及部位，Western蛋白印迹技术检测肾组织CTGF的蛋白水平。体外实验，正常大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）分别置于低氧（1%O2）和正常氧条件下培养6 h，应用RT-PCR和Western蛋白印迹检测CTGF mRNA和蛋白表达水平。结果： 对照组肾组织未能检测到HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表达；模型组肾组织有高水平HIF-1α mRNA，并出现HIF-1α蛋白表达，主要分布在小管-间质细胞；CTGF蛋白与HIF-1α蛋白表达部位及程度一致；低氧（1% O2）培养刺激NRK-49F细胞表达CTGF mRNA和蛋白。结论： 低氧刺激的CTGF的表达增加与肾间质纤维化的发生有关。     

PPAR�� Agonist and Angiotensin II Receptor Antagonist Ameliorate Renal Tubulointerstitial Fibrosis

The peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)γ agonist is used as antidiabetic agent with antihyperglycemic and antihyperinsulinemic actions. Beyond these actions, antifibrotic effects have been reported. We examined antifibrotic effects of PPARγ agonist and interaction with angiotensin receptor antagonist in the unilateral ureteral obstruction (UUO) model. After UUO, mice were divided to four groups: no treatment (CONT), pioglitazone treatment, L158809 treatment, and L158809+ pioglitazone treatment. On day 14, CONT mice showed severe fibrosis and all treated mice showed decreased fibrosis. The immunohistochmistry of PAI-1, F4/80 and p-Smad2 demonstrated that their expressions were increased in CONT group and decreased in the all treated groups compared to CONT. PAI-1 and p-Smad2 determined from Western blotting, among treated groups, was decreased compared to CONT group. The expression of TGF-β1 from real time RT PCR showed markedly increased in the CONT group and decreased in all treated groups compared to CONT. These data suggest the pioglitazone inhibited tubulointerstitial fibrosis, however, the synergism between pioglitazone and L158809 is not clear. Considering decreased expression of PAI-1 and TGF-β/Smad2 in the treated groups, PAI-1 and TGF-β are likely linked to the decreased renal tubulointerstitial fibrosis. According to these results, the PPARγ agonist might be used in the treatment of renal fibrotic disease.     

Transforming growth factor-beta-dependent and -independent pathways of induction of tubulointerstitial fibrosis in beta6(-/-) mice

Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and the renin-angiotensin-aldosterone system are key mediators in kidney fibrosis. Integrin alphavbeta6, a heterodimeric matrix receptor expressed in epithelia, binds and activates latent TGF-beta1. We used beta6 integrin-null mice (beta6(-/-)) to determine the role of local TGF-beta1 activation in renal fibrosis in the unilateral ureteral obstruction (UUO) model. Obstructed kidneys from beta6(-/-) mice showed less injury than obstructed kidneys from wild-type (WT) mice, associated with lower collagen I, collagen III, plasminogen activator inhibitor (PAI-1), and TGF-beta1 mRNA levels and lower collagen content. Infusion with either angiotensin II (Ang II) or aldosterone (Aldo) or combination in beta6(-/-) UUO mice significantly increased collagen contents to levels comparable to those in identically treated WT. Active TGF-beta protein expression in beta6(-/-) mice was less in UUO kidneys with or without Ang II infusion compared to matched WT mice. Activated Smad 2 levels in beta6(-/-) obstructed kidneys were lower than in WT UUO mice, and did not increase when fibrosis was induced in beta6(-/-) UUO mice by Ang II infusion. Anti-TGF-beta antibody only partially decreased this Ang II-stimulated fibrosis in beta6(-/-) UUO kidneys. In situ hybridization and immunostaining showed low expression of PAI-1 mRNA and protein in tubular epithelium in beta6(-/-) UUO kidneys, with increased PAI-1 expression in response to Ang II, Aldo, or both. Our results indicate that interruption of alphavbeta6-mediated activation of TGF-beta1 can protect against tubulointerstitial fibrosis. Further, the robust induction of tubulointerstitial fibrosis without increase in activated Smad 2 levels in obstructed beta6(-/-) mice by Ang II suggests the existence of a TGF-beta1-independent pathway of induction of fibrosis through angiotensin.     

Smad2/3信号蛋白在大鼠梗阻性肾病肾组织中的表达

目的:探讨Smad2/3信号蛋白在大鼠梗阻性肾病模型肾组织中的表达及可能作用。 方法:采用单侧输尿管结扎（UUO）模型，分别于造模后1、3、7、14、21和28 d取肾组织，用免疫组化法检测TGFβ₁、磷酸化Smad2/3和α-SMA在梗阻肾肾组织中的表达；用原位杂交方法检测梗阻肾组织TGFβ₁ mRNA的表达。结果:正常大鼠肾组织具有基础的TGFβ₁(4.32%±1.72%)和磷酸化Smad2/3［(19.31±5.37）个/mm2］的表达，α-SMA只表达于血管平滑肌，肾小管-间质无表达。UUO术后1 d，TGFβ1的表达无明显增加(5.15%±2.08% vs对照组，P>0.05)，第3 d明显增加(13.55%±6.33% vs 对照组，P<0.01)，第7 d达高峰(26.78%±8.77% vs 对照组，P<0.01)，此后表达减少；磷酸化Smad2/3的表达在UUO术后3 d明显增加［(67.95±13.87）个/mm2 vs 对照组，P<0.01］，并持续增加到第7 d［（150.61±27.34）个/mm² vs 对照组，P<0.01］，此后表达减少；而UUO术后3 d肾组织α-SMA表达亦明显升高（5.58％±1.23％ vs 对照组，P<0.01），7 d达到高峰（13.43％±3.32％ vs 对照组，P<0.01），14 d表达开始下调；UUO术后肾间质细胞外基质的沉积随着疾病的进展而进行性增加，第28 d达到最高峰。梗阻肾肾组织中TGFβ₁、磷酸化Smad2/3以及α-SMA的表达时相一致并呈明显正相关（r₁=0.932, P<0.01；r₂=0.946, P<0.01），并与肾间质区域细胞外基质的积聚密切相关。 结论:磷酸化Smad2/3信号蛋白在大鼠梗阻性肾病肾组织中的表达明显增高，可能在肾间质纤维化的过程中起重要作用。     

Attenuation of renal fibrosis by proteasome inhibition in rat obstructive nephropathy: possible role of nuclear factor kappaB

We previously reported that pyrrolidine dithiocarbamate blocked nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) activation and attenuated interstitial inflammation and tubulointerstitial fibrosis in the rat obstructive nephropathy. Since pyrrolidine dithiocarbamate is an anti-oxidant and possesses additional biological properties, present experiment was conducted to clarify further the role of NF-kappaB in the development of tubulointerstitial fibrosis in obstructed kidney using a proteasome inhibitor that blocks NF-kappaB through stabilizing IkappaB, an endogenous inhibitor of NF-kappaB. At 5 days following unilateral ureteral obstruction (UUO) in rats, obstructed kidney exhibited tubulointerstitial fibrosis that was associated with macrophage infiltration. UUO decreased renal cortical IkappaB protein contents with concomitant increases in NF-kappaB DNA-binding activity and gene expression of monocyte chemoattractant protein-1. Administration of PSI, N-benzyloxy-carbonyl-Ile-Glu (O-t-Bu)-Ala-leucinal, a proteasome inhibitor, (3 mg/kg/day, s.c., b.i.d) to UUO rats inhibited proteasome activity and attenuated the changes in IkappaB content, NF-kappaB activity and MCP-1 mRNA expression observed in UUO rats. PSI also decreased macrophage influx and attenuated the development of fibrosis. Furthermore, up-regulated gene expression of pro-fibrogenic molecules observed in the obstructed kidney was attenuated by PSI. These results further support the notion that NF-kappaB plays an important role in the development of renal fibrosis in the obstructive nephropathy.     

依那普利对大鼠早期肾间质纤维化的影响

目的：观察依那普利对早期肾间质纤维化形成大鼠的疗效,并探讨其作用机制。方法：将60只雄性SD 大鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻模型组和依那普利治疗组（每组20只）,治疗组于手术后第4天开始以依那普利灌胃,术后第14天取各组大鼠肾组织分别行HE染色和Masson染色,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原、III型胶原在肾组织的蛋白表达。应用Real-time PCR方法检测肾组织中Ⅰ型胶原、III型胶原、血小板源生长因子(platelet drived growth factor,PDGF)-B、转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β1、结缔组织生长因子（cennective tissue growth factor,CTGF）mRNA的水平。应用Western免疫印迹方法检测PDGF-B蛋白的表达。结果：依那普利治疗组大鼠肾脏的肾间质损伤指数、肾间质胶原评分、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原,以及细胞因子PDGF-B,TGF-β1,CTGF的表达均比模型组明显下降（均P<0.05）。结论：依那普利可通过下调细胞因子PDGF-B,TGF-β1,CTGF的表达而起到治疗单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的作用。