兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞转分化的实验研究

目的：在体外成功分离培养虹膜色素上皮细胞,并观察其在特定条件下转分化为晶体上皮细胞的现象.方法：采用酶辅助机械分离法分离并培养兔眼虹膜色素上皮细胞.传代过程中在DMEM培养基内加入苯硫脲、透明质酸酶、重组人成纤维细胞生长因子-4及L-抗坏血酸-2-磷酸完成转分化过程.分别对培养起始和终末的细胞进行光镜、电镜观察和免疫组化染色鉴定.结果：成功分离并培养出原代的虹膜色素上皮细胞,经过特定条件的培养最终转分化为晶体上皮细胞,免疫组化鉴定虹膜色素上皮细胞和晶状体上皮细胞均有其各自特异染色.结论：酶辅助机械分离法是进行虹膜色素上皮细胞原代培养较好的方法.在体外培养条件下,虹膜色素上皮细胞可转分化为晶状体上皮细胞,而透明质酸酶、苯硫脲、L-抗坏血酸-2-磷酸、重组人成纤维细胞生长因子-4等因素可能参与了对上述转分化过程的调节.     

人子宫内膜细胞的分离培养及鉴定方法的探索

目的　体外分离并培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。方法　用酶解、二次滤网过滤、沉降等方法进行分离、纯化及培养 10例正常子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞并传代 ,通过光镜进行形态学观察 ,用免疫细胞化学法进行细胞鉴定。结果　 9例标本获得成功 ,基质细胞纯度可达 95 %以上 ,腺上皮细胞的纯度约为 90 % ,分离出的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞可以在体外进行增殖。结论　采用二次滤网过滤法可以分离得到纯度较高的内膜腺上皮细胞和基质细胞 ,这两种细胞均能在体外成活并传代。     

小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和原代培养

目的 建立一种高效的子宫内膜上皮细胞分离和体外培养方法,为子宫疾病的发病机制或治疗药物筛选的进一步研究提供一个比较理想和有价值的的实验模型.方法 用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养小鼠子宫内膜上皮细胞,以上皮细胞角蛋白为抗原的免疫荧光法对分离培养的细胞进行纯度鉴定.结果 小鼠子宫内膜上皮细胞培养4～...     

人羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法。方法从足月分娩人胎盘剥离羊膜,采用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮细胞（hAECs）,采用免疫细胞化学、免疫荧光染色及流式细胞术分析其表型特征,使用含表皮生长因子LG—DMEM培养基培养。结果采用低速旋转胰蛋白酶消化法从羊膜分离的hAECs数为（6．13±1．42）×10^7,份（n=12）,所分离的hAECs明显表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物波形蛋白,不同程度地表达CD29、CD44和CD71。在表皮生长因子存在的条件下,hAECs生长增殖较快,培养至第6天细胞总数可增殖171倍。结论建立了人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法,hAECs具有上皮细胞的特异标志和间充质干细胞的某些表型特征。     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的 分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性.方法 采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定.透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况.结果 纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%.原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线.电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体.结论 通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料.两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异.     

牙源性角化囊性瘤上皮细胞的体外培养及鉴定

目的:建立牙源性角化囊性瘤上皮细胞体外培养体系并进行初步鉴定.方法:采用组织块及酶消化法原代培养牙源性角化囊性瘤上皮细胞,以无血清的角化上皮细胞培养基进行体外连续培养,并行细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定.结果:体外培养的牙源性角化囊性瘤上皮细胞为多角形,胞浆均匀,轮廓清晰,表现上皮细胞特有的铺路石样外观,体外可传2～4代,生长周期约30～50 d.经波形丝蛋白、广谱角蛋白及角蛋白10、角蛋白14免疫组化染色证实,分离培养的细胞为上皮来源,无间充质细胞混杂.结论:采用无血清的角化细胞培养基可在体外进行牙源性角化囊性瘤上皮细胞的连续培养.     

联合应用酶消化和机械刷洗提取气道上皮细胞的实验技术

采用低浓度胰酶对兔气道的上皮侧进行温和消化后用乳胶刷机械刷洗,获取兔气管、支气管上皮细胞进行原代培养。通过免疫细胞化学、电子显微镜等鉴定细胞,测定细胞成活率及细胞膜完整性,并与单纯机械刷洗及单纯酶消化进行比较。结果显示,用该实验技术获得的气管、支气管上皮细胞有较高的纯度和成活率,是一种实用、有效的小动物支气管上皮细胞分离方法     

人胚虹膜色素上皮细胞的初步培养和鉴定

目的:建立人胚虹膜色素上皮细胞(IPE)分离、纯化培养体系并进行鉴定,为进一步研究IPE提供实验基础.方法:取胎龄为15周左右新鲜水囊引产的人胚眼球,取下虹膜组织,用胰蛋白酶消化,将虹膜色素上皮细胞置于培养瓶中,2周后传代,倒置相差显微镜观察,并取对数生长期细胞分别用透射电镜和扫描电镜检查,用单克隆鼠抗角蛋白抗体(AE1/AE3)标记培养细胞进行鉴定.结果:用胰酶分离消化法,人胚虹膜色素上皮细胞易分离和贴壁.细胞形态与视网膜色素上皮细胞形态极为相似,表现为多边形和梭形两种形态,胞质内含色素颗粒,传代细胞内的色素颗粒比原代细胞的色素颗粒少.免疫细胞化学染色阳性,胞质内见棕黄色染色.结论:人胚虹膜色素上皮细胞分离、纯化的实现为IPE细胞生理功能和IPE移植的深入研究提供了可能.     

新生猪肾近曲小管上皮细胞的体外培养与鉴定

目的　分离新生猪肾小管上皮细胞进行体外培养 ,为研究围生期肾小管上皮细胞生物学行为特征提供理论基础。方法　采用机械分散结合 型胶原酶 (0 .5 g/ L)消化的方法纯化肾小管片段 ,选择含 10 %的 FCS低糖DMEM培养基 ,置于 5 %CO2 ,37℃孵箱培养。 0 .2 5 %胰蛋白酶用于肾小管上皮细胞纯化和传代培养。应用细胞形态学 (光镜和电镜 )、免疫细胞化学 (Pan CK和 CK18单抗 )和酶组织化学 (酸性磷酸酶和碱性磷酸酶 )方法进行肾近曲小管上皮细胞鉴定 ;用流式细胞术做细胞纯度鉴定。结果　出生 12～ 2 4小时的新生猪肾小球直径为 5 0～ 70 μm,出生5～ 6天的肾小球直径为 70～ 98μm。新生猪肾近曲小管上皮细胞体外培养对葡萄糖的需求量不高。培养成功并传 6～8代 ,肾小管上皮细胞纯度达 95 %～ 98%。综合形态学、免疫细胞化学和酶组织化学结果 ,支持细胞来源于肾单位的近曲小管。结论　采用机械分散 -酶消化纯化肾小管 ,0 .2 5 %胰蛋白酶纯化肾小管上皮细胞及低糖 DMEM培养新生猪肾近曲小管的方法是可行的。     

SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的:建立一种良好的SD大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法。方法:选用4周龄SD幼鼠的肾皮质进行细胞培养,采用机械研磨、胰酶消化、过滤,Percoll密度梯度离心法分离纯化肾小管后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养及传代。制作细胞爬片,用免疫细胞化学(Cytokeratin 18表达阳性)进行鉴定。结果:肾小管上皮细胞围绕肾小管节段呈岛屿状向四周生长,4~5 d后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石样,透明度及折光性强。结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代培养及传代的细胞98%以上为肾小管上皮细胞。结论:采用此方法分离培养的肾小管上皮细胞数量多,均一性生长佳,可重复性操作良好。     

兔口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法

目的 培养兔口腔黏膜上皮细胞,建立稳定的口腔黏膜上皮细胞体外培养体系. 方法 取兔口腔黏膜组织,用0.25%中性蛋白酶(DispaseⅡ)分离上皮与皮下组织,采用无血清及无3T3细胞培养体系,即角质细胞培养液(Defined K-SFM)培养兔口腔黏膜上皮细胞,并进行形态学观察及免疫细胞化学检测. 结果 用中性蛋白酶可成功分离上皮与皮下组织,原代培养11 d细胞可融合成片,呈铺路石样,鉴定为单一口腔黏膜上皮细胞. 结论 利用角质细胞培养液可成功培养出兔口腔黏膜上皮细胞.     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。     

Isolation, purification ,cultivation and identification of porcine fetus pancreatic duct stem cells in vitro

目的 建立胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定的方法.方法 采用胰酶和胶原酶Ⅳ、P消化法分离获得细胞,在含10％胎牛血清的M199培养基中行导管上皮细胞原代培养,而后将血清浓度提高到20％以上继续培养,3～4天后至每个小圆细胞形成一个集落;采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)的方法对获得的细胞检测CK19、Pdx-1、NeuroD/Beta2、insulin、Glut-2等基因的表达.结果 成功分离获得胎猪胰腺导管细胞,并证实该细胞为胎猪导管源胰腺干细胞.经检测,细胞表达CK19,Pdx-1,Ght-2,NeuroD/Beta2等胰腺干细胞的标志,而insulin、Neurogenin3阴性表达.结论 该方法可较好地分离纯化出胎猪胰腺导管细胞,经鉴定获得细胞具有胰腺干细胞的特性.     

微分离方法原代培养大鼠肾近曲小管上皮细胞

目的建立比较理想的大鼠肾近曲小管上皮细胞的原代培养及鉴定方法。方法采用显微微分离单根肾近曲小管节段的方法进行原代培养,并用免疫细胞化学方法和电镜进行鉴定。结果用微分离方法成功地培养出肾小管上皮细胞,经鉴定为该细胞。结论微分离方法是大鼠肾近曲小管上皮细胞原代培养的有效方法。     

人羊膜上皮细胞的分离、纯化及其生物学特性研究

目的 体外分离人羊膜上皮细胞并纯化,对体外培养的人羊膜上皮细胞的生物学特性进行相关研究.方法 取足月剖宫产的人羊膜组织,经胰蛋白酶、胶原酶和Dnase酶消化后,采用差异黏附法获得纯度高的羊膜上皮细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用HE染色法对培养细胞进行形态学观察,并采用免疫组化法检测细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在体外培养的人羊膜上皮细胞中的表达.结果 经不同的消化酶消化和差异黏附法筛选后能获得纯度较高的人羊膜上皮细胞,在体外培养条件下人羊膜上皮细胞呈上皮细胞特有的铺路石样外观,并能连续传代8～10次,细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在其胞浆中呈阳性表达.结论 人羊膜上皮细胞能在体外成功分离、纯化、培养并增殖,为人羊膜上皮细胞的进一步研究及其在细胞移植和组织工程中的应用奠定了实验基础.     

星形胶质细胞纯化方法改良及脂多糖刺激后一氧化氮系统的表达

目的 对BALB/c小鼠大脑皮层星形胶质细胞分离纯化的方法进行改良和优化,并进一步研究经脂多糖(LPS)刺激后其一氧化氮(NO)的产生及一氧化氮合酶(NOS)表达情况.方法 星形胶质细胞采用温和胰酶与定轨摇床振荡相结合的方法进行分离,采用抗GFAP抗体鉴定其纯度;再采用LPS刺激分离培养的星形胶质细胞,检测培养上清中N...     

鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、鉴定和培养

目的：探讨肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离，鉴定和培养。方法：采用改良法（酶消化与碳铁颗粒相结合）、分离、鉴定和培养了肺泡Ⅱ型上皮细胞。结果：使用上述方法分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞，经流式细胞仪、鞣酸染色和电子显微镜鉴定，其纯度达７０％以上。结论：经改良法分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞，可满足一般试验需求。     

人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

人脂肪间充质干细胞体外分化为视网膜细胞观察

目的:研究成人脂肪间充质干细胞(hAD-MSC)体外诱导分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)、光感受器细胞和血管内皮细胞的情况.方法:分离、培养和鉴定hAD-MSC,用血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子诱导hAD-MSC向血管内皮细胞分化,并检测血管内皮细胞标志物血管内皮细胞Ⅷ因子(vWF)的表达情况.制备hAD-MSC体外诱导液,用诱导剂和诱导液共同诱导hAD-MSC向视网膜细胞分化,采用免疫荧光法检测hAD-MSC经诱导后表达光感受器细胞标志物视紫红质(Rhodopsin)和RPE细胞标志细胞角蛋白(Pan-CK)的表达情况.结果:免疫荧光法证实,分离培养的hAD-MSC经体外诱导后可表达RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞的标志Pan-CK、Rhodopsin和vWF.结论:hAD-MSC经过体外诱导可以向视网膜RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞分化.     

新生猪肾近曲小管上皮细胞的体外培养与鉴定

目的 分离新生猪肾小管上皮细胞进行体外培养，为研究围生期肾小管上皮细胞生物学行为特征提供理论基础。方法 采用机械分散结合V型胶(0.5g/L)消化的方法纯化肾小管片段，选择含10%的FCS低糖DMEM培养基，置于5%CO2，37℃孵箱培养，0.25%胰蛋白酶用于肾小管上皮细胞纯化和传代培养。应用细胞形态学（光镜和电镜）、免疫细胞化学（Panck和CK18单抗）和酶组织化学（酸性磷酸酶和碱性磷酸酶）方法进行肾近曲管上皮细胞鉴定，用流式细胞术做细胞纯度鉴定。结果 出生12-24小时的新生猪肾小球直径为50-70μm，出生5-6天的肾小球直径为70-98μm，新生猪肾近曲小管上皮细胞体外培养对葡萄糖的需求量不高。培养成功并传6-8代，肾小管上皮细胞纯度达95-98%。综合形态学、免疫细胞化学和酶组织化学结果，支持细胞来源于肾单位的近曲小管。结论 采用机械分散-酶消化纯化肾小管，0.25%胰蛋白酶纯化肾小管上皮细胞及低糖DMEM培养新生猪肾近曲不管的方法是可行的。