替米沙坦对脂多糖诱导3T3-L1脂肪细胞炎症通路的影响

目的 研究替米沙坦对脂多糖诱导3T1-L1脂肪细胞炎症通路的影响,探讨替米沙坦的抗炎机制.方法将3T3-L1脂肪细胞诱导至90%成熟,按随机数字表法分为6组:对照组、LPS组、LPS+替米沙坦(0.01、0.1、1和10μg/ml)组(n=18),向对照组细胞中加DMSO,LPS+替米沙坦组细胞中加入不同浓度替米沙坦,孵育2h后,LPS组和LPS+替米沙坦组再加入脂多糖(1 μg/ml),孵育1h,Western免疫印记法比较各组核蛋白NF-κBp65、总蛋白p-IκBα、IκBα、p-ERK1/2、ERK1/2、P-p38MAPK、p38 MAPK的表达水平.结果 脂多糖刺激后IκBα磷酸化蛋白表达增强(P＜0.05),细胞核内NF-κBp65蛋白表达增多(P＜0.05),MAPK通路相关蛋白ERK1/2磷酸化和p38MAPK磷酸化水平明显增强(P＜0.05),替米沙坦可抑制IκBα磷酸化和NF-κBp65核转位,p-IκBα蛋白表达和核蛋白NF-κBp65表达均降低,大剂量替米沙坦(10 μg/ml)作用时该作用明显(P＜0.05).替米沙坦干预后,p-ERK1/2和p-p38MAPK蛋白表达也受到明显抑制(P＜0.05),大剂量(10μg/ml)时作用明显(P＜0.05).结论 在3T3-L1脂肪细胞中,替米沙坦可以抑制NF-κB通路中IκBα蛋白磷酸化、NF-κBp65蛋白核转位以及MAPK通路中ERK1/2蛋白和p38MAPK蛋白的磷酸化,从而发挥抗炎作用.     

高密度脂蛋白对氧化型低密度脂蛋白刺激下脂肪细胞TNF-α表达的影响

目的观察高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)刺激下3T3-L1脂肪细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表达的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 3T3-L1脂肪细胞促分化成熟后,oxLDL刺激脂肪细胞,给予不同浓度的HDL(10～100μg/ml),及H-89(10μmol/L)+HDL(100μg/ml)干预,收集细胞,测定脂肪细胞TNF-αmRNA表达水平,IκB蛋白浓度及核因子-κB(NF-κB)活性。结果 OxLDL刺激使3T3-L1脂肪细胞TNF-αmRNA表达及NF-κB活性明显增强。HDL浓度依赖性抑制TNF-αmRNA表达、NF-κB活化和IκB降解。与oxLDL刺激组比较,100μg/ml HDL使TNF-αmRNA表达降低64.5%,NF-κB活性减少49%,并明显增加IκB蛋白水平。HDL的这些抗炎效应能被蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89部分抑制。结论HDL能抑制oxLDL诱导的3T3-L1脂肪细胞TNF-αmRNA表达,PKA-IκB-NF-κB信号通路是其中作用途径之一,该效应不需要HDL与oxLDL的直接接触作用。     

PTEN对巨噬细胞炎性细胞因子分泌的影响及其机制研究

目的:PTEN/PI-3K/Akt通路在LPS介导的炎症和内毒素血症中可能具有重要的调控作用,PTEN与LPS刺激引起的炎性介质增多之间的关系尚不明确.文中观察PTEN对LPS攻击所致RAW264.7细胞TNF-α分泌水平的影响并探讨其可能的机制. 方法:①以RAW264.7细胞为研究对象,第1组为对照组,第2组和第3组为PTEN抑制剂组,分别提前1h加入PTEN抑制剂200、100nmol/L,以LPS刺激6h后收集细胞培养上清,用ELISA法检测上清中TNF-α的水平.②将NF-κB-LUC质粒与pRL-CMV质粒共转染RAW264.7细胞,以LPS处理细胞6h后通过检测NF-κB反应性荧光素酶报告基因表达,观察PTEN在LPS攻击巨噬细胞时对NF-κB转录激活的影响. 结果:与正常细胞相比,抑制PTEN可使LPS诱导的TNF-α分泌减少,NF-κB活性减弱. 结论:PTEN可上调LPS诱导的巨噬细胞TNF-α分泌水平,可能是通过激活NF-κB的转录活性增加TNF-α的分泌水平,从而在内毒素所诱导的炎症反应中发挥重要的调控作用.     

灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症介质分泌的影响

[目的] 研究灯盏乙素对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞炎症的影响,初步探讨其抗炎作用机制。[方法] 用噻唑蓝（MTT）法检测灯盏乙素对RAW264.7细胞活力的影响;用Griess法检测灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞中一氧化氮（NO）生成的影响;用荧光素酶报告质粒法检测灯盏乙素对LPS诱导的核转录因子（NF-κB）转录活性的影响;用实时定量聚合酶链反应（PCR）法检测灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB靶基因肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA表达的影响。[结果] 0.01～10 μmol/L的灯盏乙素处理24 h后对RAW264.7活力无显著影响;1、10 μmol/L的灯盏乙素可以显著抑制LPS诱导的NO的生成及NF-κB转录活性;灯盏乙素可以不同程度的抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB靶基因TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的上调作用。[结论] 灯盏乙素可能通过抑制NF-κB的活化及炎症因子的表达发挥一定的抗炎作用。     

睾酮对3T3-L1脂肪细胞炎症因子生成的影响及其机制研究

目的 探讨睾酮对3T3-L1成熟脂肪细胞炎症因子生成的影响及分子机制.方法 3T3-L1前脂肪细胞诱导成熟,采用不同浓度睾酮(10-9、10-7、10-5mol/L)分别处理10～30 min及12、24及48 h后,提取上清液用ELISA法检测炎症因子白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的浓度;RT-PCR检测细胞内IL-6、MCP-1mRNA的生成;免疫印迹检测核因子-κB(NF-κBp65)的磷酸化及表达.随后再用10-4mol/L NF-κB的抑制剂吡咯二烷二硫氨基甲酸(PDTC)预处理2 h,再加入睾酮,再观察上述结果的变化.结果 (1)与无睾酮组相比,睾酮3种浓度处理组3T3-L1脂肪细胞上清液IL-6、MCP-1的含量均明显增多(P<0.05),以10-5moL/L睾酮处理24 h时上清液两种因子含量较其他处理组明显增多(P<0.05).与无睾酮组相比,睾酮3种浓度处理组3T3-LI脂肪细胞12 h时,IL-6、MCP-1 mRNA的水平明显增加(P<0.05),以10-5moL/L睾酮处理12 h时两种因子的mRNA水平较其他组明显增加(P<0.05);(2)睾酮3种浓度短时间(10～30 min)处理3T3-L1脂肪细胞时,与无睾酮组相比,均可使NF-κBp65的磷酸化增加(P<0.05),其中以10-5mol/L的作用最明显(P<0.05);睾酮处理3T3-LI脂肪细胞12 h时,NF-κB p65的磷酸化明显增加(P<0.05),其中以10-9和10-5mol/L组较其他组作用明显(均P<0.05);(3)用NF-κB的抑制剂PDTC预处理2 h后,再用睾酮处理,上清液两种因子含量及其mRNA水平明显降低(均P<0.05).结论 睾酮可通过NF-κB途径促进成熟脂肪细胞炎症因子的分泌.     

核因子-κB对TNF-α诱导的脂肪细胞葡萄糖转运 蛋白4表达的影响

 【目的】 观察TNF-α对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4(GLUT4) mRNA与蛋白表达的作用,并探讨核因子-κB(NF-κB)对上述作用的影响。【方法】 成熟的3T3-L1脂肪细胞分成3组:A组正常对照组,B组肿瘤坏死因子α(TNF-α)组,C组吡咯烷二硫基甲酸酯(NF-κB活性抑制剂) + TNF-α组。各组干预48 h后检测phospho- NF-κB p65(Ser536)的蛋白水平。GLUT4 mRNA及蛋白水平。蛋白检测采用Western法,mRNA检测采用RT-PCR法。【结果】 B组phospho- NF-κB p65蛋白水平(71.1 ± 5.9)高于A组(41.3 ± 1.7, P < 0.001)和C组(25.4 ± 4.7, P < 0.001)。B组GLUT4的mRNA水平(0.86 ± 0.14, P < 0.001)与蛋白水平(31.6 ± 7.2, P < 0.001)低于A组(2.01 ± 0.65; 60.7 ± 8.4),C组mRNA水平(0.46 ± 0.12)与B组比较有下降趋势但无统计学意义(P = 0.100),C组蛋白水平(9.5 ± 3.0)低于B组(P = 0.001)。【结论】 TNF-α下调3T3-L1脂肪细胞的GLUT4表达,抑制NF-κB活性后GLUT4表达进一步下调。这提示了TNF-α可能不是通过激活NF-κB而使GLUT4的表达下调。     

槲皮黄酮对AMPK/NF-κB信号通路介导IL-6表达的影响

目的 探讨槲皮黄酮介导AMPK/NF-κB信号通路对IL-6炎症因子表达的影响.方法 RAW264.7细胞体外培养,采用LPS不同浓度及时间点诱导炎症模型,ELISA法检测IL-6含量;CCK8试验检测槲皮黄酮和LPS(1 ng/mL)对RAW264.7细胞抑制率的影响;槲皮黄酮处理细胞1h后,加入LPS(1 ng/mL)培养48 h,ELISA法检测IL-6含量;将细胞分为5组后,ELISA法检测IL-6表达水平;Western blot检测细胞核中NF-κB蛋白的表达水平.结果 LPS处理细胞后,分泌IL-6的量明显高于对照组细胞;CCK8实验表明槲皮黄酮和LPS对细胞的抑制作用较弱;槲皮黄酮处理后的细胞分泌IL-6的能力减弱;LPS+AMPK激活剂组、LPS+槲皮黄酮组、LPS+槲皮黄酮+AMPK激活剂组相对于LPS细胞组中IL-6的分泌受到抑制,并且细胞核内NF-κB的表达水平降低.结论 槲皮黄酮通过刺激AMPK含量来抑制NF-κB向细胞核的转移,导致细胞核内NF-κB表达降低而起到抑制炎症因子IL-6的分泌.     

淫羊藿苷对ox-LDL诱导的RAW264.7细胞凋亡及炎症的影响

目的 研究淫羊藿苷(ICA)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)凋亡及炎症的影响,进一步阐明ICA抗动脉粥样硬化(AS)的作用。方法 体外培养RAW264.7细胞,ox-LDL诱导RAW264.7细胞构建泡沫细胞模型,观察ICA低、中、高剂量对RAW264.7细胞活力、细胞凋亡、泡化沫、炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影响,同时采用Western blot检测ICA对Bcl-2、Bax、Caspase-3、IκBα、NF-κB p65蛋白表达的影响。结果 ICA可以提高细胞活力,降低细胞的凋亡率;减少泡沫巨噬细胞的形成;降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌;下调Bcl-2、Caspase-3、NF-κB p65蛋白表达,上调Bax、IκBα的蛋白表达。结论 ICA能够减轻泡沫巨噬细胞的凋亡,抑制炎症因子的表达,从而可能延缓动脉粥样硬化的发展进程。     

TLR4通过NF-κB/TGF-β信号通路调节结核分枝杆菌感染巨噬细胞中的免疫反应

目的 验证Toll样受体4(TLR4)在核因子-κB(NF-κB)/转化生长因子-β(TGF-β)信号通路调节结核分枝杆菌感染巨噬细胞中的免疫反应和细胞活力,并探究其作用机制。方法体外培养小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）,将所有细胞分为4组：TLR4过表达质粒（OE-TLR4组）、空白质粒（Empty vector组）、TLR4小干扰RNA(si-TLR4组)和对照si-NC(si-NC组)。将TLR4过表达质粒、空白质粒、TLR4小干扰RNA及其相应对照si-NC转染至RAW264.7细胞系中,随后使用结核分枝杆菌H37Rv菌株感染细胞。采用克隆形成实验检测细菌菌落数,CCK-8实验检测细胞活力。采用ELISA方法检测上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。Western blot检测NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白（IκB、p-IκB、SMAD2、p-SMAD2）的表达水平。结果 TLR4在结核分枝杆菌H37Rv菌株感染的RAW264.7细胞中表达水平显著高于未感染的细胞。与Empty vector组相比,OE-TLR4组细胞细...     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7巨噬细胞株,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能奠定基础.方法 根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别4.1R基因的向导RNA(sgRNA),构建sgRNA-lentiCRISPRv2重组质粒并转入293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒侵染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆,Western blotting印记检测单克隆细胞中蛋白4.1R的表达,测序确认单克隆细胞中突变位点.结果 Western blotting印迹检测结果表明筛选出的1株单克隆细胞中蛋白4.1R的表达完全缺失;测序结果表明该细胞株中4.1R基因发生了19bp的缺失突变;并且4.1R基因敲除后,RAW264.7细胞的增殖能力显著增加.结论 本研究利用CRISPR/Cas9系统成功的干扰了巨噬细胞系RAW264.7细胞中4.1R的表达,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能提供了有效工具.     

染料木苷对3T3-L1脂肪细胞分化以及AMPK磷酸化的影响

目的观察染料木苷(Genistin,GIN)对3T3-L1前脂肪细胞细胞分化以及分化过程中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化程度的影响。方法用激素鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,用MTT法观察GIN对细胞生存率的影响,以油红O染色法镜下观察3T3-L1前脂肪细胞分化的情况,并通过比色分析法检测GIN对细胞内脂滴堆积量的影响;用Western blotting方法分别检测对照组和给药组细胞分化过程中细胞中AMPK,P-AMPK(Thr172)蛋白表达量,借以计算AMPK磷酸化比率。结果分化诱导后,对照组脂肪细胞呈典型的成熟脂肪细胞表型,形成"戒指环"结构,经100μM GIN干预后,脂滴数量减少,体积减小,通过比色分析法量化后显示100μM GIN可减少胞内脂质的堆积(P<0.05)。与对照组相比,给药组从第4天开始上调p-AMPK(Thr172)/AMPK比率,并持续到第10天(P<0.05)。结论 GIN可通过激活AMPK抑制3T3-L1脂肪细胞分化。     

款冬花乙酸乙酯部位对炎症因子释放的影响

研究款冬花乙酸乙酯部位(FF-EtOAc)对炎症因子释放的影响及作用机制。采用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞活化模型,分别用Griess法、ELISA、Western-blot法检测NO的释放、TNF-α和IL-6的含量、磷酸化NF-κB P-65的表达。结果显示在LPS刺激下,RAW264.7细胞中上述检测指标均显著提高。而FF-EtOAc和阳性对照组水杨酸钠均能抑制LPS诱导的活化RAW264.7细胞释放NO,能浓度依赖性抑制TNF-α和IL-6产生并且能显著抑制NF-κB家族P-65的磷酸化。研究证实FF-EtOAc能够显著抑制炎性因子的释放,缓解炎症的病理过程;据此推测可能与NF-κB激活的调节有关。     

原花青素抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞PGE_2生成的机制

目的：观察原花青素对脂多糖诱导RAW264.7细胞PGE2生成的影响及其作用机制。方法：放射免疫法（RIA）检测原花青素对脂多糖诱导的RAW264.7细胞PGE2生成的影响;LPS诱导RAW264.7细胞9h,再加不同浓度原花青素作用30min,放射免疫（RIA）法检测原花青素对COx-2酶活性的影响;半定量逆转录-聚合酶联反应（RT-PCR）法检测原花青素对COx-2 mRNA表达的影响;提取核蛋白,蛋白免疫印迹（western blot）法检测原花青素对NF-κB/p65蛋白表达的影响;电泳迁移率变动分析（EMSA）法检测原花青素对NF-κB与DNA结合活性的影响。结果：0.8,4和20mg·L-1原花青素抑制LPS诱导RAW264.7细胞PGE2生成;0.8,4和20mg·L-1原花青素不影响LPS诱导RAW264.7细胞COx-2酶活性;0.8,4和20mg·L-1原花青素下调LPS诱导RAW264.7细胞COx-2 mRNA表达;4,20mg·L-1原花青素下调LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB/p65蛋白表达;0.8,4和20mg·L-1的原花青素可明显降低LPS诱导下RAW264.7细胞的NF—κB活化。结论：原花青素显著抑制LPS诱导RAW264．7细胞PGE2生成的作用与原花青素抑制COx-2 mRNA表达有关,此作用可能是通过抑制NF—κB／p65蛋白表达和抑制NF-κB的DNA结合活性来实现。     

牛蒡子苷对ARDS细胞模型的抗炎作用及PI3K-AKT-NF-кB信号通路的影响

[目的] 研究牛蒡子苷(Arctiin,Arc)对急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)细胞模型的抗炎作用及其相关机制。[方法] 将RAW 264.7细胞分为4组:对照组,模型组和Arc高、低剂量组。Arc高、低剂量组在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激24 h前用Arc预处理24 h。采用噻唑蓝法(methy thiazolyl tetrazolium,MTT)测定Arc对RAW 264.7细胞的毒性,采用共聚焦显微镜观察细胞形态变化,以酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis-α,TNF-α)水平,免疫印迹法检测细胞中磷酸酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、核因子-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IкBα)磷酸化水平。[结果] Arc对RAW 264.7细胞增殖活性无明显抑制作用(P＞0.05),Arc高、低剂量组细胞形态与对照组相似。与对照组比较,模型组IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著升高(P＜0.001);与模型组比较,Arc高、低剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低(P＜0.05)。与对照组比较,模型组PI3K、AKT、NF-κB、IкBα磷酸化水平显著升高(P＜0.001);与模型组比较,Arc高、低剂量组PI3K、AKT、NF-κB、IкBα磷酸化水平显著降低(P＜0.05)。[结论] Arc对LPS诱导的ARDS细胞模型具有抗炎作用,其机制可能与抑制PI3K-AKT-NF-кB信号通路的活化有关。     

CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响

【立论依据】 AMPK是细胞及整体能量稳态的调控器。代谢综合征状态下,机体组织广泛存在AMPK活性下降,但AMPK如何失活仍存许多疑问。因此,弄清楚AMPK的失活机制对阐明代谢综合征的发病机制具有重要意义。 【设计思路】 有研究表明CDK5在肥胖小鼠脂肪组织中异常激活,AMPKα2的活性显著降低。同时,AMPKα2 345和529位丝氨酸满足Cdk5的底物一般都具有特定S/TPXK/R序列的条件。据此推测:活化的CDK5能够磷酸化AMPKα2 345和529位丝氨酸,进而抑制AMPKα2的活性,参与代谢综合征的发病。本课题拟在3T3-L1前脂肪细胞上研究Cdk5介导的AMPKα2蛋白磷酸化的作用,为代谢综合征和糖尿病的治疗提供新的思路。 【实验内容】 应用lipofectamine2000转染技术构建Cdk5 siRNA基因的脂肪细胞系3T3-L1-Cdk5 siRNA实验组及其阴性对照组细胞系3T-L1- Mock siRNA(Mock siRNA 为空siRNA转染),实验分为3T3-L1-Cdk5 siRNA组,3T-L1- Mock siRNA 组和3T-L1组,以AIMV无血清培养基培养3T3-L1细胞,使其自然增殖,于增殖第3天起用TNF-α作用于增殖中的3T3-L1细胞,之后每24小时以MTT法观察细胞增殖情况;采用含胰岛素、地塞米松与IBMX的分化培养基诱导分化3T3-L1细胞,于诱导分化第8天起用TNF-α作用于分化中的3T3-L1细胞,此后每3天以油红O染色并染料提取的半定量方法及细胞内甘油三酯测定的方法了解细胞内脂质含量;采用细胞Cdk5/P35和AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒检测3T3-L1细胞中Cdk5和AMPKα2的活性,蛋白质印迹的方法检测3T3-L1细胞AMPKα2 ^S345 、AMPKα2 ^S529及AMPKα2^S345、⁵²⁹磷酸化水平。从而观察CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响。 【材料】 3T3-L1前脂肪细胞,AIM-V medium,DMEM/F12 培养基,Cdk5 siRNA, AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒,油红O, CO2细胞恒温培养箱。 【可行性】 Cdk5是脯氨酸引导的丝/苏氨酸蛋白酶,特异性磷酸化其底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸位点。其磷酸化底物一般都有特定的S/TPXK/R序列。而人、大鼠和小鼠AMPKα2蛋白序列的自动抑制区345位丝氨酸和亚单元结合区域529位丝氨酸有共同的序列YLASSPPSGS 和TGSTLSSVSP,满足Cdk5的底物一般都具有特定的S/TPXK/R序列的条件,实验假设理论上具有可行性。 【创新性】 本课题以Cdk5介导AMPKα2磷酸化进而抑制其活性为切入点,探讨对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响,具有一定的创新性。     

三七皂苷FC通过MAPK/NF-κB途径抑制RAW264.7细胞炎症及凋亡的机制研究

目的:基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)途径探讨三七皂苷FC对RAW264.7巨噬细胞炎症及凋亡的作用机制。方法:(1)采用不同浓度的三七皂苷FC(0、1、10、20、50、100μmol/L)分别干预RAW264.7细胞和脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞,CCK8法检测细胞活力,筛选合适的药物浓度。(2)将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组、LPS+三七皂苷FC低剂量(20μmol/L)组和LPS+三七皂苷FC高剂量(50μmol/L)组。先给予相应剂量的三七皂苷FC预处理6 h,再加入1μg/ml LPS。干预24 h后,PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)mRNA表达;Western blot检测TNF-α、iNOS、p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光检测NF-κB核转位;Transwell实验检测细胞迁移。结果:(1)20、50μmol/L三七皂苷FC干预24 h后,LPS诱导的RAW264.7细胞活力较对照组无显著差异(P0.05),用于后续实验。(2)与LPS组相比,低、高剂量的三七皂苷FC作用后,TNF-α、IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01);TNF-α、iNOS蛋白表达明显降低(P0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达比值显著下调(P0.05,P0.01);细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01);细胞核内NF-κB p65蛋白表达减少,阳性表达细胞数占比显著降低(P0.05);细胞迁移数显著减少(P0.01)。结论:三七皂苷FC能够显著改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应,减少炎症因子的释放,抑制巨噬细胞凋亡和迁移,其作用机制可能与下调MAPK/NF-κB通路磷酸化水平及抑制NF-κB核转位有关。     

天名精根提取物调控TLRs信号抑制RAW264.7细胞炎症的研究

[目的]阐明天名精根提取物对RAW264.7细胞炎症反应的影响及其机制。[方法]采集野生天名精全株,处理得天名精根粉末,制备天名精根乙醇和石油醚提取物,并以高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测其中主要成分;采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、灭活的金黄色葡萄球菌(heat-inactivated preparations of Staphylococcus aureus pathogens,SAC)刺激RAW264.7细胞,构建体外炎症模型。以MTT法检测细胞增殖,qPCR检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、Toll样受体-2(Toll-like receptor-2,TLR-2)、TLR-4、髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response 88,MyD88)、核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)m RNA表达,Western blot检测NF-κB p65蛋白表达。[结果]与正常对照组比较,LPS或SAC刺激后RAW264.7细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达增加(P0.01),NF-κB蛋白与mRNA表达增加(P0.01);LPS刺激后TLR-4、MyD88 m RNA表达增加(P0.01,P0.05),SAC刺激后TLR-2、MyD88 m RNA表达增加(P0.01)。天名精根提取物干预后,与LPS组或SAC组比较,RAW264.7细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达减低(P0.01),同时NF-κB m RNA和NF-κB p65蛋白表达也减低(P0.01);TLR-4和MyD88 m RNA表达明显低于LPS组(P0.01,P0.05),TLR-2和MyD88 mRNA表达表达明显低于SAC组(P0.01,P0.05)。[结论]天名精根提取物可以抑制由LPS和灭活的金黄色葡萄球菌引起的RAW264.7细胞炎症反应,其机制可能与抑制TLRs-NF-κB信号通路有关。     

炎调方对巨噬细胞中HSP70表达及其效应的影响

目的:观察炎调方药物血清对离体巨噬细胞中热休克蛋白70(HSP70)及其他相关细胞因子的调控效应,以验证炎调方治疗脓毒症的作用途径和位点。方法:培养大鼠巨噬细胞RAW 264.7,将培养后的巨噬细胞RAW 264.7分为空白对照组(RAW 264.7+培养液)、正常血清组(RAW 264.7+正常大鼠血清)、炎调方药物血清组(RAW 264.7+炎调方药物血清),每组设4个平行孔。采用MTT比色法测定细胞增殖,确定炎调方药物血清的无毒性剂量范围;采用qRT-PCR方法检测细胞HSP70、核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-8的mRNA表达;采用Western blot方法检测细胞HSP70、NF-κB蛋白表达,以ELISA方法检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-8蛋白表达。结果:炎调方药物血清的无毒性浓度范围包括10%~30%,故后续实验选取20%浓度的炎调方药物血清进行。正常血清组的各项指标与空白对照组比较,其差异均无统计学意义(P0.05);与空白对照组和正常血清组比较,炎调方药物血清组RAW 264.7细胞的HSP70 mRNA和蛋白表达均明显升高(P0.01),NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-8的mRNA和蛋白表达均明显降低(P0.01)。结论:炎调方治疗脓毒症的作用机制可能是上调HSP70的表达,进而抑制NF-κB的活化和相关细胞因子的表达。     

氯喹对脂多糖/内毒素诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88非依赖信号转导途径的抑制作用

目的探讨氯喹对脂多糖/内毒素(lipopolysaccharide/endotoxin,LPS)诱导TLR4-MyD88非依赖途径的抑制作用。方法MTT法检测不同浓度氯喹(5、10、20、40、60μg/ml)对RAW264.7细胞活性的影响,ELISA检测培养体系中TNF-α、IL-6在2、6、12、18、24h的释放情况,RT-PCR检测TNF-α、IL-6、TLR4、TRAMmRNA的表达,EMSA检测NF-κB的活性,Westernblot检测IκBα磷酸化水平和IRF3的降解情况。结果氯喹浓度小于40μg/ml时对RAW264.7细胞活性无影响(P0.05);应用氯喹预处理后LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-6在蛋白水平和核酸水平均受到明显抑制(P0.05),TLR4和TRAM在核酸水平均受到显著抑制(P0.01);EMSA结果显示NF-κB的活化受到抑制,而Western blot检测显示IκBα磷酸化及IRF3的降解也受到抑制。结论氯喹对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88非依赖信号转导途径具有抑制作用。     

槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞表达NF-κB的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB p65、TNF-α表达的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW264.7细胞,分为空白对照组、槐定碱预处理对照组、LPS模型组、槐定碱预处理+LPS组。各组处理完毕后5、30、60、120min,分别获取细胞与细胞培养液。Western Blot和RT-PCR分别检测细胞NF-κB p65蛋白与mRNA表达,放免法检测细胞培养液TNF-α含量。结果单独槐定碱对NF-κB p65以及TNF-α表达无影响;LPS模型组各时间点NF-κB p65 mRNA与蛋白以及TNF-α表达均显著高于空白对照组(P<0.01),且随LPS刺激时间延长而持续升高,至120min未见下降;槐定碱预处理+LPS组NF-κB p65mRNA与蛋白及其下游TNF-α表达均较同时间点LPS模型组降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论槐定碱预处理可通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB p65表达及TNF-α分泌发挥抗炎作用。