小RNA干扰技术在治疗肝细胞肝癌中的应用

目的 探讨利用小RNA干扰技术作用缺氧诱导因子1α2α稳定转染肝癌细胞后VEGFR蛋白表达情况.方法 构建HIF1α、HIF2α基因的真核表达载体HIF1α、HIF2α-pcDNA3.1,检测48h(Western Blots);同时用Western Blots方法检测VEGFR蛋白表达.结果 缺氧诱导因子1α2α小RNA干扰稳定转染肝癌细胞.与未转染组和转染空载体组相比,伴随HIF-1α、HIF-2α基因沉默同时VEGF的蛋白表达也下降.结论 缺氧诱导因子1α2α小RNA干扰转染肝癌细胞有效抑制HIF-1α与HIF-2α的表达.为肝癌治疗的新策略奠定了基础.     

人低氧诱导因子1-α转染人骨髓内皮祖细胞的体外实验

目的：将人低氧诱导因子1-α（HIF1-α）转染人骨髓内皮祖细胞(EPCs),为探讨转染HIF1-α基因的EPCs对梗塞心肌血管修复及血管再生能力提供依据。方法：密度梯度法分离人骨髓中单个核细胞,以1×10⁶•mL^-1细胞浓度接种于用纤维连接蛋白包被的培养皿中,培养14 d后采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性成分ecNOS、flk- 1的表达;采用acLDL-Dil和FITC-UEA-1对细胞染色;采用Lipofectamine^TM 2000介导PCDNA3.0-HIF1-α质粒转染EPCs, RT-PCR检测HIF1-α的转录; ELISA检测细胞上清中VEGF表达;免疫印迹法检测HIF1-α蛋白表达。结果：培养第5天起,部分圆形单核细胞转化为梭形贴壁EPCs,7 d左右出现由数十个细胞形成的细胞集落, 10 d后形成明显克隆。RT-PCR检测ecNOS在548 bp处出现条带,flk-1在819 bp处出现条带;acLDL-Dil和FITC-UEA-1双染色阳性;RT-PCR在383 bp处出现特异性条带;ELISA转染HIF1-α的EPCs上清中VEGF含量为（20.53±2.33） μg•L^-1,未转染HIF1-α的EPCs上清中VEGF含量为（3.96±1.67） μg•L^-1,两组比较差异有显著性（P<0.05）。免疫印迹法(Western blotting)检测在相对分子质量120 000处出现条带。结论：PCDNA3.0-HIF1-α质粒成功转染EPCs。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α治疗骨肉瘤的实验研究

为观察靶向缺氧诱导因子(HIF)1α的短发夹状小干扰RNA基因转染对骨肉瘤生长的影响,特针对HIF1α构建短发夹状siRNA真核表达载体pSilencer HIF并转染骨肉瘤细胞系(SaOS)2。将骨肉瘤细胞置于缺氧诱导培养基中培养,采用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)和免疫印迹沉淀观察HIF1α的基因沉默效果。以四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析检测细胞体外增殖活力,透射电镜、原位末端标记TUNEL法、AnnexinV/PI双标记法检测细胞的凋亡。同时,通过裸鼠移植瘤模型观察HIF1α基因沉默后对骨肉瘤体内治疗效果。测序证实成功构建了HIF1α的短发夹状si…     

YY1基因在肾癌组织中的表达及对肾癌细胞功能的影响

目的探讨YY1基因在肾癌组织中表达及小干扰RNA(siRNA)对人肾癌786-O细胞增殖和侵袭的影响。方法以Real-Time PCR检测转录因子YY1在20对肾癌及癌旁组织中的表达;采用脂质体转染法将siRNA转染入人肾癌786-O细胞中,Real-Time PCR和Western印迹法检测YY1转染效率;MTT和平板克隆形成实验检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期;Transwell及Matrigel检测细胞侵袭能力,Real-Time PCR检测基质金属蛋白酶MMP9及钙黏附蛋白E-cadherin mRNA表达水平。结果与癌旁组织相比,20对癌组织中YY1 mRNA表达量显著增高(P<0.01)。转染人肾癌786-O后,siRNA-YY1组细胞YY1mRNA的表达抑制率达66%(P<0.01),蛋白表达水平也明显低于siRNA-NC组。与NC组相比,siRNA-YY1组细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞生长被阻滞在G0/G1期,细胞侵袭能力明显减弱(P<0.01)。此外,与NC组相比,MMP9及E-cadherin mRNA水平有显著差异(P<0.01)。结论 YY1在肾癌组织中高表达,靶向沉默YY1可以在体外显著抑制肿瘤细胞的生长和侵袭能力。YY1特异性siRNA作为一种治疗肿瘤的新途径值得进一步研究。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α治疗骨肉瘤的实验研究

目的　观察靶向缺氧诱导因子 (HIF)- 1α的短发夹状小干扰RNA基因转染对骨肉瘤生长的影响。方法　针对HIF- 1α构建短发夹状siRNA真核表达载体 (pSilencer) HIF并转染骨肉瘤细胞系(SaOS) 2。骨肉瘤细胞置于缺氧诱导培养基中培养。逆转录 聚合酶链反应 (RT -PCR)和免疫印迹沉淀观察HIF -1α的基因沉默效果。四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色分析检测细胞体外增殖活力,透射电镜,原位末端标记TUNEL法,AnnexinV/PI双标记法检测细胞的凋亡。同时,通过裸鼠移植瘤模型观察HIF- 1α基因沉默后对骨肉瘤体内治疗效果。结果　测序证实成功构建HIF- 1α的短发夹状siRNA真核表达载体pSilencer HIF,转染骨肉瘤细胞后,HIF -1α基因表达显著抑制 ( 90% )。与对照组比较,pSilencer HIF转染组骨肉瘤细胞缺氧状态下的增殖活性显著降低。缺氧培养 72h后,透射电镜、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征,AnnexinV/PI双标检测转染组细胞凋亡率为 18. 71% ±0. 98%,明显高于pSilencer neo空载体转染组和未转染组 (P< 0 .01 )。裸鼠移植瘤实验显示pSilencer HIF转染组肿瘤生长减慢,成瘤率下降,肿瘤组织中可见大量坏死组织。结论　靶向HIF- 1α基因的短发夹状siRNA可以有效阻断骨肉瘤缺氧耐受转导通路,抑制骨肉瘤细胞的生长。     

胃腺癌组织中缺氧诱导因子-1α的表达及其与细胞增殖和血管形成的关系

目的:探讨缺氧诱导因子1α(HIF1α)在胃腺癌组织中的表达及其与细胞增殖、血管形成的关系。方法:应用免疫组织化学SP法检测64例胃腺癌组织及20例癌旁正常组织中HIF1α、细胞核增殖抗原(Ki67)表达及微血管密度(MVD),并分析HIF1α表达与Ki67、MVD的相关性。结果:HIF1α蛋白在正常胃组织中不表达,在胃腺癌中的阳性表达率为70.3%(45/64),其阳性表达与胃腺癌淋巴结转移、临床病理分期有关,其阳性表达率淋巴结转移组88.6%(31/35)显著高于无淋巴结转移组48.3%(14/29)(P<0.01),临床Ⅲ+Ⅳ期阳性表达率94.1%(32/34)显著高于临床Ⅰ+Ⅱ期43.3%(13/30)(P<0.01)。HIF1α表达与Ki67、MVD呈正相关(r=0.439,P<0.01和r=0.582,P<0.05)。结论:HIF1α在胃腺癌组织中表达明显升高,并与肿瘤细胞增殖和血管形成密切相关,提示它可能在胃癌的发生发展及恶性演进过程中起重要作用。     

低氧微环境与宫颈癌耐药的关系

目的：通过检测低氧诱导因子－1α（ HIF－1α）、多耐药基因1（ MDR1）在人宫颈癌组织、HeLa细胞中的表达及两者间的关系,探讨低氧微环境与宫颈癌耐药的关系。方法应用免疫组化法检测78例中、晚期宫颈癌组织微阵列芯片组织标本中HIF－1α、MDR1的表达;以二氯化钴（ CoCl2）处理HeLa细胞模拟细胞低氧微环境,设置低氧组、常氧组。细胞免疫荧光法检测HIF－1α、MDR1蛋白在HeLa细胞中表达。结果 HIF －1α、MDR1在宫颈癌组织中的阳性表达率分别为69.2％、85.6％,且表达呈正相关（r＝0.348,P＜0.05）。低氧组HeLa细胞HIF－1α、MDR1表达分别为34.76±7.09、57.61±57.61,显著高于常氧组的19.46±3.57、29.57±12.85（P＜0.05）,低氧组HIF－1α与MDR1表达呈正相关（r＝0.315,P＜0.05）。结论低氧微环境与宫颈癌耐药发生有关,可能的机制是HIF－1α促进MDR1的表达从而导致耐药的发生。     

HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究

目的 利用噬菌体肽库技术,构建HIF1 α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响.方法 提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RT-PCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库.以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行淘选.SDS-PAGE电泳检测scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK-8检测scFv联合X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放疗存活曲线.结果 成功制备HIF1α人源喉癌单链抗体scFv,SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为34×103,Western blot表明其能下调HIF1α蛋白的表达.ELISA检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率高达79％,细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合.CCK-8检测结果显示scFv联合X线照射后,较单纯X线照射组明显降低了HEP2细胞的存活率(P＜0.05),克隆形成实验结果显示scFv对放射的增敏比为1.89.结论 成功构建了HIF1α人源喉癌单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放疗的敏感性.     

缺血性急性肾损伤大鼠miR-214介导的HIF1α、KIM1信号通路作用机制

目的:探讨缺血性急性肾损伤(IAKI)大鼠miR-214介导的缺氧诱导因子l(HIFlα)、肾损伤分子1(KIMl)信号通路作用机制。方法:将48只大鼠分为假手术组、IAKI组和miR-214组,建立IAKI组和miR-214组IAKI大鼠模型,48 h后抽取3组大鼠眼眶静脉血并收集尿液,检测生化指标及KIM1表达,采用Masson’s Trichrome、TUNEL、免疫印迹及PCR检测肾组织病理、肾小管细胞凋亡及肾组织中HIF1α、KIM1蛋白及mRNA表达。结果:IAKI组大鼠血清中血清肌酸酐(Scr)、血尿素氮(BUN)和尿24 h三磷酸尿苷(UTP)表达高于假手术组(P<0.05),miR-214组大鼠血清中Scr、BUN、24 h UTP含量高于IAKI组(P<0.05);假手术组肾脏组织结构完整,肾小管和肾小球形态良好;IAKI组肾小球间质增多,肾间质增宽,炎症浸润严重,肾小管严重萎缩;miR-214组与IAKI组相比,肾小球硬度增加,肾小管周围组织炎症浸润更加严重。IAKI组大鼠肾小管细胞凋亡最为严重,凋亡程度明显高于假手术组;miR-214组与IAKI组相比肾小管细胞凋亡程度增加;IAKI组大鼠肾组织中HIF1α、KIM1蛋白以及mRNA表达高于假手术组(P<0.05),miR-214组与IAKI组相比肾组织HIF1α、KIM1蛋白及mRNA表达升高(P<0.05)。结论:miR-214升高会加快肾小管细胞凋亡,加重肾组织损伤,增加HIF1α、KIM1表达,进一步加重IAKI大鼠病情。     

利用组织芯片技术研究PTEN和HIF-1α在肺癌中的表达及意义

目的:研究PTEN和缺氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactor1α,HIF1α)在肺癌中的表达及临床意义。方法:利用组织芯片(tissuemicroarray,TMA)技术和免疫组织化学SP法检测PTEN、HIF1α在76例肺癌和30例正常肺组织中的表达。结果:肺癌组织中PTEN蛋白阳性表达率为47.4%(36/76),显著低于正常肺组织的表达96.7%(29/30)(P<0.01),HIF1α蛋白阳性表达率为52.6%(40/76),显著高于正常肺组织的表达(0/30)(P<0.01);PTEN、HIF1α的表达与组织分化程度、淋巴结转移和临床病理分期有关,而与性别、年龄、肿瘤大小和组织分型无关;两者表达之间呈显著负相关(P<0.01)。结论:PTEN低表达、HIF1α高表达与肺癌临床病理特征和生物学行为有密切关系。联合检测PTEN和HIF1α对肺癌的恶性程度及预后判断具有重要的临床意义。应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的,具有快速、准确、方便经济的特点。     

缺氧诱导因子-1α在食管鳞癌组织中的表达及其临床病理学意义

[目的]探讨缺氧诱导因子-1α(HIF1α)在食管鳞癌组织中的表达及其临床病理学意义.[方法]采用免疫组织化学方法检测HIF1α在128例食管鳞癌组织中的表达,分析其与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、T分期、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、CD68表达、化学治疗、放射线治疗情况及生存率的关系.[结果]HIF1α在食管鳞癌的癌细胞及间质中均高表达.HIF1α在进展期(T分期和临床分期)食管鳞癌的癌细胞及间质组织中的表达率均明显高于早期癌组织(P<0.05);有淋巴结转移的食管鳞癌组织中HIF1α阳性表达率明显高于无淋巴结转移者(P<0.05);CD68表达呈阳性的组织中HIF1α表达率明显高于阴性组织(P<0.05).在食管鳞癌癌细胞中HIF1α呈阳性表达时患者的总生存率(OS)及无病生存率均明显低于阴性者(P<0.01,P<0.05).在食管鳞癌间质细胞中HIF1α呈阳性表达时患者的OS明显低于阴性者(P<0.01).HIF1α在食管鳞癌组织中的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、远处转移、化学治疗及放射线治疗情况均无明显相关性.[结论]HIF1α在食管鳞癌中的表达对评价肿瘤进展情况及判定预后具有一定的参考价值.     

RNA干扰技术特异性抑制肾癌survivin表达的实验研究

目的:体外转录合成survlvin siRNA(Small interference RNA,siRNA),观察其在肾癌786-O细胞株中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成3组survivin序列特异性双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA),转染786-O细胞株中,用RT-PCR和Western blot检测转染后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞活性.结果:有2组转染特异性siRNA的786-O细胞表达survivin mRNA及蛋白均下调.活性受到抑制,另一组效果不明显.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制肾癌786-O细胞中survivin的表达,抑制细胞的活性,RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术可能为肾癌的基因治疗提供一种新策略.     

NF－κB 对卵巢癌细胞中 HIF－1α与 GST－π的调节作用

目的：探讨卵巢癌细胞中,HIF－1α与GST－π表达的相关性及NF－κB的调节作用,为卵巢癌耐药的基因治疗提供重要靶点。方法卵巢癌SKOV3细胞转染HIF－1αsiRNA,检测其转染效率;采用RT－PCR和Western blot法检测HIF－1α基因沉默后卵巢癌细胞中GST－π以及NF－κB基因和蛋白表达的变化;给予不同浓度NF－κB抑制剂PDTC后,检测GST－π和NF－κB的表达变化。结果 HIF－1α的siR－NA载体成功转染卵巢癌SKOV3细胞后,HIF－1αmRNA表达显著下降,GST－π的mRNA 和蛋白表达抑制,NF－κB表达增加。给予NF－κB抑制剂PDTC后,随着抑制剂浓度增加,GST－π表达增加。结论靶向沉默HIF－1α降低卵巢癌耐药因子GST－π的表达,增加卵巢癌细胞对化疗的敏感性。 NF－κB可能参与HIF－1α沉默后引起GST－π表达下降的调节途径。     

β-连环蛋白信号通路介导缺氧诱导因子1α诱导人前列腺癌细胞的上皮细胞间质转化

目的 明确β-连环蛋白(catenin)信号通路是否参与缺氧诱导因子(HIF)-1α诱导人前列腺癌细胞发生上皮细胞间质转化态(EMT)转化过程.方法 应用Western印迹法检测HIF-1α、Glut-1和VEGF蛋白表达,确认2种新构建前列腺癌细胞株(LNCaP/HIF1α和PC-3/HIF1α)的稳定性;然后应用Western印迹法检测EMT指标蛋白(E-cadherin、CK18、Vimentin、N-cadherin及Fibronetin)的表达,对5种人前列腺癌细胞株(LNCaP、LNCaP/HIF1α、PC-3、PC-3/HIF1α和IA8)的EMT特性进行鉴定;进一步应用Transwell和MTT技术检测5种细胞株的体外侵袭和增殖潜能;最后,用RT-PCR和Western印迹法检测5种EMT特性不同的细胞株中β-catenin、tGSK-3β和pGSK-3β的表达,总结分析该信号通路活性与细胞EMT特性的关联.结果 (1)LNCaP/HIF1α和PC-3/HIF1α中出现明显的HIF-1α蛋白条带,同时Glut-1和VIEGF表达呈强阳性;(2)Pc-3、LNCaP和Pc-3/HIF1α是EMT阴性细胞,而LNCaP/HIF1α和IA8是EMT阳性细胞;(3)PC-3/HIF1α和LNCaP/HIF1α、IA8体现出了较PC-3和LNCaP更为强大的体外侵袭和增殖潜能;(4)与LNCaP和PC-3相比,PC-3/HIF1α和LNCaP/HIF1α、IA8中tGSK-3β和pGSK-3β的蛋白表达相对减少,但p-GSK3β/t-GSK3β比值相应较高,β-catenin蛋白表达在LNCaP/HIF1α和IA8中相对较高,PC-3/HIF1α却表达较低;基因检测结果与前述蛋白表达规律基本一致,但是与β-catenin蛋自在PC-3/HIF1α中低表达不吻合的是,PC-3/HIF1α中β-catenin mBNA水平与其在LNCaP/HIF1α和IA8中一样呈现出强表达特点.结论 β-catenin信号通路的活性状态与细胞EMT特性及其体外侵袭和增殖潜能有密切关系,该信号通路可能是介导HIF-1α诱导人前列腺癌细胞EMT过程的重要"桥梁".     

Glut1、HIF1α在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达及临床意义

目的:检测葡萄糖转运蛋白1(Glut 1)和缺氧诱导因子1α(HIF 1α)在宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈浸润癌组织中的表达情况,并探讨其临床病理意义。方法:采用免疫组化SP法检测Glut 1、HIF 1α在72例宫颈上皮内瘤变及58例宫颈癌及30例癌旁正常宫颈鳞状上皮组织中的表达情况。结果:Glut 1和HIF 1α蛋白在宫颈癌、CIN和正常癌旁组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05),且随着病变的进展,Glut1和HIF1α表达率均升高。但此两种蛋白在宫颈癌和CIN组织中的表达并没有呈现从子宫颈正常组织、上皮内瘤变、宫颈癌发展过程中逐渐上升的趋势。结论:Glut 1和HIF 1α蛋白可能参与宫颈癌的发生发展,有望成为宫颈癌诊断和判断预后的分子标志物。     

miR-411靶向调节HIF-1α对脊柱脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响

目的：探究微小RNA 411(miR-411)靶向调节低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对脊柱脊髓损伤（SCI）大鼠神经细胞凋亡的影响。方法：将44只大鼠随机分为假手术组、SCI组（模型组）、agomir-NC组、miR-411 agomir组;Allen′s法构建SCI模型;qRT-PCR检测脊髓组织中miR-411及HIF-1α表达。结果：相较于假手术组,SCI组脊髓组织中miR-411表达、Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分降低,HIF-1α mRNA及蛋白表达、脊髓组织病理学程度、白细胞介素1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、细胞凋亡指数、凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、凋亡诱导因子（AIF）表达增加（P<0.05）;相较于SCI组和agomir-NC组,miR-411 agomir组miR-411表达、BBB评分增加,HIF-1α mRNA及蛋白表达、脊髓组织病理学程度、IL-1β及TNF-α水平、细胞凋亡指数、Caspase-3、AIF表达降低（P<0.05）。结论：miR-41...     

肝癌组织中乙肝病毒x蛋白与缺氧诱导因子-1α的表达及关系

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白(Hepatititis B virus X protein,HBx)和缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor,HIF1α)在肝癌组织中的表达及关系.方法采用免疫组织化学染色方法检测78例经福马林固定、石蜡包埋的原发性肝癌组织标本中HBx和HIF-1α的表达;免疫荧光检测HepG2及稳定转染HBx基因的HepG2(HBx-transfected HepG2)细胞中HIF-1α的表达.结果78例肝癌组织标本中,HBx和HIF-1α免疫组织化学染色阳性率分别为74.23%(58/78)和69.23%(54/78);免疫荧光检测表明:正常氧状态下,HeptG2中HIF-1α的表达阴性而HBx-transfected HepG2中表达阳性,主要位于细胞浆,部分位于细胞核.在缺氧状态下,HeptG2和HBx-transfected HepG2的细胞质和细胞核均有表达.结论HBx及HIF-1α在人肝细胞肝癌组织中广泛表达,二者存在明显相关(P＜0.01),在正常氧状态下,HBx可诱导HIF-α在HepG2细胞中表达.提示:共同表达可能对原发性肝癌细胞的形成有重要作用.     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

HIF1α、PTEN与VEGF在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF1α)、第10染色体磷酸酶基因(PTEN)与血管内皮生长因子(VEGF)在乳腺癌组织中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学染色SP法检测44例乳腺癌组织及10例乳腺良性病组织中HIF1α、PTEN和VEGF蛋白的表达情况.结果 HIF1α与VEGF在乳腺癌组织高表达,与对照组比较差异有显著性(P<0.01),PTEN在乳腺癌组织的表达低于对照组(P＜0.01),HIF1α与VEGF的高表达与乳腺癌组织学分级、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05);PTEN表达在腋淋巴结是否转移及ER状况之间比较差异均有显著性(P<0.05);HIF1α表达与VEGF表达呈显著正相关(r_s=0.344,P=0.022),与PTEN表达显著负相关(r_s=0.374,P=0.012).结论 在乳腺癌中HIF1α、VEGF与PTEN蛋白表达水平有相关性,三者在乳腺癌发生、发展和转移中有重要意义,对临床判断乳腺癌预后也有一定价值.     

RNAi沉默survivin和HIF-1α基因对胃癌BGC-823细胞体外增殖和凋亡的影响

目的：应用RNA干扰（RNAi）技术抑制胃癌BGC-823细胞中survivin和HIF-1α基因的表达,探讨其对胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响。方法：分别设计并合成经过化学修饰的靶向survivin和HIF1α mRNA的小干扰RNA （siRNAs）,同时合成错义RNA （SCR）,采用HifectinⅡ真核体外转染胃癌BGC-823细胞,将转染siRNA-survivin、siRNA-HIF-1α和SCR的各组细胞分别命名为sis组、siH组和SCR组,同时设空白对照组（无血清培养基）,RT-PCR法检测各组细胞中survivin和HIF-1αmRNA表达水平。将胃癌BGC-823细胞分为单干扰组（survivin-siRNA,sis组）、联合干扰组（survivin-siRNA+HIF1α-siRNA,sis+siH组）、非靶向特异性组（SCR组）和空白对照组（无血清培养基）,MTT法检测各组细胞增殖活性,Western blotting法检测各组细胞中survivin和HIF-1α蛋白表达水平,流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果：与空白对照组比较,sis组细胞中survivin mRNA表达水平和siH组细胞中HIF-1αmRNA表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。与空白对照组比较,SCR组细胞增殖活性无明显变化（P>0.05）,sis组和sis+siH组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）;与sis组比较,sis+siH组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）。与空白对照组比较,sis+siH组细胞中surviving和HIF-1α蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）,细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。结论：联合靶向沉默survivin和HIF-1α基因可下调靶基因的表达,抑制胃癌BGC-823细胞增殖,促进细胞凋亡,RNAi基因沉默技术有望成为治疗胃癌的新方法。