杯苋甾酮抑制破骨分化和促进成骨分化的双向作用治疗骨质疏松症

目的 研究杯苋甾酮对破骨和成骨分化的影响, 探讨其在改善骨质疏松中的作用.方法 以CCK8检测杯苋甾酮对小鼠源性单核巨噬细胞 (BMMs) 及前成骨细胞MC3T3E1的毒性作用;流式检测药物对细胞凋亡的影响.以TRAP染色观察破骨分化;以ALP染色评估成骨分化, 以Real-Time PCR检测TRAP及ALP的表达.15只小鼠分为假手术组、OVX组、治疗组.治疗组给予杯苋甾酮干预, 余2组以生理盐水处理.4周后取胫骨, Micro-CT检测骨质及微观结构变化.结果 杯苋甾酮≤10 mg/L时对细胞无毒性 (P>0.05) , 不影响凋亡 (P>0.05) .其可显著抑制破骨分化 (P<0.05) , 促进成骨分化.杯苋甾酮可抑制TRAP表达 (P<0.05) , 促进ALP表达 (P<0.05) .杯苋甾酮可改善雌激素缺乏导致的骨质疏松.结论 杯苋甾酮通过抑制破骨、促进成骨的双向作用达到改善骨质疏松的作用.     

橄榄苦苷对破骨细胞的分化以及骨吸收功能的影响

目的 探讨橄榄苦苷(oleuropein)对破骨细胞分化成熟以及骨吸收功能的影响及其可能机制.方法 把不同浓度的橄榄苦苷(12.5、25、50 μmol/L)分别加入由核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的体外破骨细胞培养体系中,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resist ant acid phosphatase,TRAP)染色方法观察呈TRAP阳性的多核细胞;RAW264.7细胞也用RANKL诱导,用流式细胞仪分析橄榄苦苷对破骨细胞凋亡的影响;在扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)下观察骨吸收陷窝,并用图像分析软件统计其面积.采用Western blot法检测橄榄苦苷对破骨细胞特异性蛋白组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、激活T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATC1)及相关信号通路蛋白表达的影响.结果 TRAP染色结果显示,橄榄苦苷能显著抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成,且呈浓度依赖性(P＜0.05);橄榄苦苷能下调破骨细胞特异性蛋白CTSK的蛋白表达水平(P＜0.05);橄榄苦苷对破骨细胞的凋亡无明显影响(P＞0.05);橄榄苦苷能显著减少骨吸收陷窝的面积(P＜0.05);橄榄苦苷能够下调NFATC1及磷酸化p38(p-p38)的表达(P＜0.05).结论 橄榄苦苷可以抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化以及破骨细胞的骨吸收功能,可能和橄榄苦苷能够下调p38/MAPK信号通路有关.     

尿石素A抑制BMMs向破骨细胞分化

目的 探究尿石素A对小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages, BMMs)向破骨细胞分化的影响。方法 提取小鼠骨髓腔BMMs,通过CCK-8法检测尿石素A对BMMs的增殖毒性,使用核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)诱导BMMs向破骨细胞分化并与浓度梯度尿石素A共培养,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色检测破骨细胞数量和面积大小,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测破骨分化相关基因水平表达,2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。结果 CCK-8法检测结果显示,尿石素A在16μmol/L范围内对BM...     

体外诱导树突状细胞向破骨细胞分化的研究进展

破骨细胞（OC）来源于骨髓来源的单核细胞,在骨代谢平衡中起重要作用.近年研究发现,免疫系统和骨系统关系密切,参与免疫调节的树突状细胞（DC）在多发性骨髓瘤（MM）环境下可以细胞融合方式转化为参与骨重建的bOC,且是比单核细胞更具分化效率的、更接近OC的前体细胞.这对于理解MM无疑有重要作用.该文就DC转化为OC的生物学过程及其临床意义予以综述.     

芒果苷对高糖状态成骨细胞骨向分化的影响

目的：研究芒果苷对高糖状态下MC3T3-E1成骨细胞骨向分化能力的影响。方法：采用低糖培养基(对照组)、高糖培养基(高糖组)和含40μmol/L芒果苷的高糖培养基(高糖+芒果苷组)分别体外培养MC3T3-E1成骨细胞。培养14 d后,茜素红染色法定量分析检测成骨细胞钙盐沉积量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞成骨相关蛋白碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OCN)的表达水平。结果：对照组光密度(OD)值、ALP、OCN蛋白表达水平高于高糖组与高糖+芒果苷组,高糖+芒果苷组OD值、ALP、OCN蛋白表达水平高于高糖组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：芒果苷可以促进高糖状态下MC3T3-E1成骨细胞的骨向分化。     

骨形态发生蛋白对人骨髓基质细胞的体外成骨分化影响

目的 提取牛骨形态发生蛋白，并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用，为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的缺损修复研究提供实验依据。方法 从小牛骨中的提取骨形态发生蛋白，配制条件培养液，并作用于培养状态的人骨髓基质细胞，染色检测细胞碱性磷酸酶，I型胶原表达情况，放免法测定培养液中骨钙素含量。结果 人骨髓基质细胞经衣导培养后，碱性磷酸酶，I型胶原，骨钙素表达明显增加。结论 体外培养时，天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化。     

淫羊藿黄酮苷及其代谢产物调控骨代谢的体外实验研究

为探讨淫羊藿黄酮苷及其代谢产物对骨形成和骨吸收的调控作用 ,利用酶水解法和酸水解法分别制备了淫羊藿黄酮苷的 2种代谢产物。采用鼠颅盖骨机械法分离和体外培养获得成骨细胞 ,采用新生兔长干骨机械分离法获得破骨细胞 ,采用VD3诱导鼠骨髓的造血干细胞分化成破骨样的多核巨细胞。实验组培养液为 1 0 %胎牛血清 +αMEM培养液 +不同浓度淫羊藿黄酮苷及代谢产物 ,对照组不加药。分别用四甲基偶氮唑盐和3H TdR法检测成骨细胞的增生和碱性磷酸酶 ,用骨钙素衡量成骨细胞的分化状态 ,用Actin ring染色观察破骨细胞形态变化 ,用图像分析仪分析体外骨吸收陷窝面积 ,用抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察OCL的形成 ,用RT PCR法检测和破骨样细胞形成有关的分子机制。发现 :淫羊藿黄酮苷及其代谢产物对大鼠成骨细胞的增生有明显的刺激作用 ,并能够促进成骨细胞合成分泌碱性磷酸酶 ,但对成骨细胞晚期分化指标骨钙素无显著作用。同时 ,使破骨细胞Actin ring回缩 ,从而使骨吸收陷窝面积减少。此外 ,淫羊藿黄酮苷及其代谢产物通过影响成骨细胞中RANKL和OPG的表达而达到抑制破骨样细胞形成。以上结果说明 ,淫羊藿黄酮苷及其代谢产物一方面抑制破骨样细胞形成和成熟的破骨细胞对骨基质的吸收 ,另一方面还能够通过刺激骨形成来调     

长链非编码RNA Kcnq1ot1促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化

Objective To investigate the regulatory role of long non-coding RNA Kcnq1ot1 in osteoclast differentiation, osteogenic difffferentiation and osteoporosis. Methods The expression of lnc-Kcnq1ot1, Bglap, Runx2, Alp, Bsp, Nfatc1, Mmp9, Ctsk and Oscar were detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR) in the femoral bones from mouse models of postmenopausal osteoporosis (ovariectomized mice, n=8), disuse osteoporosis (induced by tail suspension, n=14) and age-related osteoporosis (18-month-old mice, n=8), and also in MC3T3-E1 cells during osteoblast differentiation and in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) and RAW264.7 cells during osteoclast differentiation. MC3T3-E1 cells with lnc-Kcnq1ot1 knockdown by lentivirus infection were induced to differentiate into osteoblasts using osteogenic induction medium, and the expression of lnc-Kcnq1ot1, Alp and Bglap was detected with qRT-PCR and ALP activity was assessed with ALP staining. BMMs and RAW264.7 cells were transfected with siRNAs targeting lnc-Kcnq1ot1 and stimulated with RANKL and/or M-CSF, and the expression of lnc-Kcnq1ot1, Ctsk and Oscar was detected by qRT-PCR, and TRAP activity was assessed by TRAP staining. The subcellular localization of lnc-Kcnq1ot1 in MC3T3-E1 and RAW264.7 cells was determined using cell fractionation followed by qRT-PCR. Results The expression of lnc-Kcnq1ot1 was significantly upregulated during osteoblast differentiation but downregulated in the bone tissues of osteoporotic mice and during osteoclast differentiation (P<0.05). Silencing lnc-Kcnq1ot1 obviously decreased the expression of Bglap and Alp (P<0.05) and attenuated osteogenic medium-induced osteoblast differentiation. Knockdown of lnc-Kcnq1ot1 also promoted the expression of Ctsk and Oscar (P<0.05) and aggravated RANKL-induced osteoclast differentiation. The results of cell fractionation and qRT-PCR demonstrated that lnc-Kcnq1ot1 was located mainly in the nuclei of MC3T3-E1 and RAW264.7 cells. Conclusion Our data demonstrate that lnc-Kcnq1ot1 promotes osteogenic differentiation and alleviates osteoclast differentiation, suggesting the potential of lnc-Kcnq1ot1 as a therapeutic target against osteoporosis.     

WT161抑制小鼠破骨细胞分化及骨吸收的研究

目的 研究WT161对破骨细胞分化及骨吸收功能的作用及机制。方法 取8周龄雄性C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage,BMM）进行原代培养,通过CCK-8细胞毒性试验探究不同浓度WT161对BMM增殖的作用;通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察各浓度WT161对破骨细胞分化的影响;通过骨吸收试验探究各浓度WT161对破骨细胞骨吸收功能的作用;通过蛋白质印迹试验检测WT161对核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）p65、p-NF-κB p65及活化T细胞核因子（nuclear factor-activated T cell 1,NFATc1）信号通路的影响。结果 CCK-8结果显示当WT161浓度>0.63μmol/L时,WT161对BMM具有显著的抑制增殖作用;诱导破骨细胞分化时,WT161抑制BMM分化为破骨细胞,破骨细胞数目及铺展率明显减少;骨吸收试验显示WT161可显著抑制破骨细胞骨吸收功能;蛋白质印迹试验结果表明,WT161抑制NF-κB p65的磷酸化及下游NFATc1的表达。结论 WT161通过抑制NF-κB及下游的NFATc1信号通路从而抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能。     

不同代数RAW264.7细胞分化为破骨细胞样细胞的能力研究

目的:观察不同代数RAW264.7细胞形成破骨细胞样细胞的能力是否改变.方法:以细胞核因子κB受体激活物的配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)为诱导剂,选用第6、9、13、18、24代RAW264.7细胞在体外诱导6天,固定细胞行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-...     

全反式维甲酸对人牙周膜细胞向成骨分化的影响

目的检测全反式维甲酸(AT-RA)对人牙周膜细胞(hPDLCs)向成骨分化的影响。方法原代培养hPDLCs,用噻唑盐(MTT)方法检测AT-RA作用于细胞hPDLCs及对其增殖的影响,用酶动力方法检测对其碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,用茜素红染色方法检测对其形成钙盐沉积的影响。结果 AT-RA不影响hPDLCs的增殖活性,但能增强hPDLCs的ALP活性,并明显促进钙盐沉积。结论 AT-RA可以促进hPDLCs向成骨分化。     

仙茅酚苷类成分促进成骨细胞骨形成和抑制破骨细胞骨吸收

目的 以新生大鼠颅盖骨成骨细胞和由骨髓单核细胞诱导的破骨细胞为模型,观察仙茅代表性酚苷类成分仙茅苷、仙茅素A、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷的抗骨质疏松作用.方法 MTT法测定成骨细胞的增殖;磷酸苯二钠法测定成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)的活性;茜素红染色观察成骨细胞骨矿化结节的形成;TRAP染色测定破骨细胞的数目;罗丹明-鬼笔环肽染色和激光共聚焦显微镜观察成骨细胞细胞骨架和破骨细胞肌动蛋白环的结构和形态;将破骨细胞与骨片共同培养,计算机图像处理测定破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝的面积.结果 仙茅苷在10-9和10-8 mol/L的浓度下可促进成骨细胞的增殖(P＜0.05),10-7～10-5 mol/L浓度时抑制破骨细胞TRAP的活性(P＜0.05).仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷可减少破骨细胞的数目,抑制破骨细胞的形成(P＜0.05).仙茅苷在10-10mol/L,仙茅素A、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷在10-9 mol/L浓度时均可增加成骨细胞ALP的活性和骨矿化结节的形成(P＜0.01),在一定程度上使1,25-二羟维生素D3损伤的成骨细胞细胞骨架的结构得以恢复;减少破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝面积,破坏破骨细胞伪足和F-actin的结构.结论 仙茅酚苷类成分仙茅苷、仙茅素A、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷均可促进成骨细胞的骨形成,抑制破骨细胞的骨吸收,具有显著的抗骨质疏松作用.     

辛伐他汀促进骨髓基质细胞的成骨分化

目的：观察辛伐他汀对骨髓基质细胞成骨分化的影响，探讨其刺激成骨的作用机制。方法：体外培养成年小鼠骨髓基质细胞，不同浓度的辛伐他汀作用72h后，RT-PCR检测骨钙素(osteocalcin，OCN)mRNA水平的变化，Western blot检测OCN和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)表达水平的变化，细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)细胞化学染色及酶比活性测定。结果：辛伐他汀作用72h后，OCN的mRNA表达水平增高，OCN、OPN蛋白表达水平增高，呈剂量依赖关系，细胞ALP染色增强，ALP比活性显著增高。结论：辛伐他汀促进骨髓基质细胞的成骨分化，辛伐他汀刺激成骨的作用机制可能与此有关。     

黄芩素对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响

目的： 探讨中药黄芩提取物黄芩素对人牙周膜细胞（hPDLCs）增殖和成骨分化功能的影响。 方法：原代培养hPDLCs,向hPDLCs中分别加入浓度为0.3125、0.625、1.25 μmol/L的黄芩素作为实验组,对照组不加黄芩素。MTT法检测黄芩素对hPDLCs增殖的影响后,分别采用碱性磷酸酶（ALP）活性测定、茜素红S 染色、Real-time PCR和Western Blot法研究黄芩素对hPDLCs ALP活性、矿化结节形成、I型胶原（Col-I）mRNA和蛋白表达的影响。 结果： 与对照组相比,各浓度黄芩素对hPDLCs增殖均无明显影响;各浓度黄芩素组均表现为ALP活性上升;同时骨向诱导21 d后可见黄芩素组矿化结节形成增加,定量分析结果显示1.25 μmol/L黄芩素组形成矿化结节数量最多;Real-time PCR和Western Blot结果显示各浓度黄芩素组Col-ImRNA和蛋白表达均有上升,7 d时随浓度的增加其表达上升,1.25 μmol/L黄芩素组达到最高水平。     

ODF诱导骨髓细胞向破骨细胞分化

目的:研究小鼠骨髓细胞在破骨细胞分化因子(ODF)和单核巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的诱导刺激下向破骨细胞诱导分化的新方法。方法:分离小鼠骨髓细胞,ODF、M-CSF诱导培养,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,酒石酸酸性磷酸酶(T-ACP)阳性表达。结果:小鼠骨髓细胞在ODF和M-CSF作用下,表现为长梭形和圆形细胞增多,增大。体外培养6d,有多核T-ACP阳性细胞产生。结论:小鼠骨髓细胞在ODF和M-CSF共同诱导作用下分化成破骨细胞,为体外研究破骨细胞的分化发育和功能调节提供新方法。     

羧甲基赖氨酸对人外周血单核细胞破骨样转化的影响

目的：探讨羧甲基赖氨酸（ CML）对外周血单核细胞破骨样转化的影响。方法：从外周血分离提取单核细胞,分为3组：细胞核因子κB受体活化因子配基（ RANK-L）＋巨噬细胞集落刺激因子（ M-CSF）诱导组（ A组）,CML＋RANK-L＋M-CSF干预组（ B组）,空白对照组（ C组）。利用RANK-L和M-CSF诱导其破骨样转化,每天通过倒置显微镜观察细胞生长形态及计算细胞核个数,培养8d后通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法观察破骨样细胞的形成,Western blotting 检测破骨细胞标志物组织蛋白酶K蛋白表达。结果：随着培养时间的延长,A组TRAP阳性多核细胞数明显增加,B组TRAP阳性多核细胞数较A组明显减少（P＜0．05）,B组组织蛋白酶K表达亦较A组明显降低（P＜0．05）。结论：CML能够抑制外周血单核细胞向破骨样细胞转化。     

莫诺苷对小鼠T细胞体外活化与分化的影响

目的: 探讨山茱萸提取物莫诺苷对小鼠T细胞功能的影响及可能的机制。方法: 将C57BL/6小鼠脾脏制成单细胞悬液,采用抗CD3、抗CD28功能抗体模拟抗原刺激活化T细胞,分为对照组(不做任何处理)和莫诺苷组(10 μmol/L莫诺苷处理)。采用流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞表面分子CD69、CD25表达水平,以及其增殖、凋亡与分化为Th1、Th2、Treg等细胞的情况;利用实时荧光定量PCR检测细胞中Tbx21、Gata3、淋巴样增强因子1(lymphoid enhance factor 1, LEF1)等mRNA水平;应用ELISA法测定培养上清液中IFN-γ、IL-4以及TGF-β含量;运用蛋白质免疫印迹技术测定细胞β 连环蛋白表达量。结果： 与对照组相比,莫诺苷组中活化T细胞向Th1、Th2、Treg分化比例增加(P<0.05),CD25活化标志增强,T细胞增殖标志Ki67有所增强,但增殖和凋亡差异均无统计学意义;IL-4和Treg细胞相关的TGF-β因子水平增加(P<0.05),但Th1细胞分泌的IFN-γ差异无统计学意义;Tbx21、Gata3、LEF1等mRNA水平均增加(P<0.05);蛋白质印迹显示β 连环蛋白表达明显上调(P<0.01)。结论： 山茱萸提取物莫诺苷可促进小鼠T细胞分化,其机制可能与Wnt信号通路有关。     

不同浓度淫羊藿苷对大鼠脂肪干细胞成骨分化相关因子的体外研究

目的 探究淫羊藿苷对大鼠脂肪干细胞成骨分化的影响。方法 分离、培养SPF级SD雌性大鼠脂肪干细胞后,流式细胞术进行表面标志物检测,然后通过茜素红、油红O染色观察脂肪干细胞的成骨分化及成脂分化。将第3代脂肪干细胞分为空白组、白藜芦醇组(100μmol/L)、淫羊藿苷Ⅰ～Ⅳ组(1、10、50、100μmol/L),培养21 d后对脂肪干细胞LIM结构域蛋白Ajuba(Ajuba)、Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)进行荧光定量RT-PCR、Western-blotting检测。结果 培养至第3代的脂肪干细胞表面标志物表现为CD90(95%)、CD34(9.26%)。成骨诱导21 d时茜素红染色可见橘红色钙化结节,成脂诱导21 d时油红O染色可见红色脂滴。白藜芦醇与100μmol/L淫羊藿苷均能促进脂肪干细胞Runx2、ALP基因及蛋白表达,且与白藜芦醇比较,同浓度的淫羊藿苷呈现出显著的促进效应(P<0.01,P<0.05)。白藜芦醇及各浓度淫羊藿苷均可抑制Ajuba基因及蛋白表达,且与100μmol/L白藜芦醇比较,50、100μmol/L淫羊藿苷抑制A...     

去亚甲基小檗碱抑制破骨分化减轻钛颗粒诱导的骨溶解

目的 探讨去亚甲基小檗碱(demethyleneberberine, DMB)对破骨细胞和骨溶解的抑制作用。方法 将20只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、钛(Ti)颗粒组、低剂量组(1mg/kg DMB)和高剂量组(10mg/kg DMB),2周后收集标本行显微计算机断层扫描和组织学分析;CCK-8法检测不同浓度DMB对小鼠骨髓巨噬细胞的毒性;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色检测成熟破骨细胞形成;实时荧光定量聚合酶法检测各组破骨细胞分化基因的表达情况。结果动物实验表明,与钛颗粒组比较,DMB能够明显抑制钛颗粒诱导的骨溶解,减轻骨破坏;细胞实验表明DMB在无明显细胞毒性的浓度下能抑制破骨细胞的形成和破骨细胞分化相关基因的表达。结论 去亚甲基小檗碱可以通过浓度依赖的方式抑制破骨细胞的分化与成熟,有望成为治疗磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解的潜在药物。