异丙酚上调miR-21表达改善大鼠缺血/再灌注损伤学习记忆的机制

目的:研究异丙酚对大鼠缺血/再灌注损伤后学习记忆的影响及机制。方法:建立大鼠脑中动脉缺血(MCAO)模型,实验分为假手术组、模型组、异丙酚处理组、miR-21类似物组;水迷宫检测大鼠学习记忆;免疫印迹和免疫荧光检测损伤侧海马自噬相关蛋白表达;聚合酶链锁反应(QRT-PCR)检测miR-21的表达水平。结果:和假手术组比较,模型组海马组织miR-21水平下降(P<0.05),空间记忆下降,自噬性死亡相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达上升(P<0.05)。而异丙酚处理能够逆转中动脉缺血引起的miR-21的下降,改善学习记忆,下调Beclin1和LC3-Ⅱ的表达(P<0.05)。miR-21类似物也能阻止MCAO造模引起的miR-21的下降、改善学习记忆、阻止Beclin1和LC3-Ⅱ的表达(P<0.05)。结论:异丙酚通过上调miR-21从而阻止缺血再灌注海马细胞自噬性死亡和学习记忆下降。     

海马外泌体中miR-219a-1-3p对神经干细胞向神经元分化的影响

目的：探讨海马外泌体中miR-219a-1-3p对神经干细胞(neural stem cells, NSCs)向神经元分化的影响。方法：切割穹窿海马伞,构建去神经支配海马大鼠模型,分离提取切割组和正常组海马外泌体,与SD大鼠海马NSCs共培养,利用实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)、Western Blot和免疫荧光技术检测外泌体在NSCs向神经元分化中的作用;通过RNA-seq方法检测外泌体中表达变化的miRNA,利用Real-time PCR对差异表达的miR-219a-1-3p进行验证,并检测其在成年SD大鼠各组织以及NSCs、星形胶质细胞和神经元中的表达水平。利用miR-219a-1-3p mimic转染NSCs,Real-time PCR、Western Blot和细胞免疫荧光检测miR-219a-1-3p对NSCs向神经元分化的影响。结果：切割组海马组织外泌体可促进NSCs向神经元分化;海马组织外泌体中差异表达的miR-219a-1-3p与RNA-seq结果一致;miR-219a-1-3p在端脑和海马中呈现优势表达;miR-219a-1-3p在NSCs中表达较高,而在星形胶质细胞中表达较低;过表达miR-219a-1-3p可抑制NSCs向神经元分化。结论：海马外泌体促进NSCs向神经元分化可能与miR-219a-1-3p下调有关。     

血清中microRNA对非小细胞肺癌早期转移潜在的诊断价值

目的 对转移和未转移非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中外泌体进行测序,探讨血清外泌体中微小RNA(miRNA)对NSCLC早期转移诊断价值.方法 超高速离心法提取转移NSCLC和未转移NSCLC患者血清中外泌体,Arraystar人类miRNA微阵列检测2组外泌体中差异表达的miRNA.选择30例NSCLC转移患者和30例NSCLC未转移患者进行实时定量聚合酶链式反应验证基因芯片检测结果.结果 全部患者血清外泌体RNA浓度和纯度达到基因芯片检测标准,转移NSCLC患者血清外泌体中差异上调表达基因为miR-4436a,miR-4687-5p.差异下调表达基因miR-22-3p,miR-3666,miR-4448,miR-4449,miR-6751-5p,miR-92a-3p.实时定量聚合酶链式反应结果和基因芯片结果一致,miR-4436a上调2.11倍,miR-4687-5p上调2.09倍,miR-22-3p下调0.43倍,miR-3666下调0.41倍,miR-4448下调0.39倍,miR-4449下调0.46倍,miR-6751-5p下调0.45倍,miR-92a-3p下调0.41倍.结论 肺癌患者血清外泌体中miR-4436a,miR-4687-5p,miR-22-3p,miR-3666,miR-4448,miR-4449,miR-6751-5p,miR-92a-3p差异表达可以对NSCLC的早期转移起到提示作用.     

三维球体间充质干细胞移植对大鼠缺血再灌注损伤脑组织TNF-α及凋亡相关蛋白表达的影响

目的 观察三维(3-D)球体间充质干细胞(MSCs)移植对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)及凋亡相关蛋白表达的影响,探讨3-D球体MSCs的神经保护作用及可能机制。 方法 实验大鼠随机分为假手术组、溶剂对照组、3-D球体MSCs治疗组(n=36),假手术组常规分离大脑中动脉(MCA)但不结扎,MSCs治疗组采用线栓法建立大脑中动脉缺血(MCAO)模型后给予MSCs移植,溶剂对照组模型建立成功后给予等体积溶剂对照。各组大鼠分别于移植治疗后1、3、7 d进行神经功能评分;采用ELISA和RT-PCR方法检测大鼠脑组织中的TNF-α表达;采用免疫组化SABC法染色,观察损伤侧大鼠脑组织Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达。 结果 与假手术组、溶剂对照组相比,MSCs治疗组大鼠神经运动功能评分降低(P <0.05);与假手术组相比,溶剂对照组大鼠脑组织TNF-α、Caspase-3和Caspase-8表达增加(P <0.01);与溶剂对照组相比,MSCs治疗组脑组织TNF-α、Caspase-3、Caspase-8表达下降(P <0.05,P <0.01)。 结论 3-D球体MSCs移植可能通过下调脑组织中炎性因子TNF-α含量及减少凋亡相关蛋白的表达,改善大鼠脑缺血再灌注损伤后神经运动功能。     

抑制miR-30a/HMGA2介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗诱导的细胞凋亡的作用

目的：探讨微小RNA(microRNA,miR)-30a/高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗(以下简称化疗)药物诱导的细胞凋亡的影响。方法：随机选取30例经化疗药物治疗后表现为化疗敏感和化疗抵抗的骨肉瘤患者组织,分为化疗敏感组(n=15)和化疗抵抗组(n=15),采用real-time PCR检测两组中miR-30a和HMGA2的mRNA表达水平,以及骨肉瘤细胞U2-OS经不同浓度的化疗药物(顺铂、阿霉素、氨甲蝶呤)处理后miR-30a的mRNA表达水平;采用蛋白质印迹法检测细胞内自噬相关因子Beclin 1,自噬微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、自噬抑制因子P62的表达情况。在骨肉瘤细胞U2-OS中转染miR-30a模拟物和抑制剂,构建miR-30a高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况;采用单丹磺酰尸胺(monodansylcada,MDC)染色法检测细胞内自噬水平,ROS荧光探针-二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)检测细胞内ROS水平,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡程度,线粒体膜电位荧光探针JC-1检测细胞线粒体氧化损伤程度;采用双荧光素酶法检测miR-30a与HMGA2的相互作用,同时通过转染HMGA2模拟物和HMGA2-shRNA干扰质粒载体,构建HMGA2高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况。结果：化疗抵抗组中miR-30a的mRNA水平显著低于化疗敏感组(P<0.05),HMGA2的表达与miR-30a相反(均P<0.05)。在相对低浓度(5 μml/L)的化疗药物刺激下,骨肉瘤细胞U2-OS内的miR-30a mRNA表达下调,Beclin 1和LC3B均显著上调(均P<0.01),P62显著下调(P<0.01)。在miR-30a高表达组中,与对照组相比,Beclin 1和LC3B的表达水平与miR-30a明显下降(P<0.05),P62的表达水平明显升高(P<0.05),在miR-30a低表达组中则相反;在经过化疗药物处理后的miR-30a高表达组中,细胞自噬水平更低,细胞存活率更低,ROS水平更高,线粒体氧化损伤程度更高,细胞凋亡水平更高(均P<0.05),miR-30a低表达组则相反(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测验证了miR-30a与HMGA2的靶向互补配对关系;与对照组相比,HMGA2高表达组中Beclin 1和LC3B的表达水平与HMGA2明显升高(P<0.05),P62的表达水平明显下降(P<0.05),在HMGA2低表达组中则相反。结论：积极发挥miR-30a/HMGA2抑制骨肉瘤细胞自噬的功能,能够破坏细胞应对ROS介导的自噬与凋亡的平衡,增强化疗药物对细胞的杀伤作用。     

宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向TJP1调控血管内皮细胞层通透性促癌细胞转移的分子机制研究

目的 探讨宫颈癌细胞分泌的外泌体miR-191-5p对血管内皮细胞层的通透性影响,为肿瘤血管相关的基因靶点研究提供理论依据。方法 提取并鉴定宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)培养上清来源的外泌体。将宫颈癌细胞源外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养,检测外泌体的摄取。跨内皮电阻(TEER)测定HUVEC单层细胞形成时间。内皮细胞层通透性测定HUVEC细胞层通透性。qRT-PCR检测宫颈癌细胞、外泌体及与外泌体共培养48 h的HUVEC中miR-191-5p表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-191-5p与TJP1的靶向关系。qRT-PCR、Western blot检测miR-191-5p、TJP1表达。内皮细胞层穿透实验检测miR-191-5p对HUVEC细胞层通透性的影响以及能否促进宫颈癌转移。恢复实验、qRT-PCR、Western blot检测TJP1的表达。结果 提取的微小囊泡确是宫颈癌源外泌体。宫颈癌源外泌体可被HUVEC细胞摄取。TEER随时间增加而增大,在培养3 d时细胞形成单层,TEER达到最大值;外泌体共培养的HUVEC细胞层通透性增大,差异有统计学意义(P&...     

一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区细胞自噬的影响

目的 探究一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME）对大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型大鼠再灌注后24 h脑内一氧化氮（nitric oxide,NO）和自噬相关蛋白Beclin1、LC3B表达的影响,探讨L-NAME保护脑缺血再灌注损伤的机制。方法 18只健康雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术（Sham）组、MCAO组,和MCAO+L-NAME组,每组6只。使用改良线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉缺血90 min再灌注模型。术中监测大鼠肛温,使其维持在正常范围。于再灌注后24 h处死大鼠,迅速取脑,用免疫荧光染色检测小鼠脑组织冰冻切片缺血半暗带区Beclin1和LC3B的表达水平,用免疫荧光双标分别将Beclin1和LC3B与NO介导的蛋白质损伤标志物3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）进行共定位。结果 Sham组大鼠没有3-NT染色阳性细胞,偶见Beclin1和LC3B染色阳性细胞,MCAO组小鼠脑组织缺血半暗带区3-NT、Beclin1、LC3B均大量表达（P<0.05）。与MCAO组相比,给予L-NAME治疗后,缺血再灌注大鼠脑组织半暗带区3-NT、Beclin1、LC3B表达均明显减少（P<0.05）。缺血再灌注小鼠脑组织半暗带区,Beclin1和LC3B分别与3-NT免疫荧光染色共定位。结论 L-NAME通过抑制NOS活性,减少NO的产生,直接避免神经元的氧化应激损伤;同时,氧化应激损伤的减弱也避免了自噬的进一步激活,起到了间接的神经保护作用。     

外泌体转运miR-324-5p对胃癌MGC-803细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨外泌体转运微小RNA(miR)-324-5p对胃癌MGC-803细胞增殖及凋亡的影响。方法培养人胃癌细胞系MGC-803并提取外泌体,制备外泌体转运miR-324-5p模拟物(mimic)。细胞分为对照组(细胞不进行处理)、外泌体组(外泌体混悬液)和miR-324-5p mimic组(加入外泌体转运miR-324-5p mimic混悬液),制备移植瘤模型。检测各组摄取外泌体效率。MTT法和流式细胞术检测细胞增殖率和凋亡率,qRT-PCR和Western blotting法检测各组瘤体中miR-324-5p、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和微管相关蛋白1轻链3(LC3)mRNA及蛋白的表达。结果外泌体组和miR-324-5p mimic组MGC-803细胞摄取外泌体效率分别为60%和57%。与对照组和外泌体组比较,miR-324-5p mimic组MGC-803细胞增殖率降低,凋亡率增加(P＜0.05);裸鼠移植瘤质量和CyclinD1 mRNA及蛋白降低,抑瘤率、miR-324-5p、p21、LC3 mRNA及蛋白增加(P＜0.05)。结论外泌体转运miR-324-5p能抑制MGC-803细胞增殖和促进MGC-803细胞凋亡,其机制可能是增加移植瘤中p21和LC3水平,降低CyclinD1水平,从而提高抑瘤率,降低移植瘤质量。     

骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-214-3p调控IKBKB基因促进宫颈癌细胞焦亡

目的 探究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC）外泌体源性miR-214-3p调控B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子激酶β（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta,IKBKB）对宫颈癌细胞的影响。方法 采用生物信息学方法分析宫颈癌组织中异常表达的微RNA,最终选择miR-214-3p作为目的基因,并确定其下游靶基因IKBKB;检测宫颈癌患者的癌组织及癌旁组织中miR-214-3p、IKBKB的表达情况;提取并鉴定BMMSC外泌体,干预外泌体中miR-214-3p的表达水平,构建IKBKB过表达质粒,将改造后的外泌体及质粒分别转染至宫颈癌HeLa细胞,测定转染后不同组别宫颈癌细胞焦亡相关指标。结果 生物信息学和实验检测均发现miR-214-3p在宫颈癌组织和细胞中低表达,而在BMMSC外泌体中高表达,且BMMSC源性外泌体可显著提高宫颈癌细胞中miR-214-3p的表达水平;IKBKB基因是miR-214-3p的下游靶点,在宫颈癌组织和细胞中高表达;高表达miR-214-3p可促进宫颈癌细胞焦亡,过表达IKBKB基因后宫颈癌细胞的焦亡水平显著降低。结论 BMMSC分泌的外泌体通过携带miR-214-3p调控IKBKB促进宫颈癌细胞焦亡。     

间充质干细胞来源的外泌体通过microRNA-21-5p调节心脏自噬并影响心肌缺血大鼠的心脏功能

目的探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分泌的外泌体(exosome,Exos)是否通过miR-21-5p调节心脏自噬并影响心肌缺血大鼠的心脏功能。方法在体外,观察MSCs-Exos对H_2O_2刺激H9C2s的影响;通过CCK-8测定法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;荧光显微镜检测细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生;免疫印迹分析自噬相关蛋白和荧光GFP-LC3测定自噬体形成。在大鼠MI/RI模型中,通过TUNEL测定、免疫组织化学染色及超声心动图分别检查了MSCs-Exos对细胞凋亡、心肌LC3B表达和心脏功能影响。结果在体外实验中,MSCs-Exos显著提高了H_2O_2刺激的H9C2细胞活力(P0. 05),降低了ROS的产生和细胞凋亡率(P0. 05)。而与H_2O_2+MSCs-Exos组相比,H_2O_2+MSC-ExossimiR~(-21-5p)组细胞活力显著降低(P0. 01),ROS的产生和细胞凋亡率显著增加(P0. 01)。Western blot检测显示:与H_2O_2组相比,H_2O_2+MSCs-Exos组LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的表达显著增强(P0. 01),p62的表达显著降低(P0. 01);与H_2O_2+MSCs-Exos组相比,H_2O_2+MSC-ExossimiR~(-21-5p)组的LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的表达显著降低(P0. 05),p62的表达显著增强(P0. 05)。自噬通量结果:与H_2O_2组比较,H_2O_2+MSCs-Exos组细胞中存在的GFP-LC3点数增加;而与H_2O_2+MSCsExos组相比,H_2O_2+MSC-ExossimiR~(-21-5p)组细胞中存在的GFP-LC3点数显著降低(P0. 05)。在体内,RT-qPCR分析结果显示:在MSCs-Exos中和MI/RI后心肌组织中miR-21-5p的表达均呈正相关性。与其他各组相比,MI/RI+MSCs-Exos组的LC3B表达显著增强(P0. 01);心肌细胞凋亡显著减少(P0. 01);分数缩短率(FS%)和左心室射血分数(LVEF)均显著提高(P0. 05)。结论 MSCs-Exos可通过调节心肌自噬改善MI/RI大鼠的心脏功能,其作用机制可能与miR-21-5p转移有关。     

血浆外泌体miR-26a-5p和miR-151a-3p在结核病中的表达及诊断价值

目的 研究miR-26a-5p和miR-151a-3p在结核病血浆外泌体中的表达差异性及其诊断价值。方法 通过生物信息学网站筛选结核病外泌体中具有差异性表达的miRNAs(miR-26a-5p和miR-151a-3p)。再以70例结核病患者(结核病组),58例体检健康者(健康对照组)样本进行临床验证：采用差速离心法提取血浆外泌体,透射电子显微镜,粒径分析,Western blot对其鉴定,采用RT-qPCR检测血浆外泌体中miR-26a-5p和miR-151a-3p在结核病组和对照组中的表达水平,并通过ROC曲线评价二者在结核病中诊断价值。结果 透射电镜、粒径分析、Western blot鉴定到典型的外泌体特性,即成功提取到血浆外泌体。在临床验证中,以内参和外参同时校准,结核组患者血浆外泌体中miR-26a-5p表达水平低于对照组(P<0.000 1),结核组患者血浆外泌体中miR-151a-3p表达水平高于对照组(P<0.000 1),与生物信息学结果一致。作为诊断标记,以内参为基准,血浆外泌体miR-26a-5p、miR-151a-3p鉴别结核病的曲线下面积(AUC)分...     

血浆外泌体通过微小RNA⁃25⁃3p对心肌纤维化影响的初步研究

目的：初步明确血浆外泌体及其内容物微小RNA-25-3p(microRNA-25-3p，miR-25-3p)对心肌纤维化的影响。方法： 分别提取10只健康C57BL/6小鼠(对照组)和10只心肌梗死术后小鼠(心肌纤维化模型组)的血浆外泌体。利用电镜、纳米跟踪颗粒分析、标志物蛋白检测鉴定外泌体；实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测两种外泌体对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)诱导下的小鼠心脏成纤维细胞纤维化水平的影响；qPCR检测两种外泌体内miR-25-3p的水平；Western blot和免疫荧光染色检测miR-25-3p模拟物和抑制物对心脏成纤维细胞增殖和向肌成纤维细胞分化能力的影响。结果：对照组血浆外泌体可使Ang Ⅱ诱导增加的纤维化相关指标下调，而心肌纤维化模型组外泌体则失去这一功能且其内miR-25-3p含量更高；miR-25-3p模拟物上调纤维化相关指标，而miR-25-3p抑制物则表现相反作用。结论：健康小鼠血浆外泌体可改善心肌纤维化；血浆外泌体内的miR-25-3p上调可促进心肌纤维化发生。 [关键词] 心肌梗死；心肌纤维化；血浆外泌体；miR-25-3p     

不同严重程度哮喘患者血清外泌体中微RNA-21的表达水平及其诊断价值

目的 研究血清外泌体中微RNA-21（miR-21）表达水平及其对哮喘严重程度的诊断效能。方法 以82例未经治疗的哮喘患者和80名健康人作为研究对象。将哮喘患者根据病情严重程度分为4组：间歇状态20例、轻度持续22例、中度持续22例、重度持续18例。用qPCR检测各组血清外泌体中miR-21的表达水平,并进行比较。用Spearman相关分析研究血清外泌体中miR-21表达水平与哮喘严重程度的相关性。通过受试者工作特征（ROC）曲线评价外泌体中miR-21表达水平对哮喘严重程度的诊断效能。结果 间歇状态、轻度持续、中度持续和重度持续的哮喘患者血清外泌体中miR-21表达水平均高于健康对照组,差异均有统计学意义（P均<0.01）,且哮喘患者各组间miR-21表达水平差异也有统计学意义（P均<0.01）。Spearman相关分析结果显示,血清外泌体中miR-21的相对表达量与哮喘严重程度呈正相关（r=0.974,P=0.016 7）。血清外泌体中miR-21对间歇状态、轻度持续、中度持续、重度持续哮喘患者诊断效能的ROC曲线下面积分别为0.657、0.769、0.847、0.916（P均<0.01）。结论 血清外泌体中miR-21表达水平对治疗前哮喘严重程度有较高的诊断效能,有望成为判断哮喘严重程度的一种无创性诊断标志物。     

miR-146a通过调节IRAK1影响急性胰腺炎炎症自噬机制的研究

目的 探究miR-146a在急性胰腺炎中的作用及机制。方法 用牛磺石胆酸3磷酸盐（TCLs）刺激AR42J细胞构建胰腺炎体外细胞模型,qPCR及ELISA法检测细胞miR-146a、白细胞介素1受体相关激酶1 (IRAK1)以及炎症因子白细胞介素6 (IL-6)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)的表达变化,Western blot检测自噬相关分子LC3和p62的表达;分别过表达miR-146a和IRAK1,检测IL-6、TNF-α、LC3和p62等分子的表达变化;设计IRAK1 3’UTR与miR-146a结合位点突变质粒,通过荧光素酶报告基因实验探究miR-146a是否可以直接靶向IRAK1。结果 TLCs可以浓度依赖性地抑制miR-146a和诱导IRAK1表达,并可促进IL-6、TNF-α、LC3和抑制p62的表达。过表达miR-146a可在一定程度上阻断TLCs的作用;荧光素酶报告基因结果显示,miR-146a直接靶向并负性调控IRAK1分子。结论miR-146a通过靶向IRAK1抑制TLCs诱导的AR42J细胞炎症及自噬的发生。     

尼莫地平对脑缺血大鼠自噬的影响

目的: 研究尼莫地平对大鼠脑缺血自噬的影响及治疗作用。方法: 将90只SD大鼠随机均分为大脑中动脉局灶性线栓法(MCAO)模型组(缺血模型组)、尼莫地平组、假手术组,每组30只。根据Zea Longa评分选取实验用模型鼠。制备MCAO大鼠模型,采用蛋白质印迹法检测LC3 Ⅱ、Beclin 1、m TOR／p mTOR蛋白表达。应用TTC染色观察脑组织梗死体积,HE染色观察脑组织细胞损伤状况。制备星形胶质细胞氧糖剥夺(OGD)模型,将细胞分为空白对照组、OGD模型组、尼莫地平组,采用蛋白质印迹法检测LC3 Ⅱ、Beclin 1、m TOR／p mTOR蛋白,CCK8实验检验星形胶质细胞活性。结果： 与假手术组相比,缺血模型组LC3 Ⅱ、Beclin 1蛋白以及m TOR／p mTOR蛋白表达明显增加(P均<0.05)。与缺血模型组相比,尼莫地平组LC3 Ⅱ、Beclin 1蛋白表达明显降低,m TOR蛋白表达明显增加(P<0.05),脑组织梗死体积和细胞死亡数明显降低(P均<0.05)。在OGD试验中,与OGD模型组相比,尼莫地平组细胞活性升高,LC3 Ⅱ、Beclin 1蛋白表达降低(P<0.05)。 结论： 尼莫地平可抑制脑缺血大鼠自噬发生,降低自噬对脑组织的损伤。     

二氧化硅刺激的巨噬细胞源性外泌体miRNA表达谱差异

目的：分析游离二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)粉尘刺激的RAW264.7巨噬细胞源性外泌体miRNA的表达差 异。方法：以SiO2(200 mg/L)刺激RAW264.7巨噬细胞48 h(exo_48 h组)后收集上清液,超速离心法提取上清中的外泌 体;使用透射电镜扫描、纳米微粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术、蛋白质印迹法鉴定外泌体;提 取外泌体miRNA行高通量测序,比较exo_control组(以不含SiO2粉尘的培养基孵育RAW264.7巨噬细胞48 h)与exo_48 h 组外泌体miRNA表达差异;采用miRanda,TargetScan和starBase 3个软件进行差异miRNA的靶基因预测,对靶基因进行 GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,进一步分析基因的生物学功能。结果：在透 射电镜下,外泌体为不均匀分布的、圆形或椭圆形的、脂质膜包被的、直径30~100 nm的囊泡;粒径检测显示其体积 峰度集中在40~100 nm;蛋白质印迹法显示外泌体标志蛋白质TSG101表达阳性。高通量测序筛选出148个差异表达的 外泌体miRNA。与exo_control组相比,exo_48 h组miR-219c-3p,let-7d-3p,let-7a-1-3p,miR-328-3p,miR-365-3p,miR- 7219-3p等显著上调,miR-378d和miR-5106等显著下调。靶基因预测结果、GO和KEGG分析结果显示靶基因主要富集 在mTOR信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路等。结论：SiO2诱导的巨噬细胞产生的外泌体包含丰富的miRNA, 且其表达存在显著差异,这些差异的miRNA可能参与了肺成纤维细胞的活化、上皮间质转化等过程。     

ABT-737对M2型TAM来源外泌体处理的卵巢癌细胞SKOV3自噬性凋亡与干性特征的影响

目的 探讨Bcl-2小分子抑制剂ABT-737对经肿瘤相关巨噬细胞(TAM)来源外泌体(Exo)处理的卵巢癌细胞自噬性凋亡及干性特征的作用。方法 利用佛波酯(PMA)与重组人白细胞介素-4(IL-4)诱导人外周血单核细胞THP-1为M2型TAM,流式细胞术检测细胞表面巨噬细胞相关标志物表达;差速离心法提取外泌体,透射电镜与纳米粒子追踪技术观察外泌体形态及径粒分布,Western blot检测外泌体标志蛋白表达,Dil结合PKH67染色检测TAM来源外泌体被卵巢癌细胞系SKOV3摄取情况;实验分组为对照组、Exo组、Exo+ABT-737组,采用TAM来源外泌体与ABT-737按照分组处理SKOV3细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,双荧光mRFP-GFP-LC3实验检测细胞自噬水平,Western blot检测细胞自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin-1、p62)与凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3)表达,肿瘤细胞成球实验检测细胞干性,Western blot检测肿瘤干细胞相关蛋白(CD133、OCT4、SOX2)表达。结果 经PMA与IL-4...     

肿瘤外泌体来源的miR-126-5p通过抑制NLRC3促进口腔鳞癌细胞的增殖和迁移

目的 探索口腔鳞癌外泌体中miR-126-5p对肿瘤细胞生物学功能的影响.方法 qPCR分析口腔鳞癌组织芯片、临床样本及口腔鳞癌外泌体中miR-126-5p的表达情况;荧光素酶报告基因法确定与miR-126-5p相互作用的分子,qPCR检测外泌体与共孵育后的肿瘤细胞中NOD样受体家族蛋白3(NLRC3)的表达情况;通过体外细胞增殖及划痕实验,以及体内肿瘤生长反映含有miR-126-5p外泌体对肿瘤细胞生物学功能的影响.结果 芯片分析表明口腔鳞癌组织中miR-126-5p高表达,患者组织(P<0.05)及口腔鳞癌细胞系中miR-126-5p同样高表达(P<0.001),荧光素酶报告实验表明miR-126-5p与NLRC3相互作用,且miR-126-5p对NLRC3存在负性调控关系(P<0.01);此外,含有miR-126-5p的外泌体与细胞共孵育或沉默NLRC3可以促进肿瘤细胞增殖(P<0.001)及迁移(P<0.0001),且含有miR-126-5p的外泌体可以抑制NLRC3的体内表达(P<0.001),促进肿瘤的生长(P<0.001).结论 肿瘤细胞分泌的外泌体miR-126-5p可以抑制NLRC3的表达从而促进口腔鳞癌的进展.     

lncRNA C2dat2调控小鼠大脑中动脉栓塞再灌注损伤及神经元自噬和凋亡

目的分析lncRNA C2dat2调控小鼠大脑中动脉栓塞再灌注损伤(MCAO/R)及神经元自噬、凋亡的作用机制。 方法构建小鼠MCAO/R模型,实验分为假手术组、模型组、negative shRNA组和C2dat2 shRNA组。HE染色检测大脑组织病理学变化,改良神经功能缺陷评分评估小鼠神经功能,TUNEL染色检测大脑组织细胞凋亡水平,荧光定量PCR检测脑组织半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)mRNA表达。Western blotting检测脑组织自噬蛋白水平。 结果模型组小鼠脑组织病理损伤明显,降低C2dat2表达后病理损伤明显改善。除假手术组外,神经功能缺陷评分其他组均随时间依次下降,且C2dat2 shRNA组低于negative shRNA组(P＜0.05)。细胞凋亡率模型组和negative shRNA组高于假手术组,C2dat2 shRNA组低于negative shRNA组(P＜0.05)。LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1、Caspase-3和p-p38MAPK表达水平模型组和negative shRNA组高于假手术组,C2dat2 shRNA组低于negative shRNA组(P＜0.05)。 结论C2dat2表达下调可减轻小鼠MCAO/R损伤,抑制细胞自噬和凋亡,其机制可能与MAPK信号通路有关。     

抑制miR-128-3p表达对油酸致大鼠肺损伤的保护作用研究

目的 探讨抑制miR-128-3p表达对油酸致大鼠肺损伤的保护作用及可能机制.方法 随机将100只SD大鼠分成5组:假手术组(sham组)、模型组(Model组)、antagomir NC组(NC组)、miR-128-3p antagomir组(antagomir组)和miR-128-3p antagomir+ Nrf2抑制剂ML385组(antagomir+ML385组),每组20只.采用尾静脉注射油酸(0.15 ml/kg)的方法建立肺损伤大鼠模型,术前1h给予miR-128-3p an-tagomir或ML385进行干预.造模成功24 h后,测定动脉血氧分压(PaO2)、氧合指数(OI)及肺组织湿/干重比(W/D);苏木精-伊红染色法(HE)观察肺组织病理学改变并评分;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)含量;比色法测定肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平;反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)检测肺组织中miR-128-3p表达水平以及E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶-1(HO-1)的mRNA水平;蛋白质印迹免疫(Western blot)检测肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平;荧光素酶报告基因实验验证miR-128-3p与Nrf2的靶向作用关系.结果 与sham组比较,Model组大鼠肺组织损伤严重,肺组织病理评分、W/D值、BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量,肺组织中ROS和MDA水平以及miR-128-3p表达水平增加(P＜0.01),而PaO2、OI值和SOD活性以及Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平均降低(P＜0.01);与Model组比较,an-tagomir组大鼠肺组织损伤程度得到明显改善,肺组织病理评分、W/D值、BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量,肺组织中ROS和MDA水平以及miR-128-3p表达水平下降(P＜0.01),而PaO2、OI值和SOD活性以及Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平均上升(P＜0.01),而NC组大鼠以上各指标差异无统计学意义(P＞0.05);与antagomir组比较,an-tagomir+ ML385组大鼠以上各指标变化趋势又发生逆转(均P＜0.01).荧光素酶报告基因实验证实,miR-128-3p能靶向调控Nrf2的表达.结论 抑制miR-128-3p表达可显著减轻模型大鼠的肺损伤,其作用机制可能与通过靶向调控Nrf2表达,抑制肺组织炎症反应有关.