母鼠高氟摄入对仔鼠颅骨成骨细胞的影响

目的观察高氟摄入对大鼠所生仔鼠颅骨及成骨细胞超微结构变化,探讨氟中毒与成骨细胞细胞周期和细胞凋亡的关系。方法常规饮食条件下,给雌鼠自由饮用含氟化钠0、50、100、150mgL蒸馏水2个月,随后与正常雄鼠交配,取仔鼠颅盖骨及成骨细胞做光镜和电镜检查;应用流式细胞术检测仔鼠成骨细胞凋亡的百分率和细胞周期。结果氟中毒仔鼠颅骨骨基质增生,胶原纤维堆积,排列紊乱,甚至断裂。成骨细胞异常增生。粗面内质网扩张,部分线粒体嵴断裂或消失,核出现凋亡特征。饮水中氟化钠浓度为150mgL,对成骨细胞OB的细胞周期和细胞凋亡均有影响,使S期细胞数增多,G2M期细胞减少;凋亡细胞百分率明显增多。结论过多的氟化物可以通过胎盘屏障直接作用于仔鼠颅骨成骨细胞,引起成骨细胞结构、细胞周期的改变,并可致细胞凋亡。     

氟对体外培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞的毒性作用

目的探讨NaF对体外培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞细胞周期和琥珀酸脱氢酶(SDH)、5′-核苷酸酶(5′-NT)、酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。方法体外分离纯化培养获得纯度达98%以上的大鼠大脑皮层星形胶质细胞(特异性抗GFAP免疫化学鉴定),分别用浓度为1、2和5mmol/LNaF对星形胶质细胞染毒12、24、48和72h,FCM检测细胞周期构成比,紫外比色法检测SDH、5′-NT、ACP活性。结果FCM分析细胞周期显示:1～5mmol/L剂量范围内,NaF能够以剂量依赖方式诱导星形胶质细胞周期由S期阻滞向G2/M期阻滞转变,随着时间延长变化更明显,超出这一范围则主要为subG1期细胞。紫外比色法检测结果表明,NaF抑制SDH、ACP活性,2mmol/L范围内对5′-NT活性影响无显著性(P0.1),增加剂量5′-NT失活;SDH、ACP活性与subG1DNA期细胞相对含量显著负相关(SDH:r=-0.84148,P0.05;ACP:r=-0.90416,P0.01)。结论NaF可诱导星形胶质细胞细胞周期阻滞及凋亡,并可抑制其SDH、5′-NT、ACP活性。     

氟化物对大鼠成骨细胞增殖分化的影响

目的：研究不同浓度氟化物对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。方法：大鼠颅骨分离的成骨细胞经不同浓度（10μmol/L-4mmol/L）的氟化钠作用后，采用AlamarBlue^TM摄入法检测细胞增殖；ELISA方法测定碱性磷酸酶活性。结果：低浓度氟化钠（100μmol/L-1mmol/L）在体外可刺激细胞增殖，高浓度氟化钠（2mmol/L以上）可抑制细胞增殖；10μmol/L-50μmol/L的NaF增强细胞ALP活力，100μmol/L以上的NaF降低了细胞ALP活力。结论：氟化物对成骨细胞的增殖与分化具有双向作用，即低浓度促进，高浓度抑制。     

甲醛对淋巴细胞亚型影响及机制研究

采用脾细胞体外研究方法,用流式细胞仪法进行小鼠淋巴细胞亚型、细胞凋亡及细胞周期的检测。结果显示,随着甲醛浓度的升高,CD4+CD8-细胞百分数呈先降低再升高的趋势,与对照组比较差异无统计学意义;细胞亚群CD4-CD8+细胞百分数下调;20、100和500μmol/L剂量组细胞凋亡发生率显著高于对照组;与对照组相比,500μmol/L组G0/G1细胞明显减少,S期细胞明显增多,而G2/M期细胞基本不变。提示甲醛可能通过G2/M期细胞周期阻滞引起脾细胞CD8+T亚群凋亡的增加,进而影响细胞的免疫功能。     

甲基丙烯酸环氧丙酯对人支气管上皮细胞周期及凋亡影响的研究

目的探讨甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)对人支气管上皮细胞周期及凋亡的影响。方法人支气管上皮细胞(16HBE)经1~16μg/ml剂量的GMA染毒不同次数后,应用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期及凋亡率的改变,同时测定细胞分裂指数(MI)。结果经1次染毒处理后,随着染毒剂量的增加,G0/G1期细胞显著减少(P<0.01),S期和G2/M期细胞显著增加,凋亡细胞数增多,细胞分裂指数下降;随着染毒次数的增加,各剂量组细胞周期均明显阻滞于G0/G1期,但高剂量组细胞仍表现出S期和G2/M期增多现象;经3次染毒后,高剂量组细胞出现凋亡率下降、分裂指数升高现象。结论经GMA染毒处理后,16HBE细胞周期由G0/G1期向S期和G2/M期移动而呈现增殖性改变。     

亚砷酸钠对角质形成细胞增殖力和细胞周期的影响

目的　研究不同浓度亚砷酸钠 (NaAsO2 )对人皮肤永生化角质形成细胞 (HaCaT)增殖活力及细胞周期的影响。方法　以体外培养的HaCaT细胞株为对象 ,用不同浓度的NaAsO2 处理细胞 ,用AlamarBlue摄入法定量检测细胞增殖情况 ,用流式细胞仪测定细胞周期分布。结果　NaAsO2 浓度小于 10 μmol L时 ,AlamarBlue的还原率明显高于对照组 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,5 0 μmol L时 ,还原率明显下降 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;10 μmol L组G0 G1 期比例减少 ,S期和G2 M期比例增高。各组凋亡率差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　低浓度NaAsO2 可促进HaCaT细胞的增殖 ,高浓度可抑制其增殖活力 ;一定浓度的NaAsO2 可使合成期细胞增多。     

硫酸铟对L929细胞周期及细胞凋亡的影响

目的探讨硫酸铟对小鼠成纤维细胞(L929)细胞周期和细胞凋亡的影响。方法用四氮唑蓝比色法(MTT),检测L929的存活情况;采用流式细胞仪检测硫酸铟对L929细胞周期、细胞凋亡(染毒浓度分别为1.5、3.0、4.5mmol/L,染毒时间为24h)的影响。结果硫酸铟可改变L929细胞周期及细胞凋亡率。细胞周期表现为S期细胞增多,而处于G1期的细胞减少,提示硫酸铟可能具有影响L929细胞周期的作用,进而抑制细胞增殖;硫酸铟可增加细胞凋亡率。结论硫酸铟可引起L929细胞毒性,细胞存活率呈浓度-时间依赖性下降;硫酸铟可影响细胞周期和诱导细胞凋亡。     

氟化钠对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响

目的 探讨氟化钠(NaF)对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响.方法 以0、10-2、10-1、1、10、102、5×102、103、5×103、104、2×104、4×104 μmol/L NaF染毒MG-63细胞,培养48 h.采用MTI实验观察NaF对MG-63细胞增殖能力的影响,以流式细胞技术检测MG-63细胞周期变化.结果 MTr实验结果显示,MG-63细胞开始有增殖活性时的NaF浓度为102 μmol/L,增殖活性最大时的浓度为5×103 μmol/L,增殖活性受到抑制时的浓度为2×104 μmol/L.流式细胞技术检测结果显示,采用MTT实验中确定的3个关键浓度染毒细胞48 h后,高剂量(2×104 μmol/L)组的MG-63细胞凋亡率最高(6.001％),细胞增殖指数(PI)最低(0.339);中剂量(5×103μmol/L)组的细胞凋亡率最低(2.220％),PI最高(0.632);低剂量(102 μmol/L)组的PI及细胞凋亡率均与对照组无明显差异.结论 NaF对成骨细胞具有双向作用,低浓度下促进细胞增殖,超过一定浓度后因其增殖抑制而使细胞凋亡增加.     

三氧化二砷诱导人横纹肌肉瘤RD细胞株凋亡的实验研究

[目的]研究三氧化二砷(As2O3)体外抑制人胚胎型横纹肌肉瘤细胞株RD(RD细胞株)增殖及诱导凋亡的作用. [方法]以不同浓度的As2O3处理RD细胞株,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞的DNA含量及凋亡率. [结果]4～8 μmol/L hs2O3能以时间剂量依赖的方式抑制RD细胞株的增殖,并诱导其凋亡,在流式细胞仪DNA线条图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰”,细胞周期阻滞于G0/G1期,S期和G2/M期细胞减少;低浓度As2O3(＜2μmol/L)则有轻微促增殖作用,细胞周期向S期和G2/M期集中,G0/G1期细胞减少. [结论]As2O3浓度≥4μmol/L时,可明显抑制RD细胞株的生长并促进细胞凋亡,其临床应用还需进一步研究.     

氟对大鼠成骨细胞氧化应激和8-羟基脱氧鸟苷生成影响

目的 研究氟化钠(NaF)对大鼠成骨细胞氧化应激及8-0基脱氧鸟苷(8-OHdG)生成的影响.方法 取大鼠颅骨离体分离培养成骨细胞,经不同浓度NaF(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L)处理24、48和72h后,测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活力及脂质过氧化物丙二醛(MDA)、DNA氧化损伤产物8-OHdG的水平.结果 ①染氟的3个时段,各NaF组细胞内GSH-Px活力均较对照组显著下降,高剂量(2.00、4.00mmol/L)组细胞MDA水平升高,8-OHdG生成增多(均P<0.05);(2)SOD活力:染氟24 h时各剂量组细胞内SOD活力较对照组下降(P<0.05),而染氟48 h未观察到有明显变化,染氟72 h时,0.25至2.00 mmol/L各组较对照组增高,4.00mmol/L组较对照组下降(均P<0.05);③通过相关性分析显示GSH-Px活力与8-OHdG水平呈负相关关系(r=-0.92,P<0.01).结论　一定剂量的NaF可致大鼠成骨细胞发生脂质过氧化并造成DNA氧化损伤,同时也能降低细胞内抗氧化酶活力.     

氟对成骨细胞增殖分化的影响及维生素C的拮抗作用

目的　研究不同剂量的氟对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞增殖分化的影响及维生素C的拮抗作用。方法　酶消化法分离成骨细胞 ;AlamarBlue摄入法检测细胞增殖 ;ELISA方法测定碱性磷酸酶 (ALP)活力。结果　氟化钠浓度 0 .10～ 1.0 0mmol L刺激细胞增殖 ,细胞活力明显增强 ,与对照组相比差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;2 .0 0mmol L以上细胞活力下降 ,抑制细胞增殖 ;0 .0 1～ 0 .0 5mmol L增强细胞ALP活力 ,0 .10mmol L以上降低细胞ALP活力 ,与对照组相比 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。加入维生素C ,2mmol L氟化钠仍能促使细胞增殖分化。结论　氟对成骨细胞的增殖与分化具有双向作用 ;维生素C能拮抗较高浓度氟化钠对成骨细胞增殖分化的抑制。     

硒和锌对氟致大鼠肾脏细胞凋亡及增殖周期变化的影响

目的 研究一定剂量的硒和锌对氟引起的大鼠肾脏细胞凋亡和细胞增殖周期变化的作用。方法 给Wstar大鼠饮用含50mg／L氟化钠的高氟水,同时通过灌胃方式给予不同剂的硒和锌制剂。6个月后,用TUNEL法和流式细胞术检测大鼠肾脏细胞凋亡和细胞增殖周期的变化。结果 氟能明显诱导大鼠肾脏细胞凋亡,并使G2／M期细胞明显下降,DNA相对含量（DNARC）也显著下降。一定剂量的硒和锌制剂对氟诱导拓大鼠肾脏细胞凋亡具有明显的拮抗作用,而且能明显抑制氟引起的G2／M期细胞减少,但对氟引起的DNARC下降却无明显拮抗作用。结论 氟可诱导大鼠肾脏细胞凋亡并可使细胞增殖周期改变;硒和锌制剂对氟诱导的大鼠肾脏细胞凋亡和细胞增殖周期的变化具有一定的拮抗作用。     

氟化钠对L02人正常肝细胞衰老及相关蛋白表达影响的实验研究

目的 研究氟化钠（NaF）是否会诱导人肝细胞 L02衰老及衰老相关标志蛋白水平的改变。方法 不同浓度 (0、1、2、3、4、5、6、7和8mmol/L) NaF 处理 L02人正常肝细胞,CCK-8 法检测细胞存活率的变化以筛选 NaF 的作用浓度;衰老标志物 β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase, β-Gal) 染色检测衰老阳性细胞;实时荧光定量 PCR (Real-time PCR) 和蛋白免疫印迹 (Western Blot) 测定细胞衰老标志蛋白 p16,p21 mRNA 和蛋白的表达水平;流式细胞术分析细胞周期的变化情况。结果 CCK-8 结果显示,NaF 浓度为 1、4、7mmol/L时 L02细胞的存活率（87.38±0.93、66.72±2.81、52.17±2.04）均低于对照组［(100.00±0.00),均 P<0.01］,且每组之间的细胞存活率差异存在统计学意义（均 P<0.01）,因此 NaF 选用1、4、7 mmol/L 处理L02细胞作为低氟组、中氟组、高氟组开展研究;β-半乳糖苷酶染色结果显示,低、中、高氟组中细胞衰老率 (23.15±0.23、36.06±0.40、65.36±0.82)均高于正常组［(3.27±0. 27),P<0.01］;Real-time PCR 结果显示,p16、p21 mRNA在低、中、高氟组中表达(2.29±0.19、3.44±0.30、5.25±0.32;1.88±0.22、3.22±0.24、7.33±0.30)表达均高于正常对照组［(1.00±0.00;1.00±0.00),均P<0.01］。低、中、高氟组中p16蛋白水平(93.68±3.40、116.25±7.30、122.31±3.00)均高于对照组［(78.07±4.17),P<0.05,P<0.01,P<0.01),低、中、高氟组中p21蛋白水平(87.61±5.22、121.62±4.27、147.95±7.81)均高于对照组［(61.32±4.56),均P<0.01)］;流式结果显示,低、中、高氟组 L02 细胞周期均停滞在 G2 期,与对照组相比,差异具有统计学意义 (P<0.01)。结论 NaF 处理的人肝细胞 L02 中细胞衰老率及衰老标志蛋白 p16、p21 的 mRNA 和蛋白表达升高,这可能提示了 NaF 可导致 L02 细胞衰老,进一步说明细胞衰老在氟化物诱导的肝损伤中可能具有重要作用。     

7-硝基吲唑对氟致SH-SY5Y细胞凋亡及一氧化氮合成酶含量的影响

目的探讨神经元型一氧化氮合成酶(nNOS)抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)对氟致体外培养细胞生长、凋亡保护作用的机制。方法体外培养SH-SY5Y细胞,在培养液中加入不同浓度Na F(0、0.02、0.2、2.0、4.0 mmol/L),分别培养24、48、72 h,同时在各组细胞培养液中联合应用7-NI(10~(-4)、10~(-3)、10~(-2) mmol/L);于倒置显微镜下观察细胞生长,以CCK-8试剂盒方法检测细胞存活率,以比色法和硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO含量及NOS活力,以流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果与对照组比较,氟浓度为0.2 mmol/L(低氟组)和2.0 mmol/L(高氟组)时,24、48、72 h后细胞存活率分别下降至(83.76±1.04)%,(70.27±1.20)%,(54.40±0.98)%和(52.17±1.07)%,(40.60±1.11)%,(29.50±1.40)%。10~(-4)mmol/L 7-NI可刺激细胞增殖,24 h细胞存活率为(105.96±3.44)%;10~(-3) mmol/L 7-NI处理细胞24 h后的细胞存活率为(100±2.30)%;10~(-2) mmol/L 7-NI可使细胞存活率下降,24 h细胞存活率为(88.64±4.75)%。10~(-4)、10~(-3)、10~(-2) mmol/L 7-NI处理细胞24 h后细胞培养液中NO含量、NOS活力均降低,分别为(1.156±0.356)、(0.958±0.074)、(0.672±0.188)μmol/L和(0.403±0.089)、(0.398±0.010)、(0.103±0.076)U/ml。高剂量(10~(-2) mmol/L)7-NI组的SH-SY5Y细胞凋亡指数升高至(8.7±2.3)%,高于对照组(P0.05);低剂量(10~(-4)、10~(-3) mmol/L)7-NI组的凋亡指数分别为(0.6±0.4)%和(1.0±0.2)%,与对照组差异无统计学意义(P0.05);低剂量7-NI组凋亡指数低于高剂量组,差异有统计学意义(P0.05)。染氟24、48、72 h后细胞培养液中NO含量及NOS活力升高,低氟组的NO含量、NOS活力分别为(3.074±0.160)、(5.604±1.374)、(10.173±1.307)μmol/L和(0.743±0.122)、(0.959±0.054)、(1.446±0.12)U/ml,高氟组分别为(8.974±0.919)、(14.729±1.241)、(20.976±0.712)μmol/L和(1.086±0.024)、(1.728±0.130)、(2.583±0.192)U/ml,高于对照组[(1.320±0.280)、(2.420±0.658)、(2.867±0.662)μmol/L,(0.452±0.012)、(0.517±0.072)、(0.607±0.013)U/ml],差异有统计学意义(P0.05)。与氟单独处理组相比,NaF联合应用7-NI后,各组NO含量及NOS活力均下降,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,氟可使SH-SY5Y细胞凋亡指数升高,差异有统计学意义(P0.01),并随着氟染毒剂量及时间的增加,细胞凋亡指数随之增加;联合应用7-NI后,各组细胞凋亡指数下降,差异有统计学意义(P0.01)。氟可使SH-SY5Y细胞数量减少,形态变为圆形、不规则形,细胞存活率降低;低剂量(10~(-4)、10~(-3) mmol/L)7-NI组在相同视野下细胞数增加,高剂量(10~(-2) mmol/L)7-NI组细胞数明显减少,大部分细胞呈圆形或不规则形。结论氟中毒所致细胞凋亡可能与NOS活力和NO含量升高有关,7-NI可降低细胞凋亡指数。     

大鼠成骨细胞系ROB-1的建立及氟对其DNA损伤的实验研究

目的 建立永生化大鼠成骨细胞系ROB－1并探讨氟对其DNA的损伤。方法 用酶消化法原代分离SD胎鼠颅骨成骨细胞，用Lipofect AMINE作载体对其转染SV40大T基因，并经PCR法鉴定大T细胞整合情况。采用碱性磷酸酶染 鉴定转染细胞系中成骨细胞的纯度；采用单细胞凝胶电泳（SCGE）方法检测2.0-3.0mmol/L氟化钠染毒24h对成骨细胞DNA损伤情况。结果 转染后成骨细胞的基因组中整合有SV40 T基因，碱性磷酸酶染色阳性细胞占95％以上；单细胞凝胶电泳发现NaF可不同程度地诱导细胞DNA链断裂，与溶剂对照组相比，各剂量组DNA断裂细胞百分率彗尾长度均有统计学意义的增加（P＜0.05）。结论 建立了永生化大鼠成骨细胞系ROB－1；氟对成骨细胞DNA有损伤作用。     

氟铝单独及联合染毒对MC3T3-E1细胞增殖能力及细胞周期的影响

目的 观察不同浓度的氟、铝对体外培养的小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E subclone 14)增殖及细胞周期的影响,以进一步阐明地方性氟中毒机制提供实验依据.方法 以10~(-9)～10~(-3)mol/LNaF染毒MC3T3-E1细胞,同时以50μmoI/L NaF及5μmol/L AICl3单独或者联合染毒MC3T3-E1细胞,培养72 h.应用CCK-8(cell counting kit-8)观察MC3T3-E1细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术检测MC3T3-E1细胞周期变化情况.结果 氟无显著促进MC3T3-E1细胞增殖的作用,较高浓度的氟(1 mmol/L)抑制MC3T3-E1细胞增殖(P<0.01).氟铝联合染毒显著刺激MC3T3-E1细胞增殖(P<0.01):G_2/M期细胞明显增多,增殖指数(PI)升高(P<0.05),DNA相对含量增高(P<0.05).结论 氟对MC3T3-E1细胞无显著促增殖作用,氟铝联合能显著提高MC3T3-E1的增殖能力,使G_2/M期细胞明显增多,促进成骨细胞的增殖分裂,细胞处于活跃生长状态.

Abstract：

Objective To explore the effects of different concentrations of fluoride, aluminum alone and in combination exposure on mice parietal bone cell subclone 14 (MC3T3-E subclone 14), and to elucidate the pathogenesis of endemic fluorosis. Methods The proliferation of MC3T3-E1 cells exposed to 10~(-9)-10~(-3)mol/L NaF alone, 50 μmol/L NaF and 5 (μmol/L AlCl_3 aloneand in combination ,was measured by CCK-8, and the change of cell cycle was measured by flow cytometry after treatment with various concentrations of fluoride and aluminum. Results Fluoride alone did not promote osteoblast MC3T3-E1 cells proliferation, higher concentration fluoride inhibited MC3T3-E1 cells proliferation. Fluoride and aluminum combined exposure (50 μmol/L NaF +5 μmol/L AlCl_3) stimulated proliferation of MC3T3-E1 cells (P<0.01 ).and significantly induced increase of G_2/M phase, PI (proliferation index) and DNA relative content. Conclusion Fluoride does not promote the MC3T3-cells proliferation, aluminium plus fluoride may increase MC3T3-E1 cells proliferation and affect the cell cycle, which can significantly increase the number of G_2/M phase cells.     

染氟成骨细胞差异表达基因的cDNA克隆

目的 探讨过量氟对成骨细胞基因表达的影响。方法 采用mRNA差异显示聚合酶链反应(DD-PCR)技术,对染氟2周(氟化钠2．0mmol／L)的成骨细胞与正常成骨细胞之间基因的差异表达进行比较分析。结果 在已克隆到的6个差异表达的基因片段中,大鼠核糖体蛋白15基因、大鼠Na^ -K^ -ATP酶β3基因、大鼠细胞核定位信号蛋白质受体α2基因和大鼠高尔基体p28基因在染氟成骨细胞中低表达,小鼠遍在蛋白缀合酶基因及我们发现的1个新基因片段在染氟成骨细胞中表达上调。结论 成骨细胞染氟后基因表达发生改变,这些基因多与蛋白质的合成、转运及加工有关,提示过量氟可通过改变这些基因的表达而影响成骨细胞的蛋白质合成。另发现1个与过量氟相关的新基因。     

氟中毒对大鼠肾脏脂质过氧化、细胞坏死、凋亡及增殖周期的影响

目的：研究氟中毒对大鼠肾脏细胞凋亡和对肾脏细胞增殖周期的作用,并研究氟中毒对肾脏氧化应激和肾脏损伤的影响。方法：给Wistar大鼠饮用含50mg/L氟化钠的高氟水,6个月后用TUNEL法和流式细胞术检测大鼠肾脏细胞凋亡和细胞增殖周期的变化。结果：氟中毒能诱导大鼠肾脏TUNEL阳性细胞,且凋亡细胞率较对照组明显增高,并使G2／M期细胞明显下降,DNA相对含量（DNARC）也显著下降。且氟中毒能引起大鼠肾脏氧化应激和组织损伤。结论：本研究提示氟中毒可诱导大鼠肾脏细胞凋亡并可使细胞增殖周期改变。