两种商品化新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的应用性能评价

目的评价两种商品化新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)中和抗体检测EIA试剂盒的应用性能。方法使用两种商品化SARS-CoV-2中和抗体ELISA检测试剂盒(A和B), 以疫苗免疫前血清44例、免疫后1个月血清120例、COVID-19患者愈后6个月的恢复期血清64例作为样本盘, 进行中和抗体检测, 同时通过活病毒微量中和试验(micro-neutralization test, micro-NT)检测上述血清样本的50%中和抗体滴度(50% neutralization titer, NT50)。分析两种商品化试剂盒与活病毒中和试验在定性及定量结果上的一致性。结果定性结果分析发现, 以micro-NT检测结果作为标准, A和B试剂盒的阳性符合率分别为97.40%和100.00%;阴性符合率分别为97.30%和95.95%;约登指数分别为0.95和0.96。定量结果分析发现, 对于疫苗免疫后样本, A、B试剂盒与micro-NT检测结果的相关系数分别为0.24(P<0.05)和0.5...     

新型冠状病毒疫苗免疫后抗体水平检测的3种实验方法比较

目的:利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和商品化磁微粒化学发光法(CLIA)检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)疫苗(简称新冠疫苗)免疫后IgG抗体,并与中和试验(NT)结果进行比较,探讨两种酶免方法与中和试验结果的一致性。方法:分别用ELISA、CLIA和NT检测143个健康人接种2剂新冠疫苗免疫前和免疫后28 ...     

一种新型冠状病毒假病毒的制备及初步应用

目的 制备一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒,并将其应用于抗体中和能力检测和抗体广谱性评估.方法 整合2种近期出现的SARS-CoV-2变异病毒株(20A.EU1和B1.1.7)刺突(spike,S)蛋白的突变序列、以及对胞浆区肽段19个氨基酸进行局部缺失突变,构建突变型S蛋白表达质粒,转染293T细胞进行...     

SARS-CoV-2广谱中和抗体性质鉴定

目的：对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法：通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋白;冷冻电镜技术确定XMA09识别的受体结构域（RBD）上的关键氨基酸位点;间接ELISA与表面等离子共振（SPR）技术检测XMA09对SARS-CoV-2及其突变株Spike蛋白的亲和力;采用基于水疱性口炎病毒（VSV）的假病毒系统检测XMA09对SARS-CoV-2野生型及突变株的中和能力。结果：本研究发现XMA09识别的表位较为保守,对多种突变株Spike蛋白均具有强结合能力,能广谱中和关切突变株（VOCs）,包括广泛流行的Omicron亚突变株BA.4/5。结论：XMA09是SARS-CoV-2广谱中和抗体,具有作为SARS-CoV-2治疗性抗体的潜力,并可为SARS-CoV-2的广谱疫苗设计与抗体药物开发提供参考意义。     

新型冠状病毒中和抗体两种检测方法的建立与评价

目的 建立基于酶联免疫法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)双抗原夹心法和竞争抑制法的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体检测方法,并评价两种方法的检测性能.方法 使用基因重组刺突蛋白受体结合域(spike protein receptor binding domain,S-RBD)作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记另1株基因重组蛋白SARS-CoV-2 S-RBD,建立S-RBD双抗原夹心法.使用基因重组人血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记S-RBD蛋白,建立竞争抑制法.优化各自的反应体系,使整个系统达到最佳检测性能,并对两种检测方法进行对比评价.结果 两种方法的灵敏度相近,临界值附近的重复性夹心法为7.51％,竞争抑制法为10.70％;未接种疫苗且核酸阴性的人群样本,两种方法的特异性均为100％;已接种疫苗的人群样本,夹心法的阳性检出率为75.0％,竞争抑制法为71.4％,与金斯瑞生物科技股份有限公司生产的新冠病毒中和抗体检测试剂盒(ELISA)的检测结果相比,Kappa指数分别为0.9、0.81,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 成功建立新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体双抗原夹心法和竞争抑制法两种酶联免疫检测方法,夹心法的重复性优于竞争抑制法.两种检测方法与已上市的同类产品的差异没有统计学意义,具有一定的临床应用价值.     

两种新型冠状病毒免疫学检测方法的应用评价

目的：为有效检测新型冠状病毒特异性抗体（新冠抗体），利用化学发光法和胶体金法分别检测已完成中和试验的92份血清，对两种方法的敏感度和特异度等进行初步比较和评价，为大规模人群免疫后血清SARS-CoV-2抗体水平监测提供参考。方法：采用病毒中和试验、胶体金试剂盒和全自动化学发光分析仪分别对样本开展SARS-CoV-2特异性抗体检测，计算诊断特异度、敏感度、阴阳性预测值和符合率。结果：化学发光法的灵敏度为100.00%，高于胶体金法的71.64%；胶体金法的特异度为92.00%，高于化学发光法的64.00%；胶体金法阴阳性预测值分别为54.76%和96.00%，而化学发光法的阴阳性预测值分别为100.00%和88.16%；胶体金法和化学发光法的Kappa值分别为0.525和0.721。结论：以微量病毒中和抗体试验为金标准，化学发光法的灵敏度和Kappa值较高，适用于SARS-CoV-2病例辅助性快速检测；胶体金法测定SARS-CoV-2特异度总抗体的灵敏度一般，特异度较高，其使用简便快速、成本低廉，在条件限制、需要及时监测等情况下，适用于快速大规模筛查以及阳性样本初步检测。随着新冠疫苗在人...     

新型冠状病毒614D和614G假病毒生物学特性研究

目的利用HIV慢病毒包装系统构建新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)原始株614D和突变株614G假病毒, 并初步研究其生物学特性。方法将重组表达质粒pCDNA3.1-614D和pCDNA3.1-614G分别与慢病毒质粒psPAX2和pLenti CMV Puro LUC瞬时共转染293T细胞, 72 h后收集上清, 进行20%蔗糖垫层超速离心, 检测假病毒的滴度、形态、S蛋白表达和中和活性。结果间接免疫荧光检测可见S蛋白特异性荧光, Western blot分析可见2019-nCoV 614D和614G假病毒S蛋白表达, 透射电镜下可见假病毒颗粒具有明显刺突。614D和614G假病毒的滴度分别为1.12×104和2.52×104 TCID50/ml, 均能够中和S蛋白兔多克隆抗体, 表明假病毒具有特异性。结论本研究成功构建了2019-nCoV 614D和614G假病毒, 为建立基于假病毒的体外中和抗体检测平台奠定基础。     

野生型SARS-CoV-2感染康复者血清中SARS-CoV-2 Omicron突变株BA.1.1.529、BA.2和BA.3的中和抗体评估

目的 分析野生型SARS-CoV-2(2019新型冠状肺炎病毒)感染康复者血清中SARS-CoV-2 Omicron变异株BA.1.1.529、BA.2和BA.3的中和抗体滴度。方法 以8名已从SARS-CoV-2新冠肺炎中恢复的康复者血清为研究对象,采用ELISA方法检测野生型SARS-CoV-2感染康复者血清中SARS-CoV-2 Omicron变异株BA.1.1.529、BA.2和BA.3的中和抗体滴度,并将其与野生株SARS-CoV-2的中和抗体滴度进行对比分析。结果 在野生型SARS-CoV-2感染康复者血清中,SARSCoV-2 Omicron变异株BA.1.1.529中和抗体滴度显著低于野生株SARS-CoV-2中和抗体滴度（P<0.001）,而SARS-CoV-2Omicron的BA.1.1.529、BA.2和BA.3 3个亚系之间的中和抗体滴度无差异。结论 野生型SARS-CoV-2感染康复者血清中SARS-CoV-2 Omicron变异株BA.1.1.529、BA.2和BA.3的中和抗体滴度均较少。提示感染野生株SARS-CoV-2患者康复后可能对Omicro...     

以假病毒为基础的HIV-1中和抗体检测体系的建立以及初步应用

目的 建立以假病毒为基础的HIV-1中和抗体检测方法,并对其进行初步应用.方法 从重组质粒中扩增出gp160基因片段,并克隆到pcDNA3.1质粒上,酶切鉴定得到阳性克隆.将阳性克隆分别和pSG3△env质粒共转染获得假病毒.用假病毒分别检测单克隆抗体和HIV-1抗体阳性血清的中和活性.结果 成功地获得了4株假病毒CHB01、CHB02、CHBC03和CHAE04.单克隆抗体4E10可以中和4株假病毒;单克隆抗体2F5不能中和CHBC03假病毒株,但可以中和CHB01、CHB02和CHAE04假病毒株;单克隆抗体IgG1b12 可以中和CHBC03、CHB01和CHB02假病毒株,则不能中和CHAE04假病毒株.43份HIV-1抗体阳性血清中针对不同假病毒的中和抗体明显不同.结论 所获得的假病毒可以用于中和抗体的检测,但不同假病毒株的中和特性不同.     

健康志愿者体内HCoV特异性中和抗体与SARS-CoV-2特异性中和抗体的相关性

目的 分析健康人体内HCoV（人新型冠状病毒）特异性中和抗体与SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2号）特异性中和抗体滴度的相关性。方法 将自愿参组的7位健康志愿者作为研究对象,采用ELISA法检测健康志愿者体内HCoV特异性中和抗体及SARS-CoV-2特异性中和抗体滴度;采用方差分析及t检验分析了不同病毒的特异性中和抗体滴度之间的差异,同时采用线性拟合分析了不同中和抗体之间的相关性。结果 健康志愿者体内HCoV特异性中和抗体滴度明显高于SARS-CoV-2特异性中和抗体(P<0.000 1),且HCoV-HKU1（人冠状病毒HKU1株）特异性中和抗体与SARS-CoV-2特异性中和抗体之间存在正相关性(P<0.05)。结论 健康志愿者体内HCoV特异性中和抗体与SARS-CoV-2特异性中和抗体存在正相关,提示HCoV感染可能对SARS-CoV-2具有抗体交叉反应。     

HIV-1膜抗原部分糖基化位点改造对免疫原性及假病毒形成的影响

目的 研究HIV-1膜蛋白(Env)特定糖基化位点改造对Env免疫原性及功能性假病毒形成能力的影响.方法 采用环形诱变,DpnⅠ筛选的方法对Env进行定点突变,单周期感染试验检测功能性假病毒形成能力,免疫小鼠,利用假病毒中和试验与ELISPOT分别检测突变对中和抗体和T细胞分泌Env特异的IFN-γ的影响.结果 N197Q突变体使Env诱导中和抗体的能力提高而诱导T细胞分泌Env特异的IFN-γ的能力降低,并使Env不能形成功能性假病毒;G2突变体(N624Q,N637Q)诱导的中和抗体能更好地中和假病毒74-2,仉中和假病毒Wt的能力下降,对Env诱导T细胞分泌Env特异的IFN-γ的能力和功能性假病毒形成无明显影响.结论 特定糖基化位点的改造影响假病毒的形成及Env的免疫原性.     

快速荧光灶抑制试验的应用和改进

快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)是世界卫生组织(World Health Organisation,WHO)推荐的狂犬病病毒中和抗体检测标准方法,已被应用于狂犬病疫苗免疫效果评估、狂犬病疫苗新型免疫方案评估、狂犬病诊断试剂和方法评估、狂犬病被动免疫制剂评价.对RFFIT的改进包括自动化判读结果和用表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组狂犬病病毒做为攻击病毒,这些改进目前尚未获得广泛应用,传统RFFIT仍然是值得推广的狂犬病病毒中和抗体检测方法.     

新型冠状病毒和甲型流感病毒双价DNA疫苗的构建与免疫原性研究

目的构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)和甲型流感病毒双价DNA疫苗, 并在小鼠模型中评价其免疫原性。方法将SARS-CoV-2 Beta突变株S1蛋白编码序列和甲型流感病毒Cambodia (H3N2)株HA蛋白编码序列进行密码子优化合成, 采用Over-lapping PCR方法, 将两个编码基因通过自裂解2A肽(self-cleaving 2A peptides)序列连接成S1-2A-HA片段, 构建能同时表达S1蛋白和HA蛋白的双价DNA疫苗, 命名为pVRC-S1-2A-HA, 间接免疫荧光和Western blot验证S1蛋白和HA蛋白的表达。将DNA疫苗以肌肉注射加电转途径(IM+EP)免疫BALB/c小鼠, 间接ELISA、假病毒中和试验和血凝抑制试验检测小鼠体液免疫应答, IFN-γ ELISPOT、胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining, ICS)和CBA法检测小鼠细胞免疫应答。结果双价DNA疫苗pVRC-S1-2A-HA可...     

人乳头瘤病毒(HPV)L2肽免疫小鼠诱导的抗体水平与保护作用的关系研究

目的 检测HPV-58 L2 11～200 AA肽在动物体内对HPV的保护效果,并分析疫苗诱导的抗体滴度或中和抗体滴度与疫苗保护作用之间的对应关系.方法 利用大肠杆菌表达HPV-58L2 11～200 AA肽,纯化目的 蛋白并与铝佐剂吸附后免疫小鼠,利用小鼠HPV-58假病毒感染模型检测不同剂量的免疫原对小鼠的保护作用.通过ELISA和假病毒中和抗体检测方法 检测免疫血清中的总抗体水平和中和抗体水平,分析具有保护作用的抗体或中和抗体滴度.结果 当蛋白免疫剂量为8μg时,能够完全保护小鼠不受HPV假病毒的感染.小鼠免疫血清中的中和抗体水平较低,利用已建立的假病毒中和试验方法 检测不到血清中的中和抗体.而利用ELISA检测血清中的总抗体水平结果 显示,免疫血清中的总抗体水平与疫苗的保护效果之间存在对应关系,当抗体滴度大于等于1:25 000时,小鼠体内检测不到荧光信号,能够保护机体不受假病毒的感染.结论 HPV-58 L2 11～200 AA肽能够保护小鼠不受假病毒的感染,L2 11～200 AA肽具有较好的疫苗发展前景,其引发的总抗体水平可以作为评价保护效果的间接指标.     

人乳头状瘤假病毒中和抗体滴度和ELISA法测定的小鼠血清抗体滴度的相关性研究

目的 探讨两种不同的报告基因纽扣珊瑚绿色荧光蛋白(Zoanthus sp.green fluorescent protein,ZsGreen)和分泌性碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)测量的人乳头状瘤假病毒中和滴度之间的相关性,以及中和滴度和抗体滴度的相关性.方法 将密码子优化的人乳头状瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L1、L2基因表达质粒和报告基因质粒共转染293FT细胞,48 h后收集细胞裂解上清,柱层析纯化假病毒,对假病毒滴度进行测定.采集免疫过候选HPV疫苗和Gardasil疫苗的小鼠血清,测量血清的中和滴度和抗体滴度.结果 经统计分析,这两种报告基因系统的假病毒检测的中和滴度结果高度相关(Spearman相关系数r=0.760),而且中和滴度和抗体滴度的相关度很高(Spearman相关系数r=0.577和0.741).结论 两种不同的报告基因ZsGreen和SEAP测量的HPV假病毒中和滴度之间,以及中和滴度和ELISA测定的抗体滴度之间高度相关,揭示了部分HPV疫苗预防病毒入侵的机制,为快速准确鉴定HPV-16和HPV-18候选疫苗的免疫保护效果奠定了基础.     

新型冠状病毒肺炎病例血清中和抗体动态变化及影响因素

目的:了解新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)确诊病例血清抗新型冠状病毒(2019 novel Coronavirus, 2019-nCoV)中和抗体动态变化规律及可能的影响因素。方法:采用微量中和试验检测COVID-19确诊病例血清中和抗体,采用Excel 2007...     

基于N-ELISA的呼吸道合胞病毒快速中和抗体检测方法的建立

目的制备针对呼吸道合胞病毒(RSV) N蛋白的兔多克隆抗体, 以其作为检测抗体建立基于ELISA的快速中和抗体检测方法。方法构建pET30a-N质粒, 表达纯化N蛋白, 免疫新西兰兔制备针对RSV N蛋白的多克隆抗体作为检测抗体。阳性血清系列稀释后与100半数组织培养感染剂量(TCID50)/孔的RSV中和, 接种Hep-2细胞培养, 80%丙酮固定细胞, ELISA方法检测感染细胞中病毒的N蛋白, 当每孔的吸光度值低于临界值时, 视为中和试验阳性孔, 阳性孔血清的最高稀释度为该血清的中和抗体滴度。优化抗体稀释度、检测时间、细胞密度及中和时间, 建立基于N-ELISA的中和抗体检测方法, 对建立的实验方法进行细胞代次、边缘孔效应、准确性、重复性以及精密度验证, 初步应用于人RSV IgG阳性血清检测, 分析与微量中和法的相关性。结果成功构建出pET30a-N质粒, 表达纯化的N蛋白纯度较高, 特异性良好;三免后兔血清效价为1∶51 200, 可特异性结合RSV;制备的抗RSV N兔多抗的效价为1∶51 200, 特异性良好, 建立的快速中和抗体检测方法在4 d就可检测, 中和时间可缩短...     

一株降低了抗体依赖性增强效应的西尼罗病毒中和抗体的表达与体外活性研究

目的建立降低抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement, ADE)效应的抗体表达系统, 以期降低目标抗体的ADE效应。方法对哺乳细胞抗体表达载体Fc区进行L234A和L235A点突变, 建立抗体表达载体pFRT-IgG1κ-FcM。选取前期工作中获得的1株具有显著ADE效应的抗体Wt-WNV利用pFRT-IgG1κ-FcM系统进行表达, 获得突变后抗体FcM-WNV。ELISA检测FcM-WNV与靶抗原西尼罗病毒包膜蛋白DⅢ(West Nile virus envelope protein-DⅢ, WNV E-DⅢ)的结合, 流式细胞术分析FcM-WNV与人高亲和力IgG Fc受体hFcγRⅠ(hCD64)的结合。假病毒感染宿主细胞(BHK21和K562)试验检测FcM-WNV的体外中和活性。结果 FcM-WNV与Wt-WNV表达水平相当, 能识别结合WNV E-DⅢ, 且呈浓度依赖效应;与Wt-WNV相比, FcM-WNV与hCD64的结合力明显减弱, 表现为荧光强度明显降低;与前期实验结果一致, Wt-WNV在5 μg/ml的浓度下具有明显增强WN...     

靶向SARS-CoV spike中和抗体的检测

目的 建立靶向SARS-CoV spike中和抗体的检测模型.方法 构建优化的全基因SARS-CoV spike质粒免疫小鼠产生S1190抗血清,与合成的结合受体ACE2的S318-510蛋白进行作用,通过荧光显微镜观察对SARS假病毒感染抑制作用的变化以确证中和抗体的高效性.结果 SARS-CoV spike质粒诱导产生的S蛋白全长抗血清不但可以有效中和SARS假病毒进入HEK293E/ACE2-Myc细胞,S318-510蛋白的预处理可以降低抗血清对SARS假病毒的进入抑制效应.结论 受体结合部(RBD)的S318-510蛋白靶向SARS-CoV spike中和抗体的检测模型得到有效的验证.可以作为直观迅速判断中和抗体是否高效的模型推广至不具备P3级别的实验室.     

抗人巨细胞病毒中和性人源基因工程抗体的研究

目的 研究抗人巨细胞病毒(HCMV)人源基因工程抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术。首先从HCMV感染者外周血中分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录后用特异性引物扩增轻、重链基因。然后插入噬菌体载体pComb3，构建噬菌体抗体库。使用纯化的HCMV病毒裂解物对噬菌体抗体库进行4轮富集，然后通过ELISA筛选阳性克隆，并对获得的克隆进行功能鉴定。结果 克隆和表达了3株抗HCMV人源Fab抗体，经ELISA证明均具有抗原结合活性，间接免疫荧光试验证明具有较高的特异性，最后通过病毒中和试验证明其中2株具有中和活性。结论 获得2株抗HCMV人源Fab抗体，具有一定的中和活性，为下一步研究抗HCMV人源全抗体奠定了基础。