何首乌、骨碎补和淫羊藿的植物雌激素作用研究

目的:观察研究抗骨质疏松中药何首乌、骨碎补和淫羊藿三种中药的粗提物及其主要单体成分通过雌激素受体(estrogen receptor α/β,ERα/β)对靶基因的转录调节作用,发现这三种中药中植物雌激素作用的物质成分.方法:采用脂质体瞬时转染的方法,利用转染雌激素受体表达质粒的HeLa细胞,观察这三种中药的粗提物及其主要单体化合物对雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)报告基因的转录激活作用.结果:这三种中药粗提物及其主要成分均可不同程度的通过ERα和/或ERβ激活ERE报告基因的转录.结论:抗骨质疏松中药何首乌主要活性成分大黄素、骨碎补中的柚皮苷和淫羊藿中的淫羊藿苷具有显著的植物雌激素作用,并且对ERβ的选择性更强.     

孕马尿提取物中4种化学成分的雌激素活性研究

目的研究孕马尿提取物中4种化学成分的雌激素活性。方法研究4种成分3β-羟基-5α-16-孕甾烷-20-酮(3β-hydroxy-5α-pregn-16-en-20-one,HP)、5β-孕甾烷-3β,16α,20α-醇(5β-pregnane-3β,16α,20α-triol,PT)、3β,16α-脱氢-5α-孕甾烷-20-酮(3β,16α-dihydroxy-5α-pregnan-20-one,DHP)、3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮(3β-hydroxy-5α-androstan-17-one,HA)对人乳腺癌细胞MCF-7的细胞增殖效应(Escreen实验);利用Luciferase报告基因与雌激素反应元件重组,与转染对照质粒pRL-cmv、雌激素受体ERα或ERβ质粒共同瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞CHO,构建雌激素活性筛选模型,检测四种成分的雌激素活性。结果 E-screen实验结果显示,HP、PT、DHP、HA在1~50μmol·L-1内均能诱导MCF-7细胞增殖,显示出雌激素活性。与雌二醇(17α-estrodiol,E2)的增殖效应(proliferative effect,PE)、相对增殖效应(relative proliferative effect,RPE)和EC50相比,HP、PT、DHP、HA的雌激素活性均小于E2的雌激素活性。Luciferase报告基因实验结果显示,HP、PT、DHP、HA在1~50μmol·L-1内均能诱导Luciferase表达,显示雌激素活性。与E2的EC50值相比,HP、PT、DHP、HA的雌激素活性均弱于E2的雌激素活性。结论 HP、PT、DHP、HA均具有雌激素活性,与E2的雌激素活性相比,四种化合物均发挥弱雌激素效应。     

染料木素对离体豚鼠乳头肌生理特性的影响

目的观察比较染料木素(genistein,Gen)和17β-雌二醇(17β-estradiol,Est)对豚鼠乳头肌生理特性影响,研究Gen对豚鼠离体心肌的兴奋作用与肌质网Ca2+释放和摄取的关系。方法将乳头肌置于装有K-H液的灌流肌槽中,加入药物观察其生理特性及收缩活动的变化。结果Gen及17β-雌二醇浓度为1和10μmol·L-1均不影响肾上腺素诱发的心肌自律性,二者在50μmol·L-1时均能抑制自律性;Gen浓度为50μmol·L-1能降低心肌兴奋阈强度,Gen(1和10μmol·L-1)及17β-雌二醇(1～50μmol·L-1)不影响兴奋性阈强度;Gen(1～50μmol·L-1)不影响心肌功能不应期(FRP),17β-♂二醇(1～50μmol·L-1)延长心肌FRP;同时发现1～50μmol·L-1的17β-雌二醇抑制心肌的收缩活动,但同浓度的Gen可增强心肌的收缩活动。利罗丁(ryanodine)受体阻断剂钌红(10μmol·L-1)和利罗丁(1nmol·L-1)预处理可部分阻断Gen(50μmol·L-1)对心肌收缩的增强效应,利罗丁(20μmol·L-1)使Gen正性肌力作用完全阻断。肌质网钙泵阻断剂thapsigargin(1μmol·L-1)预处理也可部分抑制Gen(50μmol·L-1)对心肌收缩的兴奋作用。但特异性雌激素受体(ER)阻断剂ICI182,780(10μmol·L-1)和Na+-Ca2+逆交换抑制剂Kb-R7943(1μmol·L-1)预处理不影响Gen(50μmol·L-1)的正性肌力作用。结论Gen和17β-雌二醇均能降低心肌兴奋性和自律性,但Gen增强其收缩活动,而17β-雌二醇作用相反;Gen正性肌力作用与心肌细胞膜上的ER和Na+-Ca2+逆交换无关,可能与肌质网内Ca2+的释放和摄取有直接的关系。     

选择性雌激素受体调节药对雌激素受体α/β活性的诱导作用

目的：探讨选择性雌激素受体调节药(SERMs)对雌激素受体(ER)α/β活性的诱导作用。方法：通过基因转染方法将pSVhER和荧光素酶报道基因载体ER Etk Luc瞬时共转染至乳腺癌细胞株MDA MB 231，转染后的细胞分别用1 nmol·L 1 17β雌二醇(E2)、17αE2、雌酮、雷洛昔芬、4羟基 他莫昔芬(4OH TAM)和柠檬酸他莫昔芬处理细胞24 h，采用荧光素酶报道基因分析方法测定ERα/β活性。结果： 雷洛昔芬和他莫昔芬具有明显激活ERα活性作用，他莫昔芬对ERβ活性的诱导作用明显较ERα弱，雷洛西芬几乎不诱导ERβ活性。结论：SERMs主要是通过激活ERα发挥抗雌激素作用，而对ERβ的诱导作用明显较弱。     

异补骨脂素的植物雌激素作用及其机制的探讨

目的利用雌激素受体(estrogenic receptor,ER)阳性乳腺癌T47D细胞和ER阴性乳腺癌MDA-MB231细胞观察异补骨脂素(isopsoralen)的雌激素样作用,并探讨其可能的作用靶点和机制。方法以ER拮抗剂ICI182,780为工具药,采用MTT细胞增殖实验观察异补骨脂素对T47D和MDA-MB231细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测细胞周期分布的变化。同时,利用实时荧光定量PCR法及流式细胞术检测异补骨脂素对T47D细胞pS2 mRNA及蛋白表达情况的影响。结果1×10-6mol·L-1和1×10-7mol·L-1异补骨脂素能够促进T47D细胞增殖,提高细胞分裂增殖指数,且该作用可被ICI182,780所拮抗;1×10-6mol·L-1和1×10-7mol·L-1异补骨脂素对MDA-MB231细胞增殖无影响。PCR及流式蛋白检测结果显示:1×10-6mol·L-1和1×10-7mol·L-1异补骨脂素可使pS2 mRNA和蛋白表达增加,同时加入ICI182,780可部分拮抗异补骨脂素对pS2表达的诱导和促进作用。结论异补骨脂素具有植物雌激素作用,该效应可通过作用于靶细胞雌激素受体途径实现。     

葛根素对小鼠长骨雌激素受体α(ERα)表达的影响

目的:研究葛根素对长骨骺板雌激素受体亚型ERα分布及含量的影响,并与内源性雌激素作用相比较,探讨葛根素对骨的作用机制。方法:取16 d胎龄雌性小鼠前肢尺骨,置于BGJb培养基中,葛根素(10-6,10-5和10-4 mol·L-1)和雌二醇(10-6 mol·L-1)作用48 h后固定脱钙,HE染色,光镜下计数骨干破骨细胞数及肥大区软骨细胞数;免疫组织化学染色,光镜下观察阳性细胞定位,图像分析系统下测定免疫反应阳性细胞数和阳性细胞面积。结果:葛根素组及雌二醇组与空白对照组相比软骨均增粗、变长,静止区、增殖区和肥大区细胞数目增多,骨化区破骨细胞数量减少。空白对照组骺板肥大区有ERα免疫反应阳性的软骨细胞,表达较弱,静止区、增殖区几乎没有表达。经葛根素或10-6 mol·L-1的雌二醇作用48 h后,与空白对照组相比,肥大区表达明显增强,静止区、增殖区也均有ERα表达,葛根素作用明显弱于雌二醇。结论:葛根素能够促进软骨内成骨,其作用可能与其上调ERα的表达有关。     

利用哺乳动物细胞双杂交体系研究仙灵骨葆对雌激素受体的作用

目的:利用哺乳动物细胞双杂交体系研究仙灵骨葆对雌激素受体(ERs)活性的影响。方法:通过MTT法检测仙灵骨葆对Hela细胞活力的影响,并构建含有ERs配体结合域(LBD)的质粒pCMV-BD及含有报告基因Lusferase的质粒pFR-Luci,将二者与内标质粒pFRTlaczeo共转染到Hela细胞中,形成Gal4DBD-ERa和ERb LBD细胞杂交报告系统。以染料木苷为阳性对照验证本杂交系统,并利用本系统考察仙灵骨葆对ERs活性的影响。结果:仙灵骨葆在25～2 500 ng·mL-1浓度范围内可以促进HeLa细胞的增殖。10μmol．L-1染料木苷可以显著提高Gal4DBD-ERα和ERβLBD细胞杂交报告系统中ERa和ERb的活性,证明本系统构建成功。仙灵骨葆对ERa具有浓度依赖性的激活作用,2500 ng·mL-1浓度时ERa的相对荧光活性是DMSO对照组的18倍;仙灵骨葆对ERb也具有一定的激活作用,2500 ng·mL-1浓度时ERb的相对荧光活性是DMSO对照组的4倍。结论:本研究成功构建了含有雌激素受体配体结合域的细胞杂交系统,仙灵骨葆对该系统的ERs具有激活作用。     

刺槐素对乳腺癌T47D细胞增殖的影响

目的研究刺槐素对乳腺癌T47D细胞增殖的影响,探究刺槐素雌激素样作用的主要介导受体。方法磺酰罗丹明B(SRB)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期的变化,q PCR检测雌激素受体-α(ERα)、雌激素受体-β(ERβ)、细胞增殖抗原标记物(Ki67)mRNA表达,Western blot法检测ERα、ERβ蛋白表达。结果刺槐素浓度为0.001~10μmol·L~(-1),能促进T47D细胞增殖,使S和G_2/M期的细胞比例明显增加,增殖指数升高,同时增加Ki67 mRNA的表达,此作用可被雌激素受体拮抗剂ICI 182.780所拮抗。刺槐素及17β-雌二醇(E2)均可上调ERα和ERβ的表达,刺槐素联合ERα受体拮抗剂(MPP)可逆转刺槐素的促增殖作用,使S和G_2/M期的细胞比例明显降低,减少Ki67mRNA的表达;但刺槐素联合ERβ受体拮抗剂(PHTPP)处理虽可抑制细胞增殖效应,使S和G_2/M期的细胞比例降低,减少Ki67 mRNA的表达,但作用不明显。结论刺槐素具有雌激素样作用,在0.001~10μmol·L~(-1)浓度范围内,可通过调节ERα受体表达来促进T47D细胞的增殖。     

槲皮素、补骨脂素对人乳腺癌T47D细胞两种受体亚型表达的影响

目的探讨槲皮素和补骨脂素的雌激素作用以及调控雌激素受体亚型表达的作用机制。方法10μmol.L-1槲皮素和10μmol.L-1补骨脂素分别处理T47D细胞48 h,采用RT-PCR和Western blot方法测定对雌激素依赖性乳腺癌细胞T47D雌激素受体亚型ERα和ERβ表达的影响,并以雌激素受体拮抗剂ICI182,780为工具药来评价槲皮素和补骨脂素发挥雌激素样作用与雌激素受体的关系。结果槲皮素、补骨脂素在10μmol.L-1可明显诱导T47D细胞ERαmRNA和蛋白表达,而对ERβ表达没有影响。当与ICI182,780共孵育T47D细胞ERα表达被拮抗。结论槲皮素、补骨脂素产生的促进ER阳性细胞增殖的雌激素样作用是通过增加ERα表达实现的。     

槲皮素、补骨脂素对乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响

目的探讨槲皮素(quercetin,Que)和补骨脂素(psor-alen,Pso)对人类乳腺癌细胞株增殖的影响。方法采用流式细胞术和蛋白印迹法检测槲皮素和补骨脂素对雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7的影响,并以雌激素受体拮抗剂ICI182,780为工具药来评价槲皮素和补骨脂素发挥雌激素样作用与雌激素受体的关系。结果①槲皮素、补骨脂素在10μmol.L-1可使MCF-7细胞增殖指数明显升高,增加S期细胞的比例,与10-3μmon.L-1E2阳性对照组的变化趋势一致。当ICI182,780分别与E2、金雀异黄素、槲皮素、补骨脂素共孵育48 h后,E2、金雀异黄素、槲皮素、补骨脂素的增殖效应被抑制,细胞周期S期细胞数比例下降,G0/G1期细胞数比例上升。②10μmol.L-1槲皮素和10μmol.L-1补骨脂素均上调MCF-7细胞ERα蛋白水平,而对ERβ蛋白表达没有影响;当分别与ICI182,780共孵育MCF-7细胞ERα蛋白表达被拮抗。结论槲皮素和补骨脂素具有雌激素活性,此作用是通过雌激素受体(ER)介导的;产生的类似金雀异黄素促进MCF-7细胞增殖的作用是通过增加ERα表达实现的。     

CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖中的相互作用

目的通过观察不同剂量的CCK-8对吗啡依赖SH-SY5Y细胞模型内源性阿片系统的影响,初步探讨CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖过程的相互作用及其机制。方法建立吗啡慢性依赖SH-SY5Y细胞模型,应用放射配基结合技术观察μ阿片受体(MOR)结合特征,应用Real-Time PCR技术检测前脑啡肽原(PENK)、前阿黑皮质素原(POMC)基因的表达,并观察CCK-8对上述指标的影响。结果①10μmol·L-1吗啡作用于全反式维甲酸(RA)分化6d的SH-SY5Y细胞48h,成功建立了慢性吗啡依赖模型;②CCK-8可剂量依赖性地抑制MOR的结合,并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受体拮抗剂(L-364,718,LY-288,513)翻转;③10-7、10-6mol·L-1CCK-8使PENK、POMC的表达较正常组分别增加(5.81±0.84)、(7.26±1.55)倍和(4.55±0.73)、(5.16±0.82)倍。吗啡依赖后,PENK、POMC表达较正常组下降(0.43±0.10)倍和(0.37±0.07)倍,10-8、10-7、10-6mol·L-1CCK-8使下调的PENK、POMC表达增加,PENK与正常组的相对表达值为(0.63±0.10)、(0.86±0.21)、(1.17±0.19),POMC与正常组的相对表达值为(0.46±0.10)、(0.60±0.11)、(0.96±0.11)。10-10、10-9mol·L-1CCK-8对PENK、POMC表达无影响。结论低剂量(10-10、10-9mol·L-1)CCK-8可通过激活CCK受体抑制MOR的结合力,对PENK、POMC的表达无影响;高剂量(10-8～10-6mol·L-1)的CCK-8可使PENK、POMC基因表达增加,促进内源性阿片肽的生成,并可改善吗啡依赖后内源性阿片系统的失衡。     

17β-雌二醇对豚鼠心室肌细胞L型钙电流的抑制作用

目的观察17β-雌二醇对豚鼠心室肌细胞L型钙电流的影响及其与雌激素受体(estrogen receptor,ER)的关系。方法酶机械法分离豚鼠单个心室肌细胞;膜片钳全细胞模式观察17β-雌二醇对单个心室肌细胞L型钙电流(ICa-L)的影响,并通过加入雌激素受体阻断剂tamoxifen(TAM)研究该作用与雌激素受体的关系。结果 17β-雌二醇(10-9～10-7mol.L-1)使ICa-L峰电流密度值从(-3.5±0.6)pA.pF-1分别减少至(-2.4±0.3)pA.pF-1、(-1.9±0.3)pA.pF-1和(-1.1±0.3)pA.pF-1(与对照组比较,均为P<0.01,n=5)。TAM(10-7 mol.L-1)预处理后,17β-雌二醇(10-7mol.L-1)使ICa-L峰电流密度值从(-3.5±0.6)pA.pF-1减少到(-1.0±0.2)pA.pF-1(与对照组比较,P<0.01,n=5),与未应用TAM(10-7 mol.L-1)预处理时比较,ICa-L峰电流密度值无变化(P>0.05,n=5)。结论 17β-雌二醇抑制豚鼠心室肌细胞ICa-L的作用呈浓度依赖性,雌激素受体阻断剂TAM不能阻断17β-雌二醇对豚鼠心室肌细胞ICa-L的抑制作用,提示17β-雌二醇对ICa-L的抑制作用可能与ER作用无关。     

新型雌激素哌嗪雌酚酮对雌激素受体表达的影响及其对靶基因的转录激活作用

目的探讨哌嗪雌酚酮对雌激素受体表达的影响及其对靶基因ERE的转录激活作用。方法小鼠去卵巢后,每天灌服不同剂量的哌嗪雌酚酮(0.5、1、2mg.kg-1)以及雌酚酮(0.71mg.kg-1),连续42d,采用免疫组织化学的方法观察哌嗪雌酚酮对去卵巢小鼠子宫中两种雌激素受体(ERα和ERβ)蛋白表达的影响;采用Tfx-50脂质体共转染目的基因和报告基因于MCF-7细胞株,探讨哌嗪雌酚酮对ERE的转录激活作用。结果与去卵巢模型组比较,哌嗪雌酚酮各剂量组能够上调子宫组织中两种雌激素受体亚型的表达(有剂量依赖性),对ERα亚型作用明显于ERβ;哌嗪雌酚酮能够激活雌激素受体的经典信号途径,与等摩尔剂量的雌酚酮相比仅表现出弱雌激素活性。结论哌嗪雌酚酮能够上调子宫组织中ERs的表达;与雌酚酮比较,其对靶基因ERE的转录激活作用非常微弱。     

八肽胆囊收缩素抑制LPS诱导的RAW264.7细胞AP-1活性及IL-6表达

目的研究八肽胆囊收缩素(CCK-8)对LPS诱导RAW264.7细胞IL-6表达的影响及相关机制。方法用ELISA及RT-PCR法检测RAW264.7细胞IL-6蛋白及mR-NA表达;用EMSA方法检测RAW264.7细胞AP-1 DNA结合活性。结果①LPS可时间依赖性的诱导RAW264.7细胞IL-6蛋白及mRNA表达;②10-10 mol.L-1 CCK-8对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6表达无明显影响;10-8、10-6 mol.L-1 CCK-8浓度依赖性地抑制了LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6表达;③10-10 mol.L-1 CCK-8未影响LPS诱导的AP-1活性,10-8、10-6 mol.L-1 CCK-8浓度依赖性地抑制了LPS诱导的AP-1活性。结论 CCK-8通过抑制AP-1 DNA结合活性而抑制了LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6表达,这可能是CCK-8发挥抗炎作用的信号转导机制之一。     

丹参酮ⅡA抗乳腺癌细胞增殖作用研究

目的利用雌激素受体(estrogenic receptor,ER)阳性乳腺癌T47D细胞和ER阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞观察丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)对细胞增殖活性的影响及其对雌激素受体亚型的调节功能。方法以ER拮抗剂ICI182,780为工具药,采用MTT细胞增殖实验观察1×10-6mol.L-1和1×10-7mol.L-1丹参酮ⅡA对T47D和MDA-MB-231细胞增殖的影响。利用实时荧光定量PCR法及流式细胞术检测其对T47D细胞ERα和ERβmRNA及蛋白表达情况的影响。结果丹参酮ⅡA能够抑制T47D细胞增殖,且该作用可被ICI182,780部分拮抗;对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用较其对T47D细胞的作用更为明显。丹参酮ⅡA可使T47D细胞ERα和ERβmRNA和蛋白表达明显增加,并使ERα/ERβ比值有所上升。结论丹参酮ⅡA具有抑制乳腺癌细胞增殖的作用,抑制强度与对其ER亚型的调节作用相关。     

Toxic effects of TCDD on osteogenesis through altering IGFBP-6 gene expression in osteoblasts

Since 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) has reproductive and developmental toxicity as an estrogen antagonist, we investigated the effects of TCDD on osteogenesis in rat skeleton and the human female-responsive osteoblastic osteosarcoma cell line SaOS-2. Rat fetuses were exposed to 5, 10, or 15 microg/kg TCDD on gestation day (GD) 10. TCDD dose-dependently induced single or multiple rat fetal skeletal development malformations in vivo. In vitro, 10 nM TCDD significantly inhibited cell proliferation in the presence of 1 microM 17-beta-estradiol (E2) in SaOS-2 cells. Insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP-6), as a crucial regulator in IGF system, plays an important role in osteogenesis and bone function. TCDD (15 microg/kg) induced a dramatic 3-fold increase in IGFBP-6 mRNA expression in rat fetal calvaria on GD 21. On the other hand, the concurrent treatment of 10 nM TCDD and 1 muM E2 resulted in a significant increase in IGFBP-6 mRNA and protein after 24 h in SaOS-2 cells, but TCDD and (or) E2 had no effect on the mRNA level of cytosolic aromatic hydrocarbon receptor. The functional estrogen-responsive element (ERE) [5'-CCT TCA CCT G-3'] (-9 to +1) in the IGFBP-6 promoter region was identified in this study for the first time as the ER genomic binding site. Collectively, these results suggest that TCDD can alter the expression of IGFBP-6 gene and exerts growth-inhibitory effects on osteogenesis. In addition, TCDD exhibits an anti-estrogenic effect through its interference with the binding of activated estrogen-liganded ER to the functional ERE in IGFBP-6 gene promoter.