乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白的研究

0 引言基因组研究自从开展以来,已经取得了举世瞩目的成就。随着基因组测序工作的完成,接下来就是研究基因的功能。因为基因是通过蛋白质之间的相互作用而发挥功能的,蛋白质之间的相互作用是很多生命现象的基础,故基因表达的蛋白质的功能研究尤为重要。乙型肝     

突变乙型肝炎病毒核心蛋白的克隆及表达

目的 克隆并表达发生长片段缺失的HBV核心蛋白(HBV-C)基因,并对其进行DNA序列、蛋白质结构和抗原性分析.方法 采用PCR方法从1株野生型HBV基因组中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,克隆至pUCm-T质粒,进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析;再将基因编码区克隆至原核表达载体pET-28a,构建含HBV-C基因的重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达并检测其抗原性.结果 PCR扩增出的HBV-C基因长度经序列分析表明,其核苷酸序列缺失了220 bp至317 bp之间的98个碱基,造成从第74个氨基酸起发生移码突变并失去了抗原性.结论 成功克隆和表达了发生长片段缺失的HBV-C基因.     

噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究

目的：通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(core promoter，CP)结合蛋白，为HBV复制机制和调控机制的研究探索新的途径。方法：应用噬菌体展示技术，以HBV的核心启动子的聚合酶链反应(PCR)产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程，经噬斑的PCR扩增后。构建克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果：噬菌体经富集后，随机筛选得到7个阳性克隆．成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了和HBV启动子结合的肝细胞蛋白基因序列，分别编码β2微球蛋白和3种未知功能蛋白。结论：用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV核心启动子结合的蛋白，分析了该蛋白的编码基因，为进一步研究HBV与肝细胞相互作用的分子生物学机制开辟了新的途径。     

乙型肝炎病毒核心相关抗原

乙型肝炎病毒(HBV)是一种结构复杂、易发生突变而不易清晰洞察和难以掌握控制的病毒.它以出生这一人类延续过程为其传播环节即感染持续机制,造成母婴传播、感染持续并表现有地区性偏倚特征.目前,乙型肝炎75%局限于亚洲,特别是我国的HBV流行率高达50%,而HBsAg携带率平均亦达7.18%.估计后者人口之1/3～1/4处于发病或潜伏活动状态,部分病例终极后果是进展为肝硬化和肝癌.     

乙型肝炎病毒核心启动子的结构及调节研究

0引言 乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的疾病,呈全球性分布,目前全世界有3.5亿人感染乙型肝炎病毒(HBV),其中相当一部分感染者发展为慢性肝炎,少数还发展为肝硬化甚至肝癌,至今仍缺乏有效控制[1-5].造成这一局面的原因很多,其中关于HBV与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制的研究进展相对滞后是严重影响新型治疗技术和新型药物开发与研究的重要原因之一.进一步弄清HBV DNA的复制、转录及调节的过程,对于我们研究乙型肝炎的发病机制具有重要意义.本文仅就乙型肝炎病毒核心启动子(CP)结构及调节近几年的研究进展作一综述.     

乙型肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究

0引言随着基因组测序工作的完成,后面就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能的物理基础之一,即蛋白质起作用是通过与另一蛋白质进行物理接触而完成.大家知道乙型肝炎病毒(HBV),对人体有着广泛的作用,如引起人免疫紊乱?慢性肝炎?肝硬化?肝肿瘤发生,治疗效果不佳[1-9],但是他们是如何作用的目前不是太清楚,但是可以肯定其中具有蛋白质-蛋白质之间的相互作用.1990年代以来一系列遗传?生化方法特别是酵母双杂交技术等进展,为研究HBV与人体…     

乙型肝炎病毒核心DNA疫苗研究进展

第一代乙型肝炎疫苗是从乙型肝炎表面抗原(HBsAg)无症状携带者血清中分离HBsAg颗粒,经灭活后制成的乙型肝炎血源疫苗;第二代乙型肝炎疫苗即为HBSAg基因重组疫苗,该疫苗可诱导体液免疫应答产生中和抗体,但不能诱导细胞免疫应答,     

乙型肝炎病毒大蛋白的研究进展

乙型肝炎是世界性的常见病、多发病，据有关资料显示，全世界约有3亿乙型肝炎病毒感染者，仅中国就有约1亿人，且每年新增3000万乙型肝炎患者。长期以来，临床上检测乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染情况及判断肝脏损伤情况主要有HBV血清标志物和肝功能，HBV血清标志物则是检测人体对HBV的体液免疫反应状态，肝功能是判断机体免疫系统对肝细胞的损伤情况。     

乙型肝炎病毒核心蛋白突变体干扰HBV包装的实验研究

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白突变体基因的真核表达载体，转染HepG2细胞，观察其表达及干扰HBV颗粒包装的显性负调节作用。方法：采用PCR从质粒pHBVadrl-A1中扩增HBVadr1-A1中扩增HBV C基因和S基因，分别克隆到pGEM-T载体上，构建成pGEM-T-C和pGEM-T-S，进而构建成pGEM-T-CS载体，用HindⅢ切出克隆基因片段与pcDNA3.1连接，经PCR鉴定后构建成真核表达载体pcDNA3.1^ -CS,DNA测序显示基因融合正确，表达载体转染HepG2细胞，经G418筛选得到高拷贝转化子，逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测重组蛋白体外表达，用HBV阳性血清感染HepG2细胞，72h后提提细胞内HBV DNA，斑点杂交法分析各组DNA，结果：核心蛋白突变体在HepG2细胞内得到表达，且表达了该重组蛋白的HepG2细胞内HBV DNA量不同程度地低于对照组，表明重组蛋白具有抗HBV包装的DN突变体作用，结论：HBV核心蛋白与表面蛋白融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-CS能够体外表达核心蛋白突变体，该突变体具有干扰HBV颗粒包装的显性负调节作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白

0 引言1989年应用分子生物学技术发现了丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV),并证实可导致肝脏慢性疾病,是输血后肝炎的主要病因.全世界有1.7亿人感染 HCV,面临肝硬化和肝细胞癌的威胁.随着基因组测序工作的完成,随后就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能     

丙型肝炎病毒核心蛋白DNA结合区的测定

目的 阐明丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的DNA结合特性及其意义。方法 在大肠杆菌中表达谷胱甘肽转移酶（GST）融合HCV核心蛋白不同长度片段,并进行纯化。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过更换缓冲液的方法将这些蛋白片段相对固定在凝胶中,用γ－^32P[4667-0091]ATP标记人工合成的DNA进行2次电泳,通过放射自影检测核心蛋白的DNA结合区。结果 HCV核心蛋白N端第10－16位氨基酸残基和第46－70位氨基酸残基可独立地结合DNA,核心蛋白既能和单链DNA结合又能和双链DNA结合,对单双链DNA的结合域相同。对所结合的DNA序列无选择性。结论 HCV核心蛋白的N端含有两个DNA结合区,结合区序列与核内转移信号的部分重迭以及对结合靶DNA序列的非选择性可能是HCV核心蛋白具有多功能的基础。     

乙型肝炎病毒核心蛋白原蛋白转化酶切割假定产物的体外研究

目的 通过体外试验探讨furin切割核心蛋白的可能性,并通过重组载体表达,研究其假定产物在HepG2细胞内的分布特点. 方法 重组HBV核心蛋白,并将其在不同温度和时间条件下(4℃消化16 h、30℃消化1h和30℃消化3h)接受furin切割,产物采用Western blot分析.构建HBV核心蛋白furin切割假定产物的真核表达载体,并以完整核心蛋白表达载体作为对照,转染HepG2细胞,获得稳定表达细胞株.使用核心蛋白与假定产物共同区的单克隆抗体进行间接免疫荧光染色,用共聚焦显微镜观察其细胞内分布. 结果 HBV核心蛋白在多种条件下均被furin切断,其主要产物相对分子质量约为15 000,与预期相符,且30℃切割1 h的效果最好.真核表达的核心抗原假定切割产物能与核心蛋白单克隆抗体结合,且在细胞内的分布与完整核心蛋白类似,主要以颗粒形式分布在细胞质. 结论 HBV核心蛋白在体外能被furin切割,其主要产物与完整核心蛋白有类似的免疫原性和相同的细胞内分布,提示furin或其家族成员参与了HBV复制调节,其切割产物对机体抗病毒免疫可能存在深远影响,值得深入研究.     

乙型肝炎病毒全S蛋白结合蛋白基因的筛选

HBV与肝硬化、肝细胞癌的发生发展密切相关[1],通过其表达的病毒蛋白与肝细胞蛋白相互作用导致疾病进展.本研究中,我们对全S基因编码产物功能进行了探讨,并以其为靶蛋白,利用酵母双杂交技术寻找其与肝细胞相互作用的蛋白质,以进一步探讨HBV致病机制.     

乙型肝炎病毒前-X融合蛋白结合蛋白的筛选

目的利用酵母双杂交技术自肝细胞cDNA文库中筛选HBV前-X(pre-X)融合蛋白结合蛋白,探讨pre-X融合蛋白的生物学功能。方法 PCR扩增HBV pre-X基因序列,根据酵母双杂合体系构建诱饵质粒pDEST32-pre-X,并测定DNA序列验证。将质粒pDEST32-pre-X转化为酵母细胞MaV203,应用Western blot验证pre-X融合蛋白在酵母细胞中正确表达,再与转化为人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞pDEST22配合,在营养缺陷型培养基和X-gal上三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的猎物质粒进行DNA测序。利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对筛选结果进行分析。结果成功构建pDEST32-pre-X诱饵质粒,Western blot证实转化诱饵质粒的酵母细胞能正确表达pre-X融合蛋白,pDEST32-pre-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养出45个菌落,经缺陷培养基分离及X-gal检测后筛选出3个阳性克隆,测序结果为一种蛋白,即TCP1蛋白。结论用酵母双杂交技术筛选出1个与pre-X融合蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白,为进一步研究HBV pre-X融合蛋白的作用提供了新线索。     

热休克蛋白与乙型肝炎病毒相关性疾病

自上个世纪90年代以来,人们对热休克蛋白在乙型肝炎病毒相关性疾病中的作用进行了一些研究,发现其在HBV感染后的免疫过程、肝损伤、肝纤维化、细胞因子改变和肝细胞调亡等方面发挥作用。本文主要从基础研究的角度,讨论HBV感染后上述发病的主要环节与热休克蛋白的关系。