SHH信号通路对子痫前期患者滋养细胞凋亡和侵袭的影响及其机制

目的：探讨激活SHH信号通路对子痫前期（PE）患者滋养细胞凋亡和侵袭的影响,并阐明其作用机制。方法：将HTR8/SVneo细胞分为正常对照组、缺氧/复氧（H/R）处理组和purmorphamine+H/R处理组。Western blotting法检测PE胎盘组织和正常妊娠晚期胎盘组织及各组HTR8/SVneo细胞中SHH信号通路相关蛋白SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平,流式细胞术（FCM）检测各组HTR8/SVneo细胞的凋亡率,Transwell小室法检测各组HTR8/SVneo细胞的穿膜细胞数,Western blotting法检测各组HTR8/SVneo细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达水平。结果：PE胎盘组织HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平均明显低于正常妊娠晚期胎盘组织（P<0.05）;H/R处理组HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及穿膜细胞数均明显低于正常对照组,细胞凋亡率明显高于正常对照组（P<0.05）;purmorphamine+H/R处理组HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及穿膜细胞数均明显高于H/R处理组（P<0.05）,细胞凋亡率明显低于H/R处理组（P<0.05）。结论：激活SHH信号通路可减少PE患者胎盘组织中HTR8/SVneo细胞凋亡,并通过上调MMP-2和MMP-9表达提高细胞的侵袭能力。     

pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用

目的 建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用.方法 将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer 5.1-H1 Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT6细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响.结果 重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确.重组逆转录病毒滴度可达224×10 4cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3 d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础.     

Klotho对滋养细胞侵袭的影响

目的:研究Klotho对绒膜外滋养细胞系HTR8/SVneo侵袭的影响。方法:用免疫组化检测子痫前期及正常孕妇胎盘组织Klotho蛋白表达情况。实验分组为对照组、Klotho重组蛋白组、Klotho siRNA组。Transwell小室法检测侵袭能力,Western Blot检测细胞蛋白表达水平。结果:子痫前期胎盘组织Klotho表达水平明显低于正常胎盘组织。Klotho重组蛋白处理细胞后,HTR8/SVneo细胞侵袭能力显著增强、其表达的基质金属蛋白酶2(MMP-2)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达上调。Klotho siRNA处理细胞后,HTR8/SVneo细胞侵袭能力显著减弱、其表达的MMP-2及MMP-9表达显著下调。结论:Klotho可能通过介导MMP-2和MMP-9的表达调节滋养细胞侵袭能力,为子痫前期发病机制的研究提供了新线索。     

hCG对HTR8 SVneo滋养层细胞系MMP 2表达的影响与调控机制

目的探讨绒毛膜促性腺激素（hCG）对滋养层细胞系HTR8 SVneo侵袭活性的影响及其可能的调控机制。方法将培养的HTR8 SVneo细胞根据处理因素分为对照组、低浓度hCG（10?IU/mL）刺激组、高浓度hCG（100?IU/mL）刺激组,再将HTR8 SVneo细胞分为对照组、hCG（100?IU/mL）刺激组、DPCPX(A1R特异性阻断剂）+hCG（100IU/mL）联合刺激组。采用RT PCR检测各组HTR8 SVneo细胞基质金属蛋白酶 2（MMP 2）的表达变化,明胶酶谱检测各组HTR8 SVneo细胞MMP 2蛋白水平的分泌变化。 结果高浓度hCG（100?IU/mL）较低浓度hCG（10?IU/mL）刺激后的HTR8 SVneo细胞MMP 2的表达与分泌均上升（P<均0.05）;腺苷受体A1R的表达同时升高（P<0.05）。阻断A1R的作用通路后,MMP 2的表达与分泌均下降（P均<0.05）。 结论随着hCG浓度的升高, HTR8 SVneo细胞的侵袭性逐步增强,其调控机制为通过促进A1R的表达而使MMP 2的分泌升高。     

QSOX1在子痫前期胎盘中的表达及其对滋养细胞凋亡和增殖功能的影响

目的：探究静息巯基氧化酶-1（quiescin sulfhydryl oxidase 1,QSOX1）在子痫前期（preeclampsia,PE）胎盘中的表达情况,QSOX1对滋养细胞的生物学行为的影响,及其参与PE发生的潜在机制。方法：收集2015年11月至2016年12月于重庆医科大学附属第一医院产科住院行选择性剖宫产术的孕妇的胎盘组织,包括正常足月妊娠组（31 例）和PE组（35例）。正常氧条件下,人绒毛外滋养细胞系（human transformed primary extravillous trophoblast cell line,HTR8/SVneo）细胞分为小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）阴性对照组（siControl）和QSOX1特异siRNA干扰组（siQSOX1）,每组6例样本,实验重复3次。缺氧条件下,HTR8/SVneo细胞分为4组,分别为正常氧处理组（0 h）、缺氧6 h处理组（6 h）、缺氧12 h处理组（12 h）和缺氧24 h处理组（24 h）,每组各6例样本,实验重复3次。采用Western blot法检测正常孕妇与PE孕妇胎盘中QSOX1的差异表达以及HTR8/SVneo细胞缺氧处理后QSOX1和缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的蛋白表达。利用siRNA技术干扰HTR8/Svneo细胞QSOX1的表达,用Western blot法检测转染细胞活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved caspase）相关蛋白和细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达水平。并利用流式细胞术检测转染细胞凋亡,比色法检测转染细胞的增殖情况。结果：QSOX1在PE胎盘中的表达明显高于正常胎盘（0.955±0.285 vs. 3.921±0.960）（P=0.001）。缺氧处理HTR8/SVneo细胞后QSOX1和HIF-1α的表达均明显升高(1.183±0.160 vs. 3.987±0.098;1.051±0.444 vs. 1.912±0.118）（均P=0.000）。下调QSOX1后HTR8/SVneo细胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达明显减少（2.940±0.514 vs. 1.075±0.121;9.223±1.230 vs. 1.011±0.019）（P=0.004;P=0.000）,而CyclinD1的蛋白表达增加（1.851±0.972 vs. 4.189±0.399）（P=0.018）。QSOX1干扰后HTR8/SVneo细胞凋亡能力减低[（21.007±2.214）% vs. （10.057±0.388）％]（P=0.001）,增殖能力增加（0.389±0.162 vs. 1.401±0.059）（P=0.020）。结论：QSOX1高表达引起滋养细胞凋亡增加和增殖减少,可能参与PE的发生。     

DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的机制

目的利用RNA干扰技术探讨DNA-PKcs基因沉默影响肝癌细胞BEl7402/5-FU耐药性的机制。方法将靶向DNA-PKcs的干扰质粒shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU,利用实时荧光定量PCR及Western blot法检测转染干扰质粒后DNA-PKcs基因的沉默效率;Western blot检测Artemis、磷酸化Artemis蛋白水平的表达。结果实时荧光定量PCR及Western blot检测结果显示转染shDNA-PKcs后,DNA-PKcs mRNA及蛋白水平表达均下调（P〈0.05）;Western blot检测结果显示shDNA-PKcs转染组Artemis蛋白表达水平与对照组相比均有所降低（P〈0.05）,磷酸化Artemis蛋白表达水平在转染前后无明显变化（P〉0.05）。结论 ShDNA-PKs干扰质粒能抑制Bel-7402/5FU细胞中DNAPKcs、Artemis蛋白的表达、但对P-Artemis的表达无影响。     

Talin1在输卵管妊娠患者的输卵管和绒毛中高表达并促进妊娠滋养细胞的侵袭

目的 验证Talin1在妊娠输卵管组织及输卵管妊娠绒毛中的表达差异及对HTR-8/SVneo细胞侵袭、迁移的影响,探讨其作用机制。方法 采用免疫组化及Western blot检测Talin1在妊娠输卵管组织及输卵管妊娠绒毛中的表达定位及蛋白表达差异;HTR-8/SVneo细胞内转染Talin1 siRNA,划痕实验及Transwell实验检测Talin1对HTR-8/SVneo细胞侵袭、迁移的影响;qRTPCR及Western blot检测HTR-8/SVneo细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Snail的表达。结果 正常输卵管组织及妊娠输卵管组织中均可检测到Talin1的阳性表达,主要表达于纤毛细胞的细胞质中;妊娠输卵管组织中Talin1的蛋白表达高于正常输卵管组织（P<0.01）;输卵管妊娠绒毛中Talin1表达高于宫内妊娠绒毛（P<0.01）;沉默Talin1抑制HTR-8/SVneo细胞的侵袭（P<0.01）和迁移（P<0.05）;Talin1下调HTR-8/SVneo细胞中N-cadherin、MMP-2、Snail的表达（P<0.05）,上调MMP-9的表达（P<0.05）。结论 输卵管妊娠患者的输卵管组织及绒毛中Talin1的表达显著升高,输卵管妊娠的发生可能和Talin1调控妊娠滋养细胞的侵袭相关。     

和厚朴酚通过UbcH8诱导AML1-ETO蛋白降解

目的：研究和厚朴酚诱导AML1-ETO蛋白降解的可能机制。方法：用10、20、40 μmol/L的和厚朴酚处理Kasumi-1细胞,分别在24 h和48 h后qRT-PCR检测AML1-ETO、UbcH8 mRNA的表达;Western blot法检测蛋白表达;40 μmol/L和厚朴酚处理24 h,基因芯片分析寻找靶基因;构建UbcH8过表达质粒,通过反转录病毒转染Kasumi-1细胞,检测AML1-ETO蛋白;通过短发夹RNA（shRNA）敲除UbcH8的表达,40 μmol/L和厚朴酚处理48 h,同时检测AML1-ETO和UbcH8蛋白;构建异种移植小鼠模型,和厚朴酚处理,检测肿瘤的成瘤性和相关蛋白表达。结果：和厚朴酚减少Kasumi-1细胞中AML1-ETO蛋白的表达,并具有浓度和时间依赖性,但没有影响AML1-ETO mRNA的表达;和厚朴酚处理后的AML1-ETO蛋白稳定性降低;基因芯片分析发现,和厚朴酚将UbcH8 mRNA的表达提高了约4倍;和厚朴酚处理后,Kasumi-1细胞中的UbcH8 mRNA和蛋白的表达量均升高;过表达UbcH8的Kasumi-1细胞中,AML1-ETO蛋白表达量减少;用和厚朴酚处理UbcH8敲除后的Kasumi-1细胞,AML1-ETO的降解被阻断;和厚朴酚抑制了异种移植小鼠模型的肿瘤生长,肿瘤中的AML1-ETO蛋白显著降低,而UBCH8表达升高。结论：和厚朴酚能通过UbcH8降解白血病细胞中的AML1-ETO蛋白。     

Gadd45α对绒毛外滋养细胞迁移和侵袭能力影响的相关研究

目的：研究人生长阻滞和DNA损伤45α（growth arrest and DNA damage 45 alpha,Gadd45α）基因对滋养细胞HTR8/SV－neo增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学功能的影响,探讨其在子痫前期（preeclampsia,PE）发生发展中的可能作用。方法：构建Gadd45α短发夹干扰RNA,以阴性对照组作为参照,转染人滋养细胞HTR8/SVneo,即分为实验组（si-Gadd45α）和阴性对照组（si-NC）进行实验;应用流式细胞仪检测转染效率,并应用qRT-PCR和Western blot检测转染后各组细胞中Gadd45α mRNA和蛋白表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）显色法检测转染后各组细胞增殖能力;应用流式细胞仪对转染后各组细胞进行细胞凋亡分析;采用Transwell法检测转染后各组细胞迁移和侵袭能力;采用早孕绒毛外植体培养模型观察敲除Gadd45α基因后对绒毛外滋养细胞外生性迁移能力的影响;收集各组细胞培养上清液,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）的表达,蛋白免疫印迹检测基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of MMPs,TIMPs）的表达。结果：流式细胞仪检测转染效率约为 90％;转染后实验组较对照组Gadd45α mRNA的表达量约降低80%,蛋白表达水平约下降70%,差异均有统计学意义（P<0.01）,证明干扰Gadd45α表达成功。MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,结果显示实验组和对照组细胞增殖和凋亡均无统计学差异（P >0.05）。Transwell实验表明干扰Gadd45α后HTR8/SVneo侵袭能力明显增加,约为对照组的1.65倍;迁移能力也明显增加,约为对照组的2倍,均有统计学差异（P<0.01）。早孕绒毛外植体培养结果显示：与阴性对照组的绒毛相比,Gadd45α干扰片段处理的绒毛外滋养细胞外生性迁移的距离明显增加,差异有统计学意义（P=0.005）。明胶酶谱实验结果显示干扰Gadd45α后基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases,MMP-2）和MMP-9的活性增强,而Western blot检测发现其抑制因子TIMP-1和TIMP-2相应地下降（P<0.01）。结论：推测Gadd45α可能是通过调控蛋白酶的活性来抑制滋养细胞的迁移和侵袭,从而参与PE的发生发展。     

RNAi干扰HMGB1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的 探讨高迁移率族蛋白1 (high mobility group box 1,HMGB1 )siRNA干扰后对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响.方法 构建靶向HMGB1 mRNA的质粒载体pRI-GFP-1、pRI-GFP-2以及阴性对照载体pRI-GFP-Neg,分别转染乳腺癌细胞MCF-7,48 h、72 h后免疫印迹法(Western blot)检测HMGB1基因蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测体外增殖活性.结果 转染后,与空质粒组pRI-GFP-Neg相比,pRI-GFP-1组、pRI-GFP-2组MCF-7细胞HMGB1蛋白表达下降,MTT显示干扰组细胞增殖速率与质粒对照及空白对照组相比显著降低.结论 应用RNAi技术可以显著干扰HMGB1蛋白的表达,进而有效抑制MCF-7细胞的增殖活性.     

低氧经miR-130a-3p靶向Sirt7对人滋养细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化的影响

目的 探究低氧条件下miR-130a-3p靶向去乙酰化酶7(Sirt7)对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移、侵袭及上皮-间质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法 以HTR-8/SVneo细胞为研究对象，将miR-130a-3p inhibitor及其阴性对照inhibitor-NC转染至细胞中或联合Sirt7抑制剂97491干预，采用低氧(1%O₂)处理48 h, qRT-PCR检测细胞中miR-130a-3p及Sirt7 mRNA表达水平；Transwell检测细胞迁移和侵袭能力；Western blot检测细胞中Sirt7、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平；TargetScan Human 7.1在线软件和双荧光素酶报告基因实验预测并验证miR-130a-3p与Sirt7的靶向关系。结果 低氧可上调HTR-8/SVneo细胞中miR-130a-3p表达水平，下调Sirt7 mRNA和蛋白表达水平；miR-130a-3p低表达可升高Sirt7 mRNA表达水平；提高细胞迁...     

敲低和敲除OPTN基因SKOV3细胞的构建及其对抗癌药物敏感性的影响

目的利用RNA干扰技术建立稳定敲低OPTN蛋白的人SKOV3细胞株和利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立稳定敲除OPTN蛋白的人SKOV3细胞株,并研究降低OPTN基因表达对细胞抗癌药物敏感性的影响。方法针对OPTN基因设计shRNA和sgRNA的序列,并与慢病毒载体质粒pGPU 6_GFP_Neo和敲除质粒PX 459载体连接产生重组载体。并将重组的质粒测序验证,将测序成功的重组质粒载体与包装质粒(psPAX 2、pMD 2.G)共转染293 T细胞进行病毒包装,收集病毒上清液并感染SKOV3细胞,获得稳定敲低和稳定敲除OPTN基因的SKOV3细胞株。RT-PCR检测敲低组OPTN基因的表达的变化,PCR检测敲除组的基因组DNA的变化,Western blot法分析检测OPTN蛋白的表达情况。MTT法检测DDP对卵巢癌细胞增殖的影响,qRT-PCR检测caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA的表达情况,Western blot检测caspase3、Bax、和Bcl-2蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒载体和基因敲除载体,在SKOV...     

Drp1缺失通过ABCB10激活线粒体未折叠蛋白反应

目的：在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中探讨动力相关蛋白1(dynamin related protein 1, Drp1)基因缺失激活线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,mtUPR)的分子机制。方法：采用不同浓度 (0、2.5、5.0、10.0mmol/L)3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)处理Drp1敲除或敲低的MEF细胞、Drp1抑制剂Mdivi-1或选择性阻断Drp1与下游蛋白相互作用的小分子多肽P110处理的MEF细胞以及相应对照,随后进行Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、ATP 结合盒 B 亚家族成员 10(ATP binding cassette subfamily B member 10,ABCB10)、Lon肽酶1(Lon peptidase 1,LONP1)以及热休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60) 的表达。RT-qPCR 检测Drp1敲低或Mdivi-1处理后MEF细胞的ABCB10的mRNA水平。同时敲低Drp1和ABCB10,Western blot检测CHOP蛋白的表达,试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量,流式细胞术检测线粒体活性氧和线粒体膜电位水平。结果：3-NP处理后,Drp1敲除或敲低的MEF细胞以及Mdivi-1或P110处理的MEF细胞中CHOP表达呈现倍数上调。Drp1敲除或敲低的MEF细胞以及Mdivi-1或P110处理的MEF细胞中ABCB10蛋白表达上调,mtUPR效应蛋白LONP1和 Hsp60表达上调。Drp1敲低的MEF细胞和Mdivi-1处理的MEF细胞中ABCB10 mRNA水平上调。同时敲低Drp1和ABCB10后, 与Drp1敲低组相比,CHOP表达下调,LDH含量降低,线粒体活性氧水平降低,线粒体膜电位水平增加。结论：在MEF细胞中, Drp1表达下调可引起ABCB10表达量增加,导致mtUPR关键蛋白CHOP、LONP1和Hsp60蛋白表达上调,进而激活mtUPR。     

Notch1 miRNA干扰质粒构建及功能鉴定

目的设计及构建大鼠Notch1微小干扰核糖核酸(miRNA)干扰质粒,最终筛选出效果最好的干扰质粒。方法针对大鼠Notch1基因分别设计3对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒,基因测序鉴定,经Lipofectamine 2000转染至H9c2心肌样细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光确定转染效率,Western blot检测3对干扰质粒、阴性对照质粒对Notch1胞内结构域(N1ICD)表达的影响。结果测序表明,Notch1干扰序列及读码框完全正确,荧光显微镜观察H9c2心肌样细胞miRNA瞬时转染效率在80%左右。Western blot显示miRNA6637对Notch1干扰效果最强。结论成功构建大鼠Notch1 miRNA的有效干扰质粒,为Notch1信号通路在心血管领域的功能研究奠定了基础。     

Notch1过表达对K562细胞增殖及其周期的影响

目的 研究外源性Notch1过表达对慢性粒细胞白血病细胞株K562增殖和细胞周期的影响.方法 用脂质体将携带Notch1胞内段(ICN1)的质粒转染入K562细胞,倒置相差显微镜观察转染前后K562细胞形态学变化,RT-PCR 和Western blot检测Notch1 mRNA和蛋白的表达,MTT比色法检测细胞增殖,...     

hTERT上调FOXM1乙酰化影响胃癌细胞侵袭能力

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse enzyme,hTERT)促进胃癌细胞侵袭的分子机制.方法 构建稳定过表达hTERT的细胞株SGC-7901-hTERT,采用Western blot检测叉头盒蛋白(forkhead box M1,FOXM1)的表达,qRT-PCR和Western blot检测FOXM1下游侵袭相关基因基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA和蛋白表达;构建FOXM1的shRNA干扰质粒,在SGC-7901-hTERT细胞中转染该质粒,Transwell法检测细胞侵袭能力,qRT-PCR和Western blot检测MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达;构建FOXM1启动子活性报告质粒,在SGC-7901-hTERT细胞中用双荧光素酶报告实验检测FOXM1启动子活性,qRT-PCR检测FOXM1 mRNA表达;构建稳定过表达FOXM1的细胞株SGC-7901-HA-FOXM1,并在此细胞中转染hTERT过表达质粒,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测FOXM1乙酰化水平变化,免疫荧光实验检测hTERT与FOXM1的细胞定位.结果 与对照组比较,过表达hTERT促进FOXM1及其下游分子MMP-2、MMP-9的蛋白表达,同时也促进肿瘤细胞侵袭(P＜0.01),但不影响FOXM1的启动子活性及mRNA表达;与过表达hTERT组比较,干扰FOXM1可抑制MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达,同时也抑制肿瘤细胞侵袭(P＜0.01);hTERT与FOXM1存在细胞共定位,且过表达hTERT可上调FOXM1乙酰化水平.结论 hTERT通过上调FOXM1乙酰化促进胃癌细胞侵袭.     

间歇性缺氧通过内质网途径诱导滋养层细胞凋亡

目的 分析间歇性缺氧对人绒毛膜滋养层细胞(HTR8/SVneo)内质网应激及凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法 选用人绒毛膜滋养层细胞(HTR8/SVneo),间歇性缺氧-24 h组和间歇性缺氧-48 h组分别进行24 h和48 h的间歇性缺氧处理,空白对照组始终置于常氧中培养。观察间歇性缺氧对细胞凋亡与增殖,以及内质网应激相关分子、细胞凋亡相关蛋白、细胞周期相关蛋白和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。结果 与空白对照组比较,间歇性缺氧组CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、激活转录因子6(ATF6)、X-盒结合蛋白1(XBP-1)mRNA和蛋白表达水平显著增加,早期凋亡率显著增加,Caspase-3蛋白、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)mRNA和蛋白表达水平显著增加,HIF-1αmRNA和蛋白表达水平显著增加,并随缺氧时间延长而增加(P<0.05);与空白对照组比较,间歇性缺氧可显著抑制HTR8/SVneo细胞增殖,并随缺氧时间延长而细胞活力降低(P<0.05);与空白对照组比较,间歇性缺氧组细胞周期蛋白D1(C...     

BRCA2对乳腺癌癌症干细胞的影响及其机制研究

目的 探讨乳腺癌易感基因2(breast cancer suscepbility gene 2, BRCA2)对上皮型乳腺癌癌症干细胞的影响及从Notch信号角度分析其机制。方法 利用本实验室前期建立的反转录病毒干扰载体pMSCVneo/eGFP-U6构建BRCA2的载体, 合成慢病毒颗粒, 转染上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞。筛选出单克隆细胞后, 利用Western blot法检测MCF7细胞中干扰BRCA2的效果。球形成试验分析干扰BRCA2后对MCF7上皮型乳腺癌干细胞的影响。克隆形成试验分析BRCA2下调后对MCF7上皮型乳腺癌干细胞增殖能力的影响。Western blot法检测乳腺癌癌症干细胞自我更新因子Notch1和Notch4在干扰BRCA2的上皮型乳腺癌中的影响。结果 干扰BRCA2的反转录病毒载体和对照载体测序正确, 可以合成反转录病毒。Western blot法发现干扰BRCA2的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞中BRCA2的表达较对照细胞显著下调。球形成试验结果显示干扰BRCA2的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞球形成数量较对照细胞显著增加。克隆形成试验结果显示干扰BRCA2的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞克隆形成能力较对照细胞显著增加。Western blot法检测结果显示干扰BRCA2的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞中Notch1的表达较对照细胞显著上调, 未在对照和干扰BRCA2的MCF7细胞中检测到Notch4的表达。结论 BRCA2沉默的上皮型乳腺癌细胞系MCF7细胞可通过上调Notch1表达使其形成癌症干细胞的能力增加。     

Notch1表达与乳腺癌细胞迁移及侵袭能力的相关性

目的 研究Notch1的表达与乳腺癌细胞迁移侵袭能力的相关性.方法 以RT-qPCR及Western blot检测细胞株MCF-7及MCF-7/ADR中Notch1基因及蛋白的表达情况;以Transwell小室进行迁移实验和侵袭实验检测上述细胞株的迁移、侵袭能力.结果 MCF-7/ADR的Notch1 mRNA表达水平明显高于MCF-7[(0.074 8±0.004 3)vs.(0.046 1±0.002 2)],差异有统计学意义(P<0.05);MCF-7/ADR的Notch1蛋白表达水平明显高于MCF-7[(1.636 0±0.042 2)vs.(0.622 0±0.028 6)],差异有统计学意义(P<0.05);MCF-7/ADR的迁移及侵袭的穿膜细胞数均明显多于MCF-7的穿膜细胞数[(60.16±5.27) vs.(13.88±3.16);(13.62±2.25) vs.(9.62±1.30)],差异均有统计学意义(均P<0.05).Notch1 mRNA及蛋白的表达水平与乳腺癌细胞侵袭、迁移能力呈正相关.结论 Notch1信号通路参与调控乳腺癌细胞的侵袭与迁移能力,阻断该通路活化将可能抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移.