人γ-干扰素基因修饰的结肠癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用

目的研究人γ-干扰素(human interferon-γ,huIFN-γ)基因修饰的结肠癌细胞瘤苗的成瘤性及抗肿瘤作用。方法用逆转录病毒质粒pL(IFN-γ)SN将人IFN-γ基因转导入鼠结肠癌细胞株CT26中,用G418进行筛选,得到抗性克隆CT26／IFN-γ,比较CT26／IFN-γ与野生型CT26的成瘤性,评价CT26／IFN-γ对野生型CT26细胞肝转移模型的治疗作用。结果CT26／IFN-γ能在含0．6 g·L-1 G418的培养液中稳定生长;RT-PCR证实IFN-γ基因在CT26／IFN-γ中表达;CT26／IFN-γ细胞能分泌人IFN-γ,体外培养体系中产量为3．5 fg·cell-1·d-1;CT26／IFN-γ的成瘤性比野生型CT26差[Balb／c小鼠肿瘤体积分别为(480±138)mm3与(991±176)mm3,F=31．29,P=0．000]; CT26／IFN-γ对野生型CT26的肝转移亦有明显抑制作用,荷瘤小鼠存活期明显延长(P=0．000)。结论人IFN-γ基因修饰的结肠癌细胞瘤苗有一定的抗肿瘤作用,值得进行深入研究。     

温热疗法增强前药氟胞嘧啶对转基因结肠癌细胞株的杀伤作用

目的 探讨温热疗法能否增强前药5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）对转染组织特异性胞嘧啶脱氨基酶（cytosine deaminase，CD）基因的结肠癌细胞SW480的靶向性杀伤作用及其机制。方法 将转染G1CEACDNa之结肠癌SW480细胞接种到96孔细胞培养板中，同时加入含各种浓度梯度的前药5-FC。实验组以水浴加温法在43℃下热处理30min，对照组不加热。第8d去除培养液，以MTT法测定活细胞比率，分析前药5-FC联合温热疗法对转CD基因结肠癌SW480细胞的杀伤作用，并以流式细胞仪分析热化疗对肿瘤细胞周期的影响，透射电镜观察热化疗前后肿瘤细胞形态学改变。结果 实验组细胞的杀伤率明显高于对照组（P〈0．05，t=2．403，n=9）；流式细胞仪检测显示实验组S期细胞比例明显增高（P〈0．001，t=7．158，n=6）；透射电镜观察下显示实验组细胞膜微绒毛消失，边缘变平直，细胞核皱缩，染色质聚集在核模下。结论 温热疗法能明显提高转CD基因结肠癌SW480细胞对前药5-FC的敏感性；两者联用能使转CD基因结肠癌SW480细胞产生S期阻滞，从而促进细胞凋亡。     

WTp53基因联合TK/GCV、CD/5-FC系统抑制结肠癌肝转移的实验研究

目的研究WTp53基因联合TK／GCV、CD／5-FC系统对结肠癌肝转移的抑制作用。方法32只裸鼠随机分为4组，每组8只。脾内注射法建立结肠癌肝转移动物模型。第1组：脾内注射SW480细胞（对照组）；第2组：脾内注射SW480／p53细胞；第3组：脾内注射SW480／TK-CD细胞，腹腔注射GCV、5-FC；第4组：脾内注射SW480／p53与SW480／TK-CD等比例混合细胞，腹腔注射GCV、5-FC。观察各组裸小鼠的肝转移率、肝转移瘤数目、肿瘤细胞凋亡指数（AI）、生存期等指标。结果各治疗组裸鼠肝转移的发生率下降，平均肝转移瘤数减少，其动物的生存期延长，肝转移瘤内的癌细胞凋亡率增高。联合基因治疗组效果最好，且WTp53与TK／GCV、CD／5-FC有交互协同作用。结论WTp53基因与TK／GCV、CD／5-FC系统联合应用具有协同效应，可有效地抑制结肠癌肝转移的形成。     

自杀基因联合化疗药物治疗结肠癌的体外研究

目的 研究胞嘧啶脱氨酶基因（CD）联合化疗药物对结肠癌的治疗作用。方法 以重组腺病毒AdCMVCD为载体转移CD基因，在体外研究病毒感染对顺铂（CDDP）、丝裂霉素（MMC）敏感性的影响，化疗药物对AdCMVCD/５-FC直接杀伤作用及“旁观者效应”的影响。结果 病毒感染并不影响Lovo细胞对CDDP、MMC的敏感性；低剂量CDDP、MMC即可明显增强AdDMVCD/5-FC系统的直接杀瘤作用，５-FC的IC50明显降低（P＜0．05），并且增强AdCMVCD/5-FC系统的“旁观者效应”。结论 化疗药物可以增强自杀基因系统对结肠癌的治疗作用，自杀基因和化疗药物有望联合应用于结肠癌的治疗。     

前药热化疗对裸鼠结肠癌肝转移的作用

目的 观察胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统热化疗对裸鼠结肠癌肝转移的作用.方法 45只裸鼠随机分为3组,分别给予不同的治疗方法,观察各组肝转移率、肝转移瘤数目、病理学变化、肿瘤细胞凋亡指数,检测肿瘤组织中CD基因的表达情况.结果 对照组、5-FC治疗组、5-FC热疗组平均肝脏转移瘤数和肝脏转移率分别为4.6000±1.2649、2.2000±0.9189、0.5000±0.8498;100%、40%、20%;肿瘤细胞凋亡指数平均为4.59%、9.87%和17.40%,5-FC热疗组可见较多的凋亡小体形成.结论 CD/5-FC系统热化疗对裸鼠转CD基因LoVo细胞结肠癌肝转移有明显的抑制作用.     

双自杀基因重组腺病毒对肺癌细胞的杀伤作用

目的构建含CD／UPRT双自杀基因的重组腺病毒Ad—CD／UPRT，观察其对人肺腺癌细胞的杀伤作用。方法用0～100感染复数的重组腺病毒转染肺腺癌A549细胞后加入（0～1000）mg／L的5-氟胞嘧啶（5-FC），MTT法检测杀伤效率；将转基因细胞与未转基因细胞按不同比例混合，观察旁观者效应。结果Ad-CD／UPRT转染A549后对细胞生长有显著的抑制作用，细胞杀伤效率随腺病毒滴度及5-FC浓度的增加而增强；转基因细胞占混合细胞10％以上，即可观察到明显的旁观者效应。结论Ad—CD／UPRT联合5-FC对肺腺癌A549细胞有显著杀伤作用。     

实验性结肠癌癌胚抗原特异性药物前体基因治疗的改进

结肠癌肝转移依然是转移性疾病最普遍的形式。尽管局部化疗、放疗和免疫治疗可以使肿瘤暂时缓解，进展期结直肠癌病人的预后并没有改善。因此，结肠癌肝转移的处理迫切需要新的治疗方法，基因治疗即是候选者之一。在不同的肿瘤基因治疗策略中，埃希氏大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)／5-氟胞嘧啶(5-FC)系     

双功能融合基因/5-氟胞嘧啶系统对胰腺癌细胞的杀伤作用

目的观察双功能融合基因／5-氟胞嘧啶（FCU1／5-FC）系统对胰腺癌BxPC3细胞系的杀伤作用。方法在脂质体的介导下将含有FCU1自杀基因的真核表达载体pcDNA3．1／FCU1导入BxPc3细胞系，经G418筛选后获得稳定表达FCU1基因的BxPC-3／FCU1细胞株。用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测FCU1基因的表达。给予前体药物51氟胞嘧啶（5-Fc）后，用噻唑蓝比色法（MTT）法测定转染前后BxPC-3细胞的存活率；流式细胞仪分析转染前后细胞周期及凋亡改变；将BxPC3／FCU1与未转染基因的BxPC-3细胞按不同的比例混合，观测5-Fc对BxPC3细胞的旁观者效应。结果 FCU1基因在BxPC-3细胞中可稳定表达；5-FC按10、30、50、70、110、130me／L处理BxPC3／FCU1细胞后，细胞存活率依次为（97．30±0．17）％、（82．50±0．21）％、（71．20±0．35）％、（59．30±0．25）％、（35．40±0．19）％、（19．90±0．32）％、（19．20±0．17）％，与未转染组比较有统计学意义（P〈0．01）。在混和细胞中，当BxPC-3／FCU1细胞所占比例分别为0、10％、20％、50％、70％、100％时，5-FC对混合细胞的杀伤率依次为0、18．9％、47．2％、76．9％、87．6％、94．3％。结论 FCU1／5-FC自杀基因系统对胰腺癌细胞具有明显的杀伤作用，其旁观者效应明显。     

TK/GCV、CD/5-Fc系统对结肠癌肝转移抑制作用的实验研究

目的：研究胸苷激酶／丙氧鸟苷（TK／GCV）系统和胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-Fc）系统对结肠癌肝转移的抑制作用。方法：将40只裸鼠随机分为四组：对照组、TK组、CD组、TK-CD组，每组10只。脾内注射法建立结肠癌肝转移动物模型。对照组：脾内注射SW480细胞，腹腔注射生理盐水；TK组：脾内注射SW480／TK-CD细胞，腹腔注射GCV；CD组：脾内注射SW480／TK-CD细胞，腹腔注射5-Fc；TK-CD组：脾内注射SW480／TK-CD细胞，腹腔注射GCV、5-Fc。观察各组裸小鼠的肝转移率、肝转移瘤数目、电镜下肿瘤组织病理学变化、肿瘤细胞凋亡指数（AD、生存期等指标。结果：各治疗组裸鼠肝转移白9发生率下降，平均肝转移瘤数减少，其动物的生存期延长，肝转移瘤内的癌细胞凋亡率增高。联合基因治疗组效果更好，且TK／GCV与CD／5-Fc有交互协同作用。结论：TK/GCV、CD／5-Fc系统联合应用具有协同效应，可有效地抑制结肠癌肝转移的形成。     

热化疗对结肠癌LOVO细胞胞嘧啶脱氨酶基因表达的影响

目的 探讨温热疗法对转染胞嘧啶脱氨酶基因的基因表达的影响.方法 脂质体法将质粒G1CEACDNa转染结肠癌LOVO细胞,G418筛选抗体克隆并扩增,给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC)进行热化疗;以β-actin为内参照用实时荧光定量PCR检测热化疗前后CD基因表达量的变化.结果 实时荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR)检测得到热化疗前CD基因表达的CT值29.5300±1.1974,B.actinct值20.8200±2.7385;热化疗后CD基因表达的CT值30.285±1.201,β-actinet值21.225±2.237;行ΔΔCt法进行相对定量比较差异无统计学意义(P＞0.05,t=1.4521,v=38).结论 温热疗法对转染G1CEACDNa的LOVO细胞CD基因的表达无明显影响.     

前药热化疗对裸鼠转基因结肠癌肝转移的靶向作用

目的 探讨组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统热化疗对裸鼠结肠癌肝转移的靶向治疗效果.方法 脂质体法转CD基因至人结肠癌LoVo细胞株.45只BALB/c裸鼠采用经门静脉注射转CD基因LoVo细胞(LoVo-CEACD,0.2 mL,107/L)至裸鼠体内建立模型后,随机分为3组,每组15只,即对照组、前药治疗组及前药热疗组.3组分别经腹腔注射42℃生理盐水和38℃5-FC及42℃5-FC.5-FC剂量为500 mE/(kg·d),连续21 d后,待动物自然死亡,观察自然生存期、肝脏转移率、肝脏转移结节数;切取肝脏转移瘤组织,正常肝组织及胃、肺、胰腺、小肠、大肠组织,行RT-PCR检测各组织CD基因表达,观察各组织病理学变化、肿瘤细胞凋亡指数.结果 目的基因在肝脏转移瘤组织中能有效表达,在正常肝组织及胃、肺、胰腺、小肠、大肠组织中无表达.3组的自然生存期分别为(25.80±3.65),(34.27±4.08).(41.87±3.91)d;肝脏转移率分别为100.0%(15/15).40.0%(6/15),13.3%(2/15);平均肝脏转移结节数分别为(2.93±1.16),(0.80±1.01).(0.20±0.56)个.前药治疗组和前药热疗组的自然生存率明显长于对照组(P<0.05);3组间的肝脏转移率两两比较,差异均有统计学意义(均P<0.05).肿瘤细胞凋亡指数(AI)分别为4.59%,9.87%,17.4%,各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 组织特异性CD/5-FC系统热化疗对裸鼠结肠癌肝转移有明显的靶向抑制作用.     

Vaccination by suicide gene therapy against a model of hepatic metastasis from colon cancer in the rat

Suicide gene therapy consists of transferring into tumor cells a viral or bacterial gene encoding for an enzyme which converts a non-toxic product into a lethal drug. STUDY AIM: To analyze the therapeutic potential of vaccination with tumor cells expressing the bacterial cytosine deaminase (CD) gene and 5-fluorocytosine (5-FC) treatment in a rat liver metastasis model. MATERIAL AND METHOD: We used a rat colon carcinoma cell line which, after subcapsular or intraportal injection in syngenic animals, generates single or multiple experimental liver metastases, respectively. We have shown that introduction of a vector expressing the CD gene in this colon carcinoma cell line results in 5-FC sensitivity (PRObCD). RESULTS: Intrahepatic subcapsular injection of PRObCD tumor cells, followed by 5-FC treatment, induces total regression of a wild-type tumor pre-established in the contralateral liver lobe in 45% of animals with a 96% decrease in mean volume (p < 0.0001), demonstrating the existence of a distant bystander effect. This vaccination significantly increased the survival of rats with single (log-rank p < 0.0001) or multiple (log-rank p = 0.01) liver metastasis CONCLUSIONS: These results suggest that suicide gene-modified tumor cells can act as potent therapeutic vaccines against liver metastasis from colon carcinoma.     

Improvement of carcinoembryonic antigen-specific prodrug gene therapy for experimental colon cancer

BACKGROUND: Improvement of tumor-specific gene expression is very important for achieving successful effects in prodrug gene therapy for advanced cancer with metastatic lesions. We used the Cre/loxP system for enhancing carcinoembryonic antigen (CEA)-specific prodrug gene therapy of cytosine (CD)/5-fluorocytosine (5-FC) for the treatment of a colon cancer model accompanied with liver metastases. METHODS: Orthotopic colon cancer models were developed. Seven days later, adenovirus vector (3 x 10(9) pfu)was injected into the abdominal cavity, and 5-FC was administered for the next 10 days. RESULTS: In these models, the double administration of AxCEANCre expressing Cre recombinase under the control of the CEA promoter, and AxCALNLCD expressing the CD gene under the control of the CAG promoter by the Cre-mediated switching system, completely inhibited liver metastases, and significantly reduced primary tumor volume compared to the administration of Mock or AxCEACD (P <.001). The survival periods of the mice treated with AxCEANCre and AxCALNLCD were longer than mice treated with Mock or AxCEACD, and longer than the mice treated with AxCACD (P <.05). CONCLUSIONS: The enhanced CEA-specific prodrug gene therapy using the Cre/loxP system was useful for the treatment of advanced colon cancer with liver metastases, implicating clinical application.     

原位基因治疗联合前药热化疗治疗结肠癌肝转移的实验研究

目的:探讨胞嘧啶睨氨酶(CD)基因联合5-氟胞嘧啶(5-FC)热化疗对裸鼠结肠癌肝转移的治疗效果.方法:30只BALB/c裸鼠经门静脉注射人结肠癌Lovo细胞建立结肠癌肝转移模型,随机分为转基因组和非转基因组,每组15只.转基因组:经腹腔注射病毒上清(0.2 mL/d,共5d)进行原位基因转染;非转基因组经蝮腔注射生理盐水(0.2 mL/d,共5d),2组同时腹腔注射42℃500 mg·kg-1·d-1)5-FC.治疗21 d后将动物处死,观察肝脏转移率和转移结节数,PCR法检测目的基因在肿瘤组织的整合,RT-PCR法检测目的基因在肿瘤组织的表达,观察肿瘤病理学变化.结果:目的基因成功转染并在肿瘤组织中有效表达.转基因组与非转移基因组肝脏转移率分别为26.7%(4/15)、100.O%(15/15),2组比较差异有统计学意义(P<0.05),肝脏转移结节数分别为0.60±0.83、2.40±0.99(P<0.001).镜下转基因组肝内转移癌细胞变性,染色体消失,可见凋亡小体,而非转基因组未见明显变化.结论:原位基因治疗联合前药热化疗对裸鼠结肠癌肝转移有明显抑制作用.     

腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合基因体外抑瘤效果的观察

目的：构建重组腺病毒载体，观察自杀基因对不同大肠癌细胞系的细胞毒作用。方法：利用重组腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk)融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、HCT－8和直肠腺癌细胞系HR－8348，通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法），检测和分析HSV－tk／丙氧鸟苷（GCV）、CD／5－氟胞嘧啶（5－FC）双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应的大小。结果：Western Blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自然基因可以在3种肿瘤细胞中表达。不加5－FC和GCV时，各转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：94、93、95；96、94，比较差异无显著性（P＞0．05）。在5－FC（80．0mg/L）和GCV（0．8mg/L)浓度下3种肿瘤细胞存活率降至2．1％、4．3％和3．2％，与不同前药相比差异有显著性（P＜0．01）。感染细胞在混合细胞中比例仅仅占5％时，就能获得明显的旁观者效应，细胞杀伤率分别升至22．2％、34．8％和40．4％。结论：CD、TK融合基因联合联合双前药治疗能取得显著的抗肿瘤作用。     

白细胞介素10和转化生长因子β1与小鼠结肠癌肝转移的关系

目的了解小鼠脾脏接种结肠癌细胞发生肝转移所需肿瘤细胞数的临界值,探讨白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β1（TGF-β1）在结肠癌肝转移过程中的作用及意义。方法选择6-8周雌性Balb／c小鼠36只,随机分为6组,各6只。实验组通过脾脏注射小鼠结肠癌CT26细胞建立小鼠结肠癌肝转移模型,注射细胞数分别为1×10^5个（A组）、5×10^4个（B组）、1×10^4个（C组）、5×10^2个（D组）和1×10^3个（E组）,对照组为正常小鼠。于术后21天处死小鼠,肉眼观察肝脏肿瘤转移情况并行肝脏组织学观察及IL-10和TGF-β1免疫组织化学染色。结果A、B组小鼠肝脏转移率均为100％,其他各组小鼠均未见有肝转移瘤形成。IL-10和TGF-β1表达在对照组均为阴性,但在各实验组小鼠肝脏表达均为阳性,且表达量随着脾脏注射CT26细胞数量的增加而升高,IL-10和TGF-β1的表达量在A、B、C组与D组或E组间比较,差异均有统计学意义（P=0．000）,但在D、E两组间比较,差异无统计学意义。结论5×10^4个CT26细胞脾脏注射可成功建立小鼠结肠癌肝转移模型;CT26细胞可诱导肝脏产生IL-10和TGF-β1,IL-10和TGF-β1可促使结肠癌肝转移瘤的形成。     

组织特异性胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶热化疗对裸鼠结肠癌肝脏转移的影响

目的 探讨组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统热化疗对裸鼠结肠癌肝脏转移的影响.方法 将45只裸鼠按随机数字表法分为3组:对照组、非热疗组、热疗组,每组15只.门静脉注射法建立结肠癌肝脏转移动物模型,3组分别给予不同的治疗方法.采用χ2检验和单因素方差分析3组肝脏肿瘤转移率、转移数目;观察各组病理学变化、肿瘤细胞凋亡指数;荧光定量RT-PCR和Westernblot检测肿瘤组织中CD基因的表达情况.结果 对照组、非热疗组、热疗组肝脏平均转移癌结节数目和转移率分别为(4.6±1.3)、(2.2±1.0)、(0.5±0.8)个和100.0%、60.0%、13.3%,3组比较差异有统计学意义(F=25.898,χ2=5.208,19.548,5.168,P<0.05);肿瘤细胞凋亡指数平均为4.6%、9.9%和17.4%.热疗组可见大量细胞空泡变性、坏死、溶解现象,有较多的凋亡小体形成.3组均可以检测到CD基因的表达.结论 组织特异性CD/5-FC系统热化疗对转CD基因结肠癌LoVo细胞裸鼠肝脏转移有明显的抑制作用.