人退变髓核细胞中内质网应激水平的观察研究

目的 观察探讨退变与正常髓核组织中内质网应激水平的差异.方法 获取正常和退变髓核组织共9例(均为海军总医院骨科2016年1月至2017年6月期间住院手术患者),取组织及分离培养髓核细胞,通过透射电镜观察内质网形态、免疫组化法对髓核组织中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达分布进行定性分析,RT-PCR及Western blot对髓核细胞中GRP78、CHOP进行mRNA和蛋白质水平的分析.结果 透射电镜结果显示退变髓核细胞的内质网扩张、肿胀,正常片状折叠结构消失;免疫组化染色及Western blot检测结果均可见退变髓核组织GRP78、CHOP的表达升高;RT-PCR提示较之于正常组,退变组GRP78[(1.076 ±0.13)vs(2.471 ±0.53)]、CHOP[(1.09 ±0.21)vs(6.873±1.4)]明显升高(P＜0.05).结论 退变髓核细胞中内质网应激水平较正常髓核细胞升高,提示内质网应激可能在髓核细胞退变过程中发挥作用.     

移植同种异体髓核细胞对兔椎间盘退变早期干预的实验研究

目的 在诱导椎间盘退变的早期移植同种异体兔髓核细胞（ NPC）,观察NPC对退变椎间盘的修复效果。方法 体外分离、培养NPC,并通过组织化学染色、免疫组织化学和免疫荧光染色对其进行鉴定。采用穿刺抽吸法建立兔椎间盘退行性变模型,造模同期进行细胞移植治疗。将27只5月龄日本大耳白兔随机分为3组：正常对照组（n=9）、NPC移植组（NPC组,n=9）及DMEM培养基组（DMEM组,n=9）。每只实验动物的L3-4、L4-5和L5-6作为实验干预椎间盘。术后4、8、12周分别利用标准化T2加权像信号强度（%ST2WI）、病理组织学、退变分数、免疫组化染色、免疫荧光染色以及二型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（aggrecan）mRNA表达水平评价修复效果。结果 术后12周,DMEM组的%ST2WI值、CollagenⅡ和aggrecan 的mRNA表达量均明显低于其它两组（P＜0.05）,正常对照组和NPC组无明显差异（P＞0.05）;正常对照组和NPC组退变分数明显低于DMEM组（P＜0.05）,正常对照组和NPC组无明显差异（P＞0.05）;正常对照组、NPC组的Collagen Ⅱ免疫组化和aggrecan免疫荧光染色均显示强阳性,而DMEM组随着时间的推移阳性逐渐减弱。 结论 在退变早期移植同种异体的兔NPC能有效修复椎间盘组织的髓核退变。     

种子细胞移植修复髓核治疗椎间盘退行性变研究进展

椎间盘退行性变(intervertebral disc degeneration,IDD)是引起下腰痛的主要原因,它可引起一系列疾病,如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症和节段性腰椎不稳等。细胞移植治疗是目前实验研究的治疗方法之一。近年将这些种子细胞移植入发生退行性变的椎间盘,可有效增加髓核细胞外基质的形成,干预椎间盘退变的进程,对椎间盘退行性变疾病具有潜在的治疗效果。本文就髓核细胞、软骨细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和胚胎干细胞等研究进展和干细胞体外诱导方法的研究进展作如下综述。     

髓核细胞表型对干细胞治疗椎间盘退变的意义

椎间盘退变导致的下腰痛是社会的主要负担之一,而卧床休息、理疗、抗炎药物治疗及手术治疗等传统治疗方法仅能在短期或一定程度上缓解椎间盘退变给患者带来的痛苦,并不能使患者的生活质量得到显著改善。目前,细胞移植对于椎间盘退行性疾病的治疗有较好的前景,且能更好地衡量功能恢复的效果。其中,了解移植细胞能否产生健康髓核组织至关重要。髓核细胞的表型是独特的,它由一组能反映其生理功能的特征性标志物的表达构成。未来,髓核细胞及其祖细胞的独特生理功能的表型标记将对干细胞治疗椎间盘退变具有重要意义。     

椎间盘组织工程学髓核种子细胞的研究新进展

椎间盘退行性变是临床的常见病,其病因尚不明确,可引起的一系列疾病如腰椎间盘突出症、颈椎病、椎间盘源性疼痛、椎管狭窄症以及脊柱节段不稳等,是导致腰腿痛和影响患者生活质量的常见原因之一。目前临床上的各种治疗办法或多或少存在着许多难以克服的问题,随着椎间盘髓核细胞组织工程学研究的不断深入,为椎间盘退行性变的治疗带来了新的希望,但其种子细胞的来源和鉴定等方面仍有许多问题亟待解决。     

大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型的建立

【摘要】 目的 建立大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型。方法 为了充分模拟退变椎间盘内营养缺乏的微环境,本实验分别采用含1%,3%,5%,8%,10%胎牛血清的DMEM培养基培养椎间盘髓核细胞,筛选最佳促凋亡浓度,分别检测髓核细胞凋亡率、凋亡相关蛋白Bax、bcl-2、caspase-3酶的表达、细胞增殖曲线及免疫荧光分析。 结果 流式细胞仪测得髓核细胞凋亡率随着FBS浓度降低而升高,3% FBS为最有效诱导凋亡浓度;Western blot 示Bax、caspase-3酶表达在3% FBS组明显高于10% FBS组,同时bcl-2表达下降;CCK-8检测结果显示含3% FBS的培养基内,随着凋亡率的增长,髓核细胞增殖的速率越来越慢;免疫荧光分析3% FBS组FAS表达量明显比10% FBS组增高。结论 3% FBS能诱导髓核细胞发生凋亡,最终会导致细胞功能丧失,caspase家族参与并执行了这一过程。     

退变颈椎间盘组织中细胞凋亡及TRAIL表达的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrotic factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)在颈椎间盘退变中的作用.方法 采用原位DNA片段末端标记(TUNEL)法和免疫组织化学方法,对比观察30例颈椎病退变颈椎间盘组织细胞及30例创伤对照颈椎间盘组织细胞凋亡状态及TRAIL的表达.结果 TUNEL染色观察示颈椎病组的髓核内的平均凋亡细胞率为(10.93±1.87)%,高于对照组的(6.43±1.56)%(P＜0.01).SP免疫组织化学染色示颈椎病组髓核内TRAIL染色阳性细胞率为(49.13±15.66)%,高于对照组的(20.26±2.81)%,差异有统计学意义(P＜0.01).将对照组和颈椎病组全部60例颈椎间盘标本合并后进行Pearson相关分析,颈椎间盘髓核内TRAIL染色阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关,相关系数r=0.921(P＜0.01).结论 颈椎病椎间盘组织细胞凋亡数与TRAIL阳性细胞数均明显高于创伤对照组,且凋亡与TRAIL的表达呈正相关.     

溶髓方对颈椎间盘退变大鼠软骨终板细胞凋亡的影响

[目的]观察溶髓方对大鼠颈椎间盘退变中椎间盘组织形态软骨终板细胞凋亡的影响。[方法]选取健康wistar大鼠36只,随机分为空白组、对照组和实验组各12只。实验组和对照组建立wistar大鼠动静力失衡性颈椎间盘退变模型;空白组做假手术,仅切开皮肤后即缝合。术后1周开始灌胃,实验组给予溶髓方汤剂,对照组和空白组分别给予生理盐水,每日1次,持续喂药1个月,分别于术后9周、18周、36周处死两组动物,取下包含上下椎体的椎间盘。颈椎间盘按Thompson椎间盘退变病理分级标准进行分级评定。分离软骨终板和椎间盘,做椎间盘HE染色和软骨终板TUNEL染色,观察病理切片,并通过TUENL检测法计算椎间盘软骨终板细胞凋亡率。[结果]术后18、36周时,对照组和实验组软骨终板凋亡细胞较术后9周明显增加(P0.05),其中对照组较实验组凋亡细胞数量显著增多,两组细胞凋亡率比较有显著性差异(P0.05);HE染色和TUNEL染色结果显示:随着实验时间的延长,实验组和对照组中均出现椎间盘及软骨终板细胞数量减少、细胞形态变化的退变情况,但对照组的退变情况更明显。[结论]终板细胞凋亡是椎间盘发生退变的重要原因。溶髓方可以抑制软骨终板凋亡细胞的增加,减慢软骨终板细胞的凋亡速度,延缓椎间盘退变过程。     

退变颈椎间盘组织中细胞凋亡及死亡受体DR5表达的研究

目的 探讨死亡受体5(death receptor 5,DR5)在颈椎间盘退变中的作用.方法 采用原位DNA片段末端标记(TUNEL)法和免疫组织化学方法,对比观察30例颈椎病患者(实验组)及30例创伤患者(对照组)颈椎间盘组织细胞凋亡状态及死亡受体DR5的表达.结果 TUNEL染色显示实验组的髓核内平均凋亡细胞率为(10.93±1.87)%,高于对照组的(6.43±1.56)%(P<0.01).免疫组织化学染色显示实验组的髓核内DR5阳性细胞率为(50.73±15.92)%,高于对照组的(41.23±16.35)%(P<0.05).Pearson相关分析表明颈椎间盘髓核内DR5阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关(r=0.755,P<0.01).结论 高水平的DR5表达参与了退变颈椎间盘髓核细胞的凋亡,由DR5/TRAIL诱导的凋亡途径可能在颈椎病颈椎间盘退行性变发生和发展中发挥作用.     

活血止痛汤对椎间盘退变大鼠髓核细胞IRE1α/JNK通路的影响

目的:探讨活血止痛汤对椎间盘退变大鼠IRE1α/JNK信号通路及髓核细胞凋亡的影响.方法:构建椎间盘退变大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、活血止痛汤低、中、高(1.75 g生药/kg、2.50 g生药/kg、 5.00 g生药/kg)剂量组和阳性对照组(尼美舒利分散片,0.18 mg/kg)每组10只,另取10...     

脂联素通过AMPK/mTOR通路抑制H2O2诱导的大鼠髓核细胞凋亡及细胞外基质退变

目的：探讨脂联素（adiponectin,APN）对氧化应激下大鼠髓核细胞凋亡和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）退变的保护作用及相关机制。方法：原代培养SD大鼠髓核细胞,CCK?8法检测细胞活力,以确定APN的最适保护浓度。将细胞分为对照组、H2O2组、APN+H2O2组及Compound C+APN+H2O2组,流式细胞术检测凋亡率,Western blot检测Bcl?2、Bax、Cleaved Caspase?3、基质金属蛋白酶?13（matrix metalloproteinase?13,MMP?13）及带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶?5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs?5,ADAMTS?5）等蛋白的表达,RT?PCR检测Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ alpha 1 chain,COL2A1）、蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）的mRNA水平,Western blot评估5′?单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5′?monophosphate?activated protein kinase,AMPK）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）的磷酸化水平。结果：1 μg/mL APN对200 μmol/L H2O2所致的细胞毒性起最佳拮抗作用。APN预处理显著抑制H2O2诱导的髓核细胞凋亡。相应地,Bax/Bcl?2比值及Cleaved Caspase?3 表达的增加也被APN抑制。尽管对ADAMTS?5无明显抑制作用,APN降低了H2O2诱导的MMP?13的表达。此外,H2O2对COL2A1及ACAN转录的抑制作用也被APN显著缓解。APN还促进AMPK磷酸化并抑制mTOR磷酸化,而AMPK抑制剂Compound C显著减轻了APN对mTOR磷酸化的抑制作用。APN对凋亡、分解代谢的抑制作用及其对合成代谢的促进作用也均被Compound C逆转。结论：APN通过AMPK/mTOR通路抑制H2O2诱导的大鼠髓核细胞凋亡及ECM退变。     

白血病抑制因子对退变髓核细胞胞外基质的影响

目的：探讨退变椎间盘髓核组织白血病抑制因子（leukemia inhibit factor,LIF）表达及其对胞外基质表达的影响。方法：40只新西兰兔随机分5组（1组为对照组,4组为实验组）,每组8只。针刺法建立L4/5、L5/6椎间盘退变模型,术后0、2、4、8周对椎间盘进行MRI扫描及HE染色评价退变程度,免疫组化检测髓核组织LIF的表达。体外原代培养兔髓核细胞,不同浓度重组LIF蛋白刺激髓核细胞24、48、72 h,Western blot检测聚蛋白多糖（Aggrecan）、Ⅱ型胶原（COLLA2α1）的表达,免疫荧光检测最大浓度组和对照组Aggrecan的表达并行Western blot检测金属蛋白酶组织抑制物-1（tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP-1）和基质金属蛋白酶-3（matrixmetalloproteinase-3,MMP-3）的表达。结果：影像学和组织学评分显示椎间盘退变随造模时间延长而加重,各组间差异有统计学意义（1.000±0.000,2.000±0.535,2.750±0.463,3.875±0.354,P=0.000;4.000±0.000,7.375±0.518,9.375±1.302,11.750±0.463,P=0.000）。免疫组化显示2周组LIF表达最高,随着椎间盘退变加重,其表达降低,但各组均高于0周组,差异有统计学意义（559.608±68.689,16 135.613±577.329,8 149.739±457.189,2 018.254±211.870,P=0.000）。细胞学实验显示,加入不同浓度LIF刺激后,Aggrecan、COLLA2α1的蛋白表达与LIF刺激浓度呈正相关,各处理组与对照组差异有统计学意义（0.191±0.020,0.212±0.020,0.321±0.041,0.511±0.032,0.561±0.042,P=0.000）,Aggrecan免疫荧光结果与之相符。处理组TIMP-1表达明显高于对照组（0.454±0.022,0.211±0.012,P=0.000）,MMP-3明显低于对照组（0.243±0.013,0.362±0.021,P=0.000）。结论：LIF在退变髓核组织中表达上升,且具有促进胞外基质合成作用,其潜在机制与LIF能够上调TIMP-1并下调MMP-3作用相关。分为A组（AMD3100+NS动员组）,B组（AMD3100+G-CSF动员组）,C组（G-CSF+AMD3100动员组）和D组（NS空白对照组）;80只db/+小鼠为相应对照组,分组对应为A’组,B’组,C’组和D’组。每组在动员后第3 、7、10、14 天4个时间点于心脏部位取外周血,流式细胞仪检测CD34+/CD133+/Flk-1+细胞的比例。结果取平均值用均值±标准差（单位%）表示,统计学方法处理后进行比较和分析。结果：①D组和D’组在动员后第3、7、10、14 天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例无差异（P >0.05）,但D’组中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例高于D组（P=0.003）。②A组、B组和C组db/db小鼠在动员后第3、7、10、14 天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例逐渐上升,A组至第7 天达到峰值,随后逐渐下降;B组和C组至第10 天达到峰值,随后逐渐下降,且在达到峰值时CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例与其余3个时间点相比差异有意义（P=0.000）。在第10 天,B组和C组db/db小鼠外周血中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例较A组和D组高（P=0.000）,但B组和C组db/db小鼠外周血中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例之间的差异无统计学意义（P >0.05）。③A’组、B’组和C’组db/+小鼠在动员后第3、7、10、14天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例逐渐上升,至第7 天达到高峰,随后逐渐下降,且在第7天CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例与其余3个时间点相比差异有意义（P=0.000）。在达到峰值的第7天,C’组CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例较A’组、B’组和D’组高（P=0.000）。结论：AMD3100联合G-CSF动员骨髓EPCs的效果优于单一使用AMD3100的动员效果,在非糖尿病状态下,先使用G-CSF再联合AMD3100的动员作用更优,但在糖尿病状态下先使用AMD3100再联合G-CSF的动员作用更优。     

内质网应激与细胞凋亡

内质网(ER)是细胞内重要的细胞器,参与多种细胞进程,这些进程对于维持细胞存活和发挥细胞的正常生理功能具有重要的作用。然而在多种生理病理条件下,内质网稳态会发生变化而失衡,从而诱发内质网应激(ERS),此时机体通过激活未折叠蛋白反应(UPR)来恢复内质网的正常功能。当持续的ERS状态无法恢复时,ERS就会触发细胞凋亡程序,通过不同的凋亡途径引起细胞凋亡。     

髓核研究的现状难以诠释椎间盘退变之道

最近,《关节炎和风湿病》（Anhrilis Rheum）杂志上刊载的1篇题为“人退变椎间盘髓核细胞中,整合素传导通路的变化”的研究文章引起了我们的关注。我们对该文进行仔细研读后,结合我们在人髓核细胞和椎间盘退变领域的研究,就人髓核细胞的培养,椎间盘退变的分级以及正常椎间盘的界定等方面提出了我们的见解,并就相关问题进行了对比和总结。我们撰写的Letter发表在《Anhrilis Rheum》杂志上。     

杆状病毒介导的GFP转染与退变的兔椎间盘髓核细胞

目的:检测杆状病毒转染正常与退变的椎间盘髓核细胞的效率以及杆状病毒介导的GFP基因(Ac/CMV/GFP)在正常与退变细胞中的表达水平。方法:取新西兰大白兔的髓核细胞进行离体培养,第1组:健康幼兔;第2组:椎间盘退变模型兔;第3组:椎间盘发生自然退变的成年兔。以200MOI杆状病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)转染离体培养的细胞,于第48h采用流式细胞仪检测转染效率,同时采用HPIAS2000图像分析软件半定量分析外源性GFP基因的表达水平。结果:3组细胞被转染的百分率分别为84.4±3.4,82.9±5.7,81.8±5.5(P>0.05)。外源性基因表达荧光蛋白的光密度值分别为0.0054±0.0029,0.0052±0.0032,0.0056±0.0031(P>0.05)。结论:杆状病毒转染椎间盘髓核细胞的效率与椎间盘退变程度无关,杆状病毒介导的外源性基因能在正常与退变的髓核细胞中高水平的表达。     

大鼠增龄及颈椎间盘退变过程中髓核形态转化的研究

随着年龄的增加，椎间盘的髓核组织由脊索性髓核逐渐转变为纤维软骨性髓核，但这种转化的规律及其与椎间盘退变的关系仍不清楚。本研究采用成组设计，通过破坏大鼠颈椎后方静力稳定结构制备颈椎间盘退变动物模型，动态观察髓核形态的变化规律及其与椎间盘退变的关系，旨在为制定防治椎间盘退变的策略提供依据。     

细胞凋亡与椎间盘退变

1972年，Kerr等提出了细胞凋亡的概念，随后的研究证实，细胞凋亡在机体发育和许多生理、病理过程中均起着重要作用。退行性疾病是多种因素作用下机体某些器官的功能过早减退，组织学上表现为特定器官内功能细胞的数量减少。有研究表明，细胞凋亡参与了骨性关节炎等退行性疾病的发生与发展。颈椎病和腰椎间盘突出症均可严重影响人们的健康，目前公认，其发生、发展的根本原因是椎间盘退变。本文对细胞凋亡与椎间盘退变的关系综述如下。