Peroxiredoxin2基因RNAi慢病毒载体构建及对SW480细胞增殖的影响

目的：构建Peroxiredoxin2（PRDX2）基因RNA干扰（RNAinterference,RNAi）慢病毒表达载体,探讨PRDX2基因干扰后对结直肠癌SW480细胞增殖的影响。方法设计、合成靶向PRDX2的RNA干扰的序列,构建pGC‐EGFP‐shPRDX2慢病毒载体并进行鉴定,同时应用qRT‐PCR和Westernblot方法观察转染的SW480结肠癌细胞PRDX2mRNA和蛋白表达的抑制效果,并通过MTT、平板克隆形成实验检测细胞增殖变化。结果成功构建PRDX2基因慢病毒载体并经测序证实;pGC‐EGFP‐shPRDX2可有效抑制结直肠癌SW480细胞PRDX2的表达,感染慢病毒的SW480细胞中PRDX2mRNA和蛋白表达水平明显降低（P＜0．05）;SW480细胞经PRDX2RNA干扰后其生长和增殖能力显著降低（P＜0．05）。结论PRDX2基因RNAi慢病毒表达载体在SW480细胞中表达稳定可靠,PRDX2基因干扰后有效抑制了结直肠癌SW480细胞的增殖和生长,为进一步探讨PRDX2在结直肠癌发生、发展及转移中的作用奠定基础。     

含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。     

CDC42沉默对结直肠癌细胞形态的影响

目的根据CDC42蛋白二级结构,设计CDC42 siRNA干扰片段,构建CDC42稳定干扰shRNA载体。观察CDC42有效沉 默对结直肠癌SW480细胞形态的影响。方法根据CDC42基因CDS区序列,设计4条siRNA片段。Western blot筛选最有效沉 默片段,酶切插入真核表达载体,将构建的shRNA质粒载体,瞬时转染结直肠癌SW480细胞,QPCR及Western blot验证CDC42 沉默效率;观察转染前后,SW480细胞形态变化。结果4条siRNA转染细胞后,验证结果显示siRNA-3沉默效率大于50%,沉 默效果最好,将此片段插入真核表达载体,测序结果提示CDC42 shRNA构建成功,转染SW480细胞后,CDC42基因mRNA及 蛋白水平表达明显下降,差异有统计学意义;显微镜观察CDC42沉默后,SW480细胞周边伪足伸出减少,细胞变光滑,细胞整体 体积明显减小。结论成功根据基因序列设计有效沉默片段,构建CDC42稳定沉默载体,证实CDC42沉默可以逆向改变结直 肠癌细胞高侵袭性形态,为研究CDC42对结直肠癌的发生、发展提供分子工具。     

慢病毒转染KISS1基因对人结直肠癌HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的：探讨慢病毒转染KISS1基因过表达对结直肠癌HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并阐明其作用机制。方法：选取KISS1基因低表达结直肠癌细胞株,构建慢病毒载体并转染KISS1基因,分为对照组（PBS处理）、空载体组（转染空载体）和过表达组（转染含KISS1载体）。荧光显微镜检查转染的荧光率（MOI）,Real-time PCR和Western blotting法检测各组细胞中KISS1mRNA和蛋白（metastin）的表达量,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活力,Transwell小室法检测各组细胞侵袭和迁移能力。结果：LoVo、SW620 、SW480、HCT-116和HT29细胞中,HCT-116细胞中KISS1mRNA和蛋白表达量相对最低,因此筛选其作为研究载体。包装有KISS1基因的慢病毒感染HCT-116细胞后,能够稳定表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因,MOI均>80%。与对照组和空载体组比较,过表达组细胞中KISS1 mRNA和蛋白表达量明显升高（P<0.05）,细胞增殖活力明显降低（P<0.05）,侵袭能力和迁移能力亦明显下降（P<0.05）;与对照组比较,空载体组细胞增殖活力、侵袭能力和迁移能力差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：慢病毒转染KISS1基因能够过表达KISS1蛋白及抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力,其机制可能与KISS1蛋白表达有关。     

沉默p53凋亡刺激蛋白抑制因子抑制结直肠癌细胞的增殖

目的探索p53凋亡刺激蛋白抑制因子(iASPP)在结直肠癌组织/细胞中的表达及iASPP沉默后对结直肠癌细胞增殖的影响。方法该研究首先检测临床样本结直肠癌组织和癌旁正常组织中iASPP mRNA的表达差异、结直肠癌细胞系和正常结肠上皮细胞系(HCoEpiC)mRNA和蛋白质iASPP表达差异;然后在人结肠癌细胞SW480中转染iASPPsiRNA,用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测iASPP mRNA表达效率,用免疫印迹试验(Western blot)检测iASPP的蛋白表达水平;最后用MTT法和Brd U法检测沉默iASPP对SW480细胞增殖的影响。结果结直肠癌组织中,iASPP mRNA表达相比癌旁正常组织上调;结直肠癌细胞LoVo、SW620和SW480中iASPP mRNA和蛋白质表达相比正常结肠上皮细胞系(HCoEpiC)均上调;在SW480细胞中转染iASPP-siRNA可下调iASPP的表达;沉默iASPP可抑制结直肠癌细胞的增殖。结论沉默iASPP基因抑制结直肠癌细胞的增殖。     

慢病毒载体靶向介导p66shc基因沉默

目的：构建p66shc基因重组慢病毒表达载体,并将之转染至293T细胞,通过RNA干扰致使p66shc基因沉默,为进一步研究p66shc基因功能奠定基础。方法筛选3个RNA靶点,命名为p66shc‐shc1、p66shc‐shc2、p66shc‐shc3,与双酶切后的pLenR‐绿色荧光蛋白（GPH）（含有GFP表达）连接,转化入感受态的DH5α细胞,挑取阳性克隆测序正确后,与pRsv‐REV、pM‐Dlg‐pRRE、pMD2G一起转染293T细胞,于倒置荧光显微镜下检测GFP的表达,证实病毒包装成功。使用荧光定量PCR及Westernblot技术检测p66shc在基因及蛋白水平的表达,选取有效沉默p66shc基因的p66shc‐shc1靶点,为后续试验做准备。结果成功构建表达p66shc的shRNA慢病毒载体并转染至真核生物细胞内,通过荧光定量PCR及Westernblot技术检测其通过RNA干扰导致细胞内p66shc基因沉默。结论靶向表达p66shc的shRNA慢病毒载体,转染入真核生物细胞内可通过RNA干扰在分子及蛋白水平导致p66shc基因沉默。     

大鼠线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体.方法 PCR扩增获得Nix基因序列,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接获得Nix过表达重组慢病毒载体;以Nix为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-U6-Scramble-Puro载体连接获得Nix shRNA重组慢病毒载体;将病毒包装辅助质粒与上述重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清液并浓缩获得慢病毒浓缩液,3倍梯度稀释法测定病毒滴度;用病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤酶素筛后得到稳定感染细胞株;荧光显微镜检测Nix荧光水平,Western blot检测Nix蛋白的表达.结果 成功构建Nix基因过表达和shRNA慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒.重组病毒感染PC12细胞后,荧光显微镜检测Nix基因过表达细胞荧光水平增加,shRNA感染细胞荧光水平降低;Western blot检测显示Nix基因过表达PC12细胞中Nix蛋白表达显著升高,shRNA慢病毒感染细胞中Nix蛋白表达明显降低,而Nix shRNA1干扰效果最好.结论 成功构建Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体,并获得Nix过表达与干扰细胞模型.     

敲低Piezo2对人结肠癌细胞HCT116和SW620增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨敲低机械敏感性离子通道Piezo2对人结肠癌细胞HCT116和SW620增殖、迁移侵袭能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测结直肠癌组织及其相应癌旁组织中Piezo2的mRNA和蛋白表达情况;Western blot检测Piezo2在正常结肠上皮细胞NCM460、结肠癌细胞SW480和HCT116、结肠癌淋巴结转移细胞SW620的表达;将HCT116、SW620细胞系稳定转染Piezo2敲低慢病毒载体,利用RT-qPCR和Western blot检测转染后HCT116和SW620细胞的Piezo2表达情况;CCK-8法检测转染后HCT116和SW620细胞的增殖能力;Transwell法和细胞划痕修复实验检测转染后HCT116和SW620细胞的侵袭和迁移能力;通过裸鼠皮下成瘤检测HCT116和SW620细胞敲低Piezo2后肿瘤大小变化,通过免疫组化检测ki67表达。结果 RT-qPCR及Western blot实验显示,癌组织Piezo2的mRNA和蛋白表达均高于癌旁组织（P均<0.05）;Wes...     

稳定过表达miR-27b的结直肠癌细胞模型的建立及意义

目的利用慢病毒表达载体建立稳定过表达miR-27b的结直肠癌细胞系,探讨miR-27b对结直肠癌细胞生物学特性的影响及作用。方法构建miR-27b过表达重组慢病毒载体,经包装病毒后感染结直肠癌细胞SW480,利用流式细胞仪分选获得绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性细胞并荧光定量PCR检测miR-27b表达情况,建立稳定过表达miR-27b的结直肠癌细胞系;通过MTT法和Transwel检测过表达miR-27b后细胞体外增殖、侵袭能力的变化。结果稳定过表达miR-27b的结直肠癌细胞中miR-27b的表达水平是空载体对照细胞中miR-27b的5.02倍;与对照细胞相比,miR-27b过表达能够促进结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05)。结论成功建立了稳定过表达miR-27b的结直肠癌细胞模型,为深入研究miR-27b在结直肠癌发生发展过程中的作用、调控靶基因和相应的作用机制奠定了基础。     

siRNA靶向HDGF抑制大肠癌细胞SW480的生长

目的 肝癌衍生生长因子(HDGF)是近年来逐渐引起重视的一种细胞生长因子,在许多肿瘤细胞中高表达.本研究拟构建PNAi干扰慢病毒载体,沉默HDGF基因在大肠癌SW480细胞中的表达,观察细胞的增殖状态.方法 RT-PCR方法 检测HDGF基因在大肠癌中的表达.利用Invitrogen公司在线网站设计HDGF干扰序列,片段合成后构建慢病毒RNAi表达载体,随后利用293FT细胞将其包装成成熟慢病毒颗粒去感染SW480细胞,经Biasticidin抗性选择培养后,建立了稳定表达HDGF siRNA的SW480细胞株.实时荧光定量PCR和Western Blot检测HDGF基因在mRNA和蛋白水平表达变化;生长曲线和MTT法观察细胞增值情况的改变.结果 HDGF基因在大肠癌SW480细胞中表达较高.成功的构建了HDGF慢病毒KNAi表达载体,并建立了稳定表达靶向干扰HDGF基因表达的siRNA SW480细胞株.沉默HDGF基因在表达后,能明显体外抑制细胞的增殖.结论 针对HDGF基因的慢病毒RNAi载体能明显下调HDGF基因的表达,并在体外显著抑制大肠癌细胞增殖能力.     

IGF1R-shRNA重组慢病毒的构建及对肺癌A549细胞增殖的影响

目的 构建IGF1R基因的shRNA慢病毒载体,转染A549细胞鉴定沉默效率,观察其对A549细胞增殖能力的影响.方法 设计IGF1R干扰序列,与pGC-LV慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,感染A549细胞,应用RT-PCR和Western blot检测IGF1R干扰效果;细胞生长抑制实验、克隆形成实验及细胞周期检测评价其对A549细胞增殖的影响. 结果 成功构建了IGF1R-shRNA重组慢病毒并高效感染A549细胞,IGF1R mRNA及蛋白表达量分别下降74.51％,70.53％;细胞群体倍增时间显著延长,克隆形成能力显著降低,细胞周期阻滞于G0/G1期. 结论 本研究构建的重组慢病毒能显著抑制IGF1R表达,抑制A549细胞增殖.     

长链非编码RNA LINC01106通过STAT3通路调控结直肠癌细胞增殖及凋亡

目的 探讨LINC01106在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞增殖及凋亡能力的影响。方法 分析公共数据库结直肠癌患者的肿瘤组织及正常组织LINC01106表达水平及其对患者预后的影响;构建LINC01106敲减及过表达结直肠癌细胞株;采用CCK-8实验检测LINC01106敲减及过表达对结直肠癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测LINC01106敲减对结直肠癌细胞凋亡水平的影响;免疫印迹检测LINC01106敲减对结直肠癌细胞p-STAT3、STAT3、Bcl-2蛋白表达的影响;建立裸鼠移植 瘤模型观察LINC01106表达水平对结直肠肿瘤体内生长的影响,随机分为2组,9只/组。对照组：接种SW480细胞,敲减组：接种LINC01106敲减的SW480细胞。结果 TCGA数据库分析结果显示结直肠癌肿瘤组织LINC01106的表达水平明显高于正常组织,且LINC01106的表达水平与结直肠癌患者预后相关,差异具有统计学意义（P<0.05）;敲减LINC01106可以明显抑制SW480结直肠癌细胞增殖,促进凋亡（P<0.05）,过表达LINC01106可以明显促进SW480结直肠癌细胞增殖;敲减LINC01106可以抑制p-STAT3和Bcl-2蛋白表达水平;下调LINC01106可以抑制裸鼠移植瘤体内生长。结论 LINC01106在结直肠癌患者肿瘤组织中表达显著上调,且与患者预后相关。INC01106可以通过STAT3/Bcl-2信号调控SW480结直肠癌细胞增殖及凋亡;LINC01106有望成为结直肠癌诊断及预后评估的潜在标志物。     

构建过表达/干扰多梳蛋白2的人胶质瘤细胞系

目的 构建过表达/干扰多梳蛋白2(polycomb-like 2,PCL2)基因重组慢病毒并稳转胶质瘤U251细胞系。方法 过表达PCL2重组慢病毒载体pLVX-hPCL2-3flag-ZsGreen-Puro和干扰PCL2重组慢病毒载体pLVXshRNA2-Puro-hPCL2通过克隆技术成功构建,在293T细胞中导入质粒载体完成慢病毒包装,经过干预HEK293获得转染效率,病毒滴度采用逐孔稀释梯度法测得。将构建好的hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒转染胶质瘤U251细胞,倒置显微镜下观察荧光强度及范围,Western blot检测PCL2蛋白的表达情况。结果 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒载体,Western blot结果显示,相比对照组和空载组,目的蛋白在转染过表达PCL2重组慢病毒U251细胞中表达明显升高,在转染干扰PCL2重组慢病毒U251细胞中表达降低（P均<0.05）。结论 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒的U251细胞系。     

敲减TLR2基因对结直肠癌细胞增殖的抑制作用及其机制

目的：应用慢病毒RNA干扰技术敲减结直肠癌细胞中Toll样受体2（TLR2）基因,探讨其对结直肠癌细胞增殖的作用,并阐明其作用机制。方法：将处于对数生长期的结直肠癌HCT116细胞和HT29细胞分为未感染对照组、阴性对照组及基因敲减组（TLR2-RNAi组）,分别给予无慢病毒感染、慢病毒RNAi及慢病毒TLR2-RNAi稳定转染。感染后采用蛋白印迹法检测各组细胞中TLR2蛋白表达水平,采用CCK-8法和流式细胞术检测各组细胞增殖活性及不同细胞周期细胞百分率,蛋白印迹法检测各组细胞中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（PI3K/Akt）和核因子κB（NF-κB）细胞信号通路相关蛋白及细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin D3蛋白表达水平。结果：与未感染对照组和阴性对照组比较,TLR2-RNAi组HCT116细胞和HT29细胞中TLR2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与未感染对照组和阴性对照组比较,TLR2-RNAi组HCT116细胞和HT29细胞增殖活性明显降低（P<0.05）,S期和G₂期细胞百分率明显降低（P<0.05）,G₁期细胞百分率明显升高（P<0.05）。与未感染对照组和阴性对照组比较,TLR2-RNAi组HCT116细胞和HT29细胞中PI3K、p-Akt、p-NF-κβ、cyclin D1和cyclin D3蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。结论：敲减TLR2基因可以通过调控PI3K/Akt和NF-κB细胞信号通路及细胞周期相关蛋白cyclin D1和cyclin D3的表达而抑制结直肠癌细胞的增殖。     

慢病毒载体介导RNA干扰抑制大肠癌细胞HT29的酪氨酸激酶受体RON基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大肠癌细胞RON基因的干扰效率,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株。方法应用实时聚合酶链反应(PCR)检测大肠癌细胞DLD-1、HCT116、LOVO、RKO、SW480、HT29的RONmRNA表达情况,筛选出表达丰度能满足RNAi的大肠癌靶细胞HT29。根据人RON基因序列,构建4种慢病毒载体质粒pGCSIL/RON-短发夹RNA(shRNA),转染包装细胞293T,获得4种重组慢病毒pGCSIL/RON-shRNA,分别感染HT29细胞。应用实时PCR检测各组HT29细胞RONmRNA表达情况,筛选出RON干扰效率最高的一种shRNA慢病毒载体质粒,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株HT29/RON-shRNA。结果 DLD-1、HCT116、RKO、SW480、HT29细胞RON表达丰度能满足RNAi的需要,选择HT29细胞作为RNAi的靶细胞。阴性对照病毒感染的细胞样品相对正常未感染病毒的细胞目的基因的相对表达水平为(94±5)%,RONshRNA-1靶点病毒感染的细胞为(86±5)%,RONshRNA-2靶点病毒感染的细胞为(67±6)%,RONshRNA-3靶点病毒感染的细胞为(63±6)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞为(30±8)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞的表达水平显著低于其他细胞(P值均<0.01),其对目的基因的沉默效果达到(70±8)%。结论慢病毒介导RNAi能显著抑制大肠癌细胞HT29的RON基因的表达,慢病毒载体介导的RNAi是一种高效的"基因沉默"的手段。     

稳定干扰长链非编码RNA LINC01224结直肠癌细胞株的建立及其对细胞凋亡的影响

目的 建立稳定干扰长链非编码RNA(lncRNA) LINC01224表达的结直肠癌LoVo和SW620细胞株,并探讨下调LINC01224表达对结直肠癌细胞凋亡的影响。方法 使用GEPIA2数据库分析LINC01224在结直肠癌组织中的表达情况;qPCR法检测LINC01224在10种人结直肠癌细胞中的表达水平。3种不同的LINC01224 siRNA分别转染人结直肠癌LoVo细胞,取抑制LINC01224表达效果最显著的siRNA序列构建LINC01224 shRNA慢病毒载体。在HEK293T细胞内包装成重组慢病毒颗粒,再感染LoVo和SW620细胞,经嘌呤霉素筛选后以有限稀释法获得稳定干扰LINC01224的单克隆细胞。MTS法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 LINC01224在结直肠癌组织中的表达高于正常结直肠组织,其在10种结直肠癌细胞中的表达也高于正常结直肠上皮细胞HCOEPic。siRNA-3对LoVo细胞内LINC01224表达的抑制率高于siRNA-1和siRNA-2。故选择siRNA-3设计LINC01224 shRNA。与对照组(sh-NC组)...     

CaMKⅡ_γ通过上调NF-κB信号通路促进结直肠癌细胞的增殖

目的研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ)体内外促进结直肠癌细胞增殖的作用并探讨其机制。方法半定量RT-PCR法测定5种结直肠癌细胞系及20对结直肠癌组织及其配对癌旁组织中CaMKⅡγmRNA表达水平。用慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES2-eGFP制备慢病毒颗粒Lenti-CaMKⅡγ,转染SW620细胞,建立稳定表达CaMKⅡγ结直肠癌细胞系SW620-CaMKⅡγ。测定SW620-CaMKⅡγ细胞的生长曲线及克隆形成能力。Western blotting检测SW620-CaMKⅡγ细胞IKKα、IKKβ、IKKγ、p-IKKα/β、P-IκB和IκB表达水平。免疫荧光检测SW620-CaMKⅡγ细胞NF-κB p65核浆及核内的表达情况。检测裸鼠移植瘤的瘤体积。结果 CaMKⅡγ在5种结直肠癌细胞系中的mRNA水平均高,在20对组织中有18对癌组织mRNA水平比癌旁组织高。慢病毒转染的CaMKⅡγ过表达细胞系增殖能力增强(P<0.05)。CaMKⅡγ能够激活细胞内的NF-κB信号通路,促进NF-κ3 p65进核。CaMKⅡγ过表达细胞的裸鼠移植瘤瘤体积大于阴性对照(P<0.05)。结论 CaMKⅡγ体内外均能促进结直肠癌细胞的增殖,并激活NF-κB通路。     

SiRNA 抑制 p63 基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法 荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot 检测干扰效率。噻唑蓝（MTT）和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

SiRNA抑制p63基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

miR-30b-5p抑制胆固醇合成和结直肠癌细胞增殖

目的 探索 miR-30b-5p 在结直肠癌中的作用及机制.方法 收集结直肠癌患者的癌及癌旁组织、患者及正常人血清,提取RNA,实时荧光定量 PCR检测 miR-30b-5p表达.将miR-30b-5p的inhibitors转入HT-29 细胞中;将miR-30b-5p的mimics转入 HCT-116 细胞中;CCK-8 试剂盒检测细胞活力;胆固醇试剂盒检测细胞中胆固醇含量;实时荧光定量PCR检测低密度脂蛋白受体( LDLR)的表达,Western blot检测 LDLR 蛋白表达;在转入 miR-30b-5p inhibitors 的HT-29细胞中应用siRNA敲低LDLR,检测LDLR蛋白表达、细胞胆固醇含量及细胞增殖.结果 与正常人相比,miR-30b-5p在结直肠癌患者组织及血清中表达降低,且其在结直肠癌细胞系HT-29、Caco-2及HCT-116中的表达量低于正常结直肠细胞系NCM460;在HT-29细胞中转入miR-30b-5p的inhibitors,细胞增殖加快,胆固醇含量增加,LDLR表达上调;在HCT-116细胞中转入miR-30b-5p的mimics,细胞增殖减慢,胆固醇降低,LDLR表达被抑制;此外,在miR-30b-5p沉默的HT-29细胞中敲低LDLR,胆固醇含量减少,细胞增殖减慢.结论 miR-30b-5p在结直肠癌中是一种抑癌microRNA,它通过抑制LDLR和胆固醇合成抑制结直肠癌细胞增殖.