HLX基因在AML中的表达及预后分析

目的 分析H2.0样同源盒基因（H2.0-like homeobox gene,HLX）在急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia,AML）患者中的临床表达情况,探究HLX基因与AML疾病预后的关系。方法 收集56例AML患者的骨髓单个核细胞,实时荧光定量PCR （quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测HLX的表达水平,并结合预后基因进行分析。结果 在临床初发的AML患者中,HLX的表达水平高于正常人（P<0.01）,HLX表达水平与白血病组患者年龄、骨髓原始细胞数显著相关（P<0.05）,HLX表达水平与染色体核型代表的预后分层无明显关联（P>0.05）。结论 HLX基因在AML患者中的表达水平是上调的,可能拥有独立的预后信息,是AML中潜在的干预靶点。     

HLX基因的表达与急性髓系白血病相关性

目的 研究HLX表达水平与AML的临床变量及AML不同危险度分层的相关性。方法 应用实时荧光定量PCR方法检测32例初治AML患者骨髓单个核细胞中HLX表达量,分析其与患者FAB分型、血象、骨髓原始细胞、分化程度及AML不同危险度分层关系。结果 初治AML患者HLX表达量在AML-M₃中明显降低（P<0.01）,AML-M₅中明显升高（P<0.05）;HLX表达水明与骨髓原始细胞数呈负相关（P<0.01）,与外周血血小板水平呈正相关（P<0.05）,且AML-M₃ HLX表达量与外周血白细胞水平呈正相关（P<0.05）,AML-M₅ HLX表达量与外周血白细胞水平呈负相关（P<0.05）;AML-M₅组中分化不良组HLX表达水平明显高于分化良好组,（P<0.05）,病例组及非M₃组初治AML患者中,低危组与中危组HLX表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论 HLX表达水平在部分亚型（如AML-M₅）中表达升高,且在不同的FAB分型中有差异。该基因与白血病细胞的增殖、分化和成熟相关。本研究暂无证据表明HLX在不同AML危险度分层中有差异,仍需进一步实验研究。     

miR-216a-5p靶向作用于PAK2对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的 探讨miR-216a-5p在多种膀胱癌细胞系中表达及调控p21活化蛋白激酶2（PAK2）基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-216a-5p在正常膀胱细胞系SV-HUC-1及膀胱癌细胞系5637、J82、T24和EJ中的表达,选取其中两种表达miR-216a-5p最少的5637和J82为对象,实验分两组：对照组（转染miR-NC）、实验组（转染miR-216a-5p）。利用qRT-PCR法检测PAK2 mRNA的表达。Western blot法检测PAK2、p-Akt和p-ERK蛋白的表达。Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验和克隆形成实验检测膀胱癌细胞活力和增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 miR-216a-5p在膀胱癌细胞系中的表达量均低。实验组PAK2基因mRNA及其蛋自的表达明显降低,PAK2 mRNA在5637细胞中对照组和实验组表达量分别为1.01±0.15和0.40±0.11（P<0.01）,在J82细胞中对照组和实验组表达量分别为1.00±0.09和0.56±0.14（P<0.01）。p-Akt和p-ERK蛋白表达显著降低。实验组细胞活力明显被抑制,增殖能力明显降低。实验组细胞凋亡显著增加（P<0.01）。结论 miR-216a-5p在多种膀胱癌细胞系中呈低表达,可在体外靶向抑制PAK2基因,抑制膀胱癌细胞系5637和J82的增殖能力,促进细胞凋亡,可能成为具有膀胱癌生物治疗意义的靶标分子。     

microRNA干扰抑制MTDH的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨microRNA干扰技术沉默异黏蛋白（MTDH,metadherin蛋白）基因表达及对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖、转移、侵袭能力的影响。方法 将人工合成的针对MTDH基因的miRNA片段瞬时转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot法、RT-PCR法检测MTDH蛋白表达和MTDHmRNA;应用MTT检测法、划痕实验、Transwell实验检测抑制MTDH基因后对乳腺癌细胞增殖、转移、侵袭能力的影响。结果 MTDHmiRNA能有效抑制MTDH蛋白和MTDHmRNA表达,最佳抑制率分别为79.41%、80.56%（P<0.05）;经miRNA干扰的细胞,生长速度明显受到抑制（P<0.05）,侵袭迁移能力显著下降（P<0.05）。结论 MTDH miRNA瞬时转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞可明显抑制癌细胞中MTDH表达,沉默MTDH基因表达后可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长增殖、侵袭迁移能力。     

微小RNA-382-5p靶向作用核因子蛋白90对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察微小RNA-382-5p （miR-382-5p）对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法 采用荧光实时定量聚合酶链反应（qPCR）的方法检测miR-382-5p在9例乳腺癌患者癌组织和乳腺癌细胞株中的表达,细胞计数试剂盒（CCK-8）法和平板克隆实验分别检测过表达miR-382-5p后乳腺癌细胞活力和增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。qPCR和Western blot法检测过表达miR-382-5p的乳腺癌细胞中核因子蛋白90（NF90）的表达。采用荧光素酶活性实验验证miR-382-5p对靶基因的靶向作用。结果 miR-382-5p在乳腺癌组织和细胞中低表达（P<0.05）,过表达miR-382-5p可抑制乳腺癌细胞的增殖能力,促进细胞的凋亡（P<0.01）。转染miR-382-5p模拟物组NF90基因的相对表达量较miR-NC组明显降低（P<0.01）。荧光素酶活性实验显示miR-382-5p与NF90基因3''非翻译区存在靶向关系（P<0.01）。结论 miR-382-5p对乳腺癌细胞的增殖具有抑制作用,对细胞的凋亡具有促进作用,其机制与靶向抑制NF90基因表达有关。     

RNA结合蛋白ABCF1在AML发生发展过程中的功能研究

目的：　研究RNA结合蛋白ABCF1在人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）发生发展过程中的功能。方法：　以临床初诊的AML患者为实验组,正常人为对照组,采用RT-qPCR检测ABCF1 mRNA在正常人外周血中单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）和AML患者骨髓有核细胞中的表达;用针对ABCF1的2个shRNA慢病毒颗粒感染人单核细胞白血病细胞株THP-1,用CCK-8法检测THP-1细胞的增殖,用PI、Annexin V染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。利用ss-m6A和ss-A探针进行RNA pull-down实验,分析ABCF1与m6A的结合能力。结果：　ABCF1在实验组AML患者中的表达明显高于对照组（P<0.01）,在THP-1细胞中抑制内源ABCF1的表达能够促进细胞凋亡（P<0.05）,抑制细胞增殖（P<0.0001）,同时明显减少细胞周期S期细胞的比例。与ss-A探针相比,ABCF1蛋白具有特异的m6A结合能力。结论：　ABCF1在AML细胞来源的THP-1细胞中发挥原癌基因作用,调控THP-1细胞的生理功能。     

尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响

目的： 研究尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因转染对人肺腺癌细胞系H1299(p53基因缺失)的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法： UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,采用荧光显微术、RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞内绿色荧光蛋白(GFP)、wt-p53 mRNA和蛋白的表达,并通过MTT法分析基因转染对细胞的生长抑制作用,DAPI染色法和琼脂糖凝胶电泳法评价其对细胞的诱导凋亡作用。结果： UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,大量细胞表达GFP,细胞内wt-p53 mRNA和蛋白表达水平明显上调,细胞生长受到显著地抑制,凋亡细胞数量明显增加,并有清晰的DNA梯状条带出现。结论： UAC介导wt-p53基因转染能够显著地抑制人肺腺癌细胞系H1299的增殖,并诱导其凋亡。     

Kruppel样因子6对肝癌HepG2细胞的作用及其缺失对斑马鱼肝脏发育的影响

目的 探讨Kruppel样因子6（KLF6）低表达对肝癌细胞凋亡及迁移能力的影响,并以斑马鱼作为动物模型,研究klf6基因沉默对肝脏发育的作用。方法 构建敲除KLF6基因质粒,转染肝癌细胞（HepG2）及正常人肝细胞（L-02）,通过免疫印迹（WB）、凋亡及细胞周期测定、划痕实验检测KLF6基因敲除后对HepG2细胞的影响;设计合成沉默KLF6基因的吗啉代寡核苷酸（Morpholino）,显微注射入转基因斑马鱼Tg（lfabp：eGFP）胚胎中,通过免疫荧光法观察KLF6蛋白表达的变化以及对转基因斑马鱼胚胎肝脏发育表型的影响。结果 体外实验表明,L-02细胞中的KLF6蛋白的表达量明显高于HepG2细胞;敲除KLF6基因后,HepG2细胞KLF6蛋白表达明显减少、凋亡减弱、细胞周期主要集中于S期、迁移能力增强;体内实验表明,klf6基因沉默后,斑马鱼胚胎肝脏中的KLF6蛋白表达量减少,肝脏发育明显迟缓。结论 KLF6基因低表达促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,减少凋亡;且影响斑马鱼肝脏的正常发育。探讨KLF6基因低表达及其功能,可为以后斑马鱼肝癌模型建立及药物筛选提供理论基础。     

小檗碱通过Notch途径抑制人T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨小檗碱对人T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞体外增殖抑制、凋亡诱导及相关机制。方法 CCK-8法检测不同浓度的小檗碱对Molt-4细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测Molt-4细胞Notch1、Bcl-xl、Deltex1基因表达情况。结果 小檗碱诱导Molt-4细胞毒性及凋亡作用,呈剂量依赖性（P<0.05）;RT-PCR显示Molt-4细胞株有Notch1 mRNA的表达,且随着小檗碱剂量的增加,Notch1、Bcl-xl、Deltex1 mRNA的表达逐渐下降。结论 小檗碱可能通过Notch信号途径抑制Molt-4细胞增殖并诱导凋亡。     

DHX9调控白血病细胞增殖及凋亡的作用机制研究

目的 研究DHX9在白血病患者中的表达水平,以及对白血病细胞增殖及凋亡的影响和作用机制。方法 分析GEO数据库中白血病及对照样本DHX9基因表达情况,探索其表达差异。通过慢病毒感染人白血病细胞系K562,构建DHX9敲低细胞系。采用CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V-PI法检测细胞凋亡,基因表达谱筛查DHX9潜在靶向通路,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot法验证DHX9调控的机制。结果分析GEO数据库中的MILE研究(GSE13159),该研究纳入AML、MDS、CML及正常对照的基因表达谱分析,结果显示,AML组DHX9基因表达水平较对照组明显增高(P=0.007),较MDS组及CML组也明显增高(P均<0.001);而CML组DHX9表达明显低于AML组、MDS组及对照组(P均<0.001)。本研究构建了DHX9敲低的白血病细胞株K562(DHX9相对表达量为0.48±0.06,P<0.01)。与对照组比较,DHX9敲低的K562细胞呈现明显增高的自身凋亡率(P<0.001),对抗肿瘤药物阿扎胞苷(5-azacitidine,AZA)的凋亡敏感度也明显增加(P<0.05)。CCK-8增殖实验显示,DHX9敲低细胞增殖能力减弱(P<0.001)。通过基因表达谱分析获得了2264个差异基因,生物信息学分析显示,差异表达基因主要富集在癌症通路、凋亡和p53通路(P均<0.001)。Western blot法检测结果显示,DHX9敲低增加凋亡相关蛋白caspase-9的表达,降低Bcl-2表达。结论 从正常对照到MDS再到AML,DHX9表达逐步增加预示较高的肿瘤增殖度和白血病转化风险,DHX9可能通过抑制p53介导的细胞凋亡促进白血病细胞增殖。     

siRNA沉默MACC1基因表达对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨siRNA沉默结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达对Hela宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法通过脂质体将siRNA MACC1及siRNA NC转入Hela细胞中,RT-PCR及western blot检测转染效果,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力,western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E,基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9蛋白表达及细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。结果与siRNA NC组比较,siRNA MACC1组中MACC1蛋白及mRNA表达量降低(P0.01),细胞活力及侵袭能力下降(P0.01),细胞周期阻滞在G1期,cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK表达量下调(P0.01)。结论siRNA MACC1能显著的抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭,可能与下调ERK磷酸化水平有关。     

膜联蛋白A7与IGFBP2结合抑制肝癌细胞增殖

目的 分析膜联蛋白A7(ANXA7)与肝癌发生的相关性及筛选、鉴定ANXA7的相互作用分子,探讨ANXA7在肝癌发生中的机制.方法 通过实时定量PCR法检测48对肝癌与癌旁组织以及多种肝和肝癌细胞株中ANXA7表达量的差异,并通过肝癌细胞ANXA7过表达及特异性干扰抑制分析其对肝癌细胞增殖的影响.采用免疫共沉淀法筛选与ANXA7发生结合的蛋白,并以点突变法分析蛋白质相互作用的关键位点;用蛋白免疫印迹法分析了ANXA7对肝癌相关的重要信号通路中ERK1/2磷酸化水平的影响.结果 ANXA7在肝癌组织与肝癌细胞中均呈下调表达.胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-like growth factor binding protein 2,IGFBP2)能与ANXA7蛋白发生特异性结合,且IGFBP2上的RGD序列是两者结合的关键位点.肝癌细胞中ANXA7表达上调能抑制肿瘤细胞增殖(P＜0.05),并能使IGFBP2介导的ERK1/2的磷酸化水平降低.下调ANXA7的表达可促进肝癌细胞增殖(P＜0.01),磷酸化ERK1/2的水平升高.结论 ANXA7可能作为一种抑癌基因,通过介导IGFBP2对ERK1/2磷酸化水平的影响参与对肝癌增殖的调控.     

miR-370-5p对前列腺癌细胞周期及增殖的影响

目的 研究miR-370-5p导入对前列腺癌细胞株DU-145和LNCaP细胞周期和增殖的影响。方法 合成miR-370-5p（实验组）和dsControl（阴性对照组）,分别转染至两个细胞株。利用Real-time PCR和Western blot法分别检测细胞转染后p21、CDK4、Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达变化。流式细胞术分析细胞周期变化,利用MTT法和集落形成实验分析细胞活力和增殖能力。结果 Real-time PCR结果提示,转染miR-370-5p后DU-145和LNCaP细胞中p21 mRNA水平分别上调3.43倍（P<0.01）和3.06倍（P<0.01）,CDK4 mRNA水平分别下调0.51倍（P<0.01）和0.43倍（P<0.01）,Cyclin D1 mRNA水平分别下调0.31倍（P<0.01）和0.35倍（P<0.01）。Western blot法检测结果符合这一趋势。流式细胞术检测结果显示,转染miR-370-5p后,位于S期和G₂/M期的细胞比例下降,位于G₀/G₁期的细胞比例则上升,说明细胞周期被阻滞在G₀/G₁期。MTT分析结果显示,与dsControl组相比,转染miR-370-5p后,DU-145和LNCaP细胞活力明显降低。集落形成实验显示,miR-370-5p组的集落数数量明显较少,细胞增殖能力降低。结论 miR-370-5p能显著激活前列腺癌细胞中p21蛋白的表达,抑制前列腺癌细胞周期的进展和增殖。     

程序性死亡配体1在索拉非尼耐药肝癌细胞中的表达和功能

目的 探究PD-L1在索拉非尼耐药肝癌细胞中表达及对其功能的影响。方法 采用浓度递增法构建索拉非尼耐药细胞Hep3B-SR和HepG2-SR,CCK-8法检测IC50并计算耐药系数,Western blot 和qPCR检测耐药基因（P-gp和MRP1）和PD-L1的表达变化。转染siRNA沉默耐药细胞PD-L1的表达并检测沉默效率。沉默PD-L1后,CCK-8法检测IC50并计算耐药系数,检测耐药基因的表达变化,细胞增殖实验检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成,流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Hep3B-SR和HepG2-SR的耐药指数分别为5.4和5.2。耐药细胞中P-gp、MRP1和PD-L1表达较亲本细胞明显上调（P均﹤0.01）。抑制PD-L1表达后,Hep3B-SR和HepG2-SR的耐药指数分别下降为1.8和1.5,P-gp和MRP1的表达明显下调（P均﹤0.01）,显著抑制耐药细胞的增殖、迁移、克隆形成和促进其凋亡（P均﹤0.01）。结论 PD-L1在索拉非尼耐药肝癌细胞中高表达。抑制PD-L1表达可部分逆转索拉非尼耐药肝癌细胞的耐药性使得索拉非尼的抗癌效果明显提高。抑制PD-L1表达后可有效抑制索拉非尼耐药肝癌细胞生长,合用索拉非尼其抗癌效果更强。     

沉默Yes相关蛋白1对人非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 研究Yes相关蛋白1(YAP1)在非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭中的作用.方法 通过慢病毒介导的小干扰RNA靶向抑制人非小细胞肺癌细胞株A549中YAP1基因的表达,采用CCK-8法、流式细胞术分别检测沉默YAP1对A549细胞增殖及凋亡周期的影响,Transwell实验观察沉默YAP1对A549细胞迁移、侵袭能力的影响.结果 沉默YAP1后,A549细胞YAP1 mRNA和蛋白表达均下调(P＜0.01),CCK-8实验结果显示沉默YAP1抑制A549的增殖、增加G0/G期的细胞比例(P＜0.01),Transwell实验结果示沉默YAP1抑制A549细胞的迁移、侵袭(P＜0.01).结论 沉默YAP1基因对非小细胞肺癌细胞的恶性生物学特征具有抑制作用,YAP1可能成为肺癌治疗的潜在靶标.     

MicroRNA-30e-5p通过下调泛素特异性蛋白酶22抑制非小细胞肺癌的发生和发展

目的 探讨microRNA-30e-5p(miR-30e-5p)是否可通过下调泛素特异性蛋白酶22(USP22)抑制非小细胞肺癌(NSCLC)的发生和发展.方法 采用qPCR、蛋白质印迹法和免疫组织化学染色法检测miR-30e-5p、USP22在NSCLC组织和癌旁组织中的表达.NSCLC细胞株H460转染miR-30e-5p模拟物或miR-30e-5p抑制物后,利用qPCR和蛋白质印迹法检测细胞中miR-30e-5p、USP22的表达.构建USP22突变载体,采用荧光素酶报告基因检测miR-30e-5p在USP22基因中的结合位点.采用MTT法检测转染后H460细胞的增殖情况,并采用异种移植法检测裸鼠体内肿瘤生长情况.流式细胞术检测转染后H460细胞的周期阻滞和凋亡情况.结果 MiR-30e-5p、USP22在肿瘤组织中的表达均高于癌旁组织(P均＜0.01).在H460细胞中过表达miR-30e-5p后USP22 mRNA和蛋白的表达均下调(P均＜0.01),而抑制miR-30e-5p表达后USP22 mRNA和蛋白的表达均上调(P均＜0.01).NSCLC组织中miR-30e-5p与USP22的表达呈负相关(P＜0.01).miR-30e-5p可通过结合在3'UTR的特异序列负调控USP22的表达.过表达miR-30e-5p可抑制H460细胞的增殖、诱导细胞周期阻滞和凋亡,并抑制裸鼠体内肿瘤的生长(P＜0.05,P＜0.01);而抑制miR-30e-5p的表达可促进H460细胞的增殖、抑制细胞周期阻滞和凋亡(P＜0.05,P＜0.01).结论 MiR-30e-5p可以下调USP22的表达,从而抑制NSCLC的发生和发展,提示其可作为NSCLC患者的潜在治疗靶点.     

MicroRNA-544在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 明确微RNA-544(microRNA-544,miR-544)在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡、克隆形成及成球能力的影响,探讨其在肝癌发生、发展中的作用.方法 利用qPCR法检测二乙基亚硝胺(DEN)造模的大鼠肝组织和人肝癌组织与癌旁组织以及成球培养后肝癌干细胞球中miR-544的表达;肝癌细胞株Hep3B转染miR-544mimic或miR-544 inhibitor后,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成能力,碘化丙啶(PI)染色后流式细胞仪检测细胞凋亡情况.肝癌细胞转染miR-544mimic后成球培养观察细胞形成肿瘤干细胞球能力的变化.结果 MiR544在DEN造模大鼠肝组织及人肝癌组织中的表达分别较未造模大鼠肝组织(P＜0.05)和癌旁组织(P＜0.01)下调.过表达miR-544可抑制肝癌细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01)和平板克隆形成能力(P＜0.05),并促进细胞凋亡(48 h和72 h,P＜0.01);而在肝癌细胞中抑制miR-544的作用可促进肝癌细胞的增殖(P＜0.01)和克隆形成能力(P＜0.05).在富集肝癌干细胞的成球培养中,miR-544的表达下调(P＜0.05);而过表达miR-544可抑制肝癌细胞形成干细胞球(P＜0.05).结论 MiR-544在肝癌组织中表达下调,且可抑制肝癌细胞的多种恶性生物学行为,提示其可能在肝癌的发生、发展中发挥着抑癌作用.