二氢生物蝶呤还原酶基因启动子核心调控区域的定位及研究

目的:前期结果表明QDPR参与糖尿病肾病的发生发展。本研究对QDPR基因启动子核心调控区域定位,分析其转录调控功能。方法:构建含有大鼠QDPR基因翻译起始位点上游2 092 bp序列的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。生物信息学预测潜在的核心启动子区域,并构建该区域多个片段缺失的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。分别瞬时转染HEK293T细胞,通过双萤光素酶报告基因活性分析,定位QDPR基因启动子的核心调控序列。结果:与-2 092~-1序列相比,缺失QDPR基因上游-529~-116序列的萤光素酶活性只有原来的1%(P0.01),而仅保留-529~-1序列的萤光素酶活性是原来的64%(P0.05)。将QDPR基因上游-529~-116序列逐段缺失后发现,分别缺失-529~-429,-428~-250,-141~-116三段序列的萤光素酶活性都显著升高(P0.01),而缺失-249~-142序列的萤光素酶活性则显著下降(P0.05)。结论:大鼠QDPR基因的核心启动子可能位于翻译起始密码子上游-529~-116区域内,该区域内存在多个转录因子Sp1的结合位点,可能是QDPR基因潜在的正性调控区和负性调控区。     

人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶基因启动子区克隆与活性分析

目的 克隆人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶(cGCX)基因5'侧翼启动子区,并对其转录活性进行分析.方法 对GGCX基因5'侧翼区进行生物信息学分析,预测其转录调控区域;从人肾组织中提取基因组DNA,以其为模板扩增GGCX基因启动子区,通过酶切鉴定及测序分析无误后,将其构建至萤光报告基因载体pGL3-basic中,瞬时转染至Hela细胞,检测萤光素酶水平,从而分析扩增启动子区的转录活性.结果 成功克隆长度为804 bp(-891～-88)的GGCX基因启动子片段,并构建相应的萤光素酶重组子pGL3.GGCX Promoter,转染Hela细胞48 h后检测萤光素酶活性显示,pGL3-GGCX Promoter与空质粒对照pGL3-basic相对萤光素酶值分别为16.92±4.01与0.02±0.01,pGL3-GGCXPromoter萤光素酶活性显著增强(P<0.05).Matlnspector等分析显示该片段具有多个转录因子结合位点.结论 成功构建含有GGCX基因启动子序列的萤光素酶报告系统,为进一步研究GGCX基因功能及其转录调控奠定了基础.     

一个影响前列腺癌中L-plastin启动子转录活性的多态性位点的成功鉴定

目的研究已发现的前列腺癌中L-plastin启动子一个多态性位点对其转录活性的影响和意义。方法扩增前列腺癌细胞株LNCaP中L-plastin启动子序列,发现在距离转录起始点-1751上存在多态性位点T后,利用定点突变技术构建文献报道的启动子序列质粒(-1751C),测定含-1751T质粒和含-1751C质粒的荧光素酶活性。用巢式PCR扩增前列腺癌细胞株和癌组织中该位点序列,并进行单链构象多态性分析。结果成功构建L-plastin启动子,并发现一个位于-1751的多态性位点(C/T);成功构建启动子序列含-1751C质粒;荧光素酶活性测定表明(-1751C)质粒启动子转录活性为(-1751T)质粒的4~5倍,2者受到雄激素刺激后活性均升高;单链构象多态性分析表明该位点多态性普遍存在于前列腺癌患者和细胞株。结论鉴定了一个普遍存在于前列腺癌的L-plastin基因启动子的多态性位点,含有不同碱基位点的启动子的转录活性明显不同。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性，了解增强子增强转录效率的能力。方法采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA启动子和增强子序列，先后克隆到含有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒载体，脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在不同细胞的表达情况。结果成功构建质粒pEGFP—PS—MAPro和pEGFP-PSMAEP，转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的有效表达，且pEGFP—PSMAEP的调控转录能力较pEGFP—PSMAPro强20倍。结论PSMA启动子增强子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性，增强子能够明显增强启动子的转录效率，增加了目的基因的表达水平。PSMA启动子和增强子的共调控可以保证基因表达的强度和细胞特异性，为前列腺癌基因靶向性治疗研究提供实验依据。     

FasL启动子调控的报告基因表达质粒的构建及活性分析

目的扩增FasL启动子并构建带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒,并评价在皮质酮(啮齿类动物体内的糖皮质激素)作用的睾丸Leydig细胞中,由FasL启动子调控的荧光素酶的表达活性。本研究将为进一步分析Leydig细胞中FasL启动子转录调控的作用机制奠定基础。方法采用DNA重组技术构建由FasL启动子调控的荧光素酶报告基因的表达质粒。此重组质粒经阳离子脂质体LipofectAMINE介导,瞬时转染入Leydig细胞中,36h后细胞经皮质酮处理,并于48h时收集细胞。测定荧光素酶的相对表达活性。结果(1)酶切及测序证实成功扩增FasL基因启动子并构建了带有FasL基因启动子的报告基因表达质粒；(2)皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子调控的荧光素酶表达质粒的表达活性显著增高。结论构建成功的带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒可准确地评价FasL启动子在凋亡过程中的作用。     

大鼠抑制素α亚基启动子的克隆及其在睾丸支持细胞中转录活性的初步分析

目的克隆大鼠抑制素α亚基(Inhα)启动子,建立报告基因表达系统,初步分析其在睾丸支持细胞中的转录活性。方法采用降落聚合酶链反应(touch-down PCR)法,从大鼠睾丸组织DNA中扩增三段不同长度的Inhα启动子序列(395、606、775 bp),克隆入载体pEGFP-N1,构建绿色荧光蛋白的报告基因系统,转染大鼠睾丸支持细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达情况。结果成功构建带有Inhα启动子的绿色荧光蛋白报告基因表达系统。三段重组质粒转染支持细胞后均可见绿色荧光表达,但荧光量和强度均弱于CMV启动子,其中395片段最为显著。结论 Inhα启动子在睾丸支持细胞中的转录活性弱于CMV启动子,可能与启动子本身的序列结构有关。     

可调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建

目的　构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体 ,检测该调控元件的特异性和可调控性。方法　PCR扩增截短的AFP基因启动子、增强子 ,将上述片段与含有报告基因强化绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP 1的多克隆位点连接 ,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性EGFP表达载体 (pEGFP 1 EP)。用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系 ,荧光显微镜观测重组AFP顺式作用元件的启动活性 ,并用流式细胞术检测全反式视黄酸对它的抑制作用。结果　成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pEGFP 1的多克隆位点 ,酶切鉴定和DNA序列分析无误 ,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达 ,1× 10 -7M全反式视黄酸对其活性有明显的抑制。结论　AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体 ,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达 ,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础。     

NS2TP基因启动子报告基因载体的构建及其活性验证

目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因（NS2TP）的转录调节机制。方法应用PCR方法扩增NS2TP的启动子,克隆入pGL4.10载体,构建萤虫素酶报告基因载体,转染HepG2细胞,检测双萤虫素酶活性,验证其转录活性;通过缺失突变法构建系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体。结果成功构建了系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体,分别命名为N1、N2、N3和N4,并确定了N3为NS2TP基因的核心启动子。结论构建NS2TP基因启动子的系列截短报告基因载体,确定了其最小转录活性区域,为进一步研究NS2TP基因的转录活性调节机制奠定理论基础。     

Ki-67核心启动子在胃癌SCG-991细胞中的转录活性

目的 观察Ki-67核心启动子在人胃癌细胞中的转录活性.方法 使用缺失分析法分别从5'端和3'端对Ki-67基因启动子逐段缺失,得到不同长度的8个和3个截短DNA片段.分别插入pGL3-Basic载体后转染人胃癌SCG-991细胞,使用双荧光素酶检测系统鉴定转录活性,确定Ki-67基因核心启动子.比较Ki-67核心启动子与另2种肿瘤启动子hTERT和Survivin的转录活性.结果 自5'端缺失得到的-223～+771截短片段在SCG-991细胞内转录活性达到病毒SV40启动子活性的56.5%;自3'端缺失的-223～+30截短片段转录活性更强,为-223～+771片段活性的2.1倍,是hTERT启动子的1.7及Survivin启动子和15.3倍.结论 Ki-67核心启动子区域为-223～+30,在胃癌SCG-991细胞中的转录活性超过SV40启动子,以及hTERT启动子及Survivin启动子.     

热休克因子1对白细胞介素-10的转录调控作用及其机制

目的 探讨热休克因子1(HSFl)对白细胞介素(IL)-10的转录调控作用及其机制.方法 合成IL-10基因启动子区含热休克元件(HSE)位点的寡核苷酸探针进行凝胶电泳迁移率实验(EMSA),分析HSF1与IL-10基因启动子区的HSE的结合情况,并构建IL-10基因启动子的萤光素酶报告基因质粒,与HSF1表达质粒共转染RAW264.7细胞,检测萤光素酶活性,观察HSF1转染对启动子活性的影响.结果 生物素标记的HSFl结合片段(-376～- 369 bp)和核蛋白提取物孵育后能观察到阻滞带,阻滞现象能够被自身非标记探针竞争,但不被非标记的突变探针竞争,加入HSFl单克隆抗体,可以观测到超阻滞带,表明HSF1可以特异性结合于"HSFI识别序列",HSE核心结合位点突变后,相对萤光素酶活性突变体(34.23±2.14)相对野生型(110.09±5.48)下降3.2倍(P<0.01),通过EMSA证实了IL-10启动子区域(-688～+64 bp)存在HSF1的结合位点HSE(-376～-369 bp);突变体双萤光素酶活性分析发现HSF1的结合位点核心碱基的突变,其转录活性下降.结论 HSF1可以特异性结合于IL-10启动子区HSE(-376～-369 bp),相对萤光素酶活性分析提示HSF1可以转录激活IL-10,上调其表达.     

G250启动子的克隆及其在人肾癌细胞中的特异生物活性

目的 克隆G250启动子并插入pG3-Basic真核表达载体,探讨G250启动子在肾癌细胞中的特异生物活性.方法 提取宫颈癌Hela细胞总DNA作为模板,设计两对引物进行PCR,获取两段不同长度的G250启动子片段.测序后分别将获取的551 bp和218 bp启动子片段克隆到pGL3-Basic载体中,构建双荧光素酶检测质粒pGLB-G551和pGLB-G218.将pGL3-Basic、pGLB-G551、pGLB-G218各1μg转染G250阳性宫颈癌Hela细胞、肾癌Ketr-3细胞.运用双荧光素酶检测技术,确定G250启动子的转录活性.结果 电泳与测序结果 显示,两段G250启动子片段与报道序列一致.酶切与测序结果 显示,质粒pGLB-G551、pGLB-G218构建成功.转染pGLB-G551、pGLB-G218的Hela细胞相对荧光素酶活性分别为pGL3-Basic的11.07倍、10.36倍.Ketr-3细胞分别为pGL3-Basic的5.17倍、4.13倍.与空载体pGL3-Basic比较,pGLB-G551和pGLB-G218的相对荧光素酶活性均明显增强(P<0.05).pGLB-G551和pGLB-G218比较,相对荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功克隆出肾癌特异性G250启动子,并证明具有良好转录活性,218bp的启动子片段已具有G250启动子的所有启动效果.     

前列腺癌中L-plastin启动子的非甾体激素类顺式作用元件的鉴定

目的:寻找前列腺癌中L-p lastin启动子的非甾体激素类顺式作用元件序列,并鉴定其相应的转录因子与调控途径。方法:在切除L-p lastin启动子中甾体类激素受体位点并建立相应的荧光素酶重组子的基础上,利用外切酶行巢式切除法分段切除L-p lastin启动子基因序列,并建立相应的荧光素酶重组子,检测切除各启动子序列片段后有雄激素刺激组和无雄激素刺激组的荧光素酶活性,寻找调控L-p lastin表达的非甾体激素类启动子基因序列所在位置,通过Transfect软件分析寻找对应的转录因子,再通过定点突变技术切除转录因子的结合位点并进一步进行荧光素酶活性测定,从而获得调控L-p lastin表达的非甾体激素类途径。结果:成功分段切除了L-p lastin启动子,并建立了相应的荧光素酶重组子,转染细胞后在有及无双氢睾酮刺激下检测荧光素酶活性,发现在-206~1片段存在明显的非甾体激素受体类的调控途径,通过软件分析发现AP-4和SP-1可以与该片段结合。切除AP-4和SP-1位点后,荧光素酶活性下降,以AP-4尤为明显。结论:在L-p lastin启动子中,除了甾体类激素受体途径,仍然存在其他非甾体类调控途径,该调控途径的结合位点主要在-206~1之间,可能是通过AP-4和SP-1与该片段的启动子基因序列结合来上调L-p lastin基因表达的。     

草酸钙尿石症患者肾组织γ-谷氨酰基羧化酶基因启动子序列分析及其活性研究

目的 分析草酸钙尿石症患者肾组织γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)基因启动子序列多态性,并探讨该序列变化对启动子活性的影响.方法 分别以42例草酸钙尿石症患者肾组织(尿石组)与31例非结石肾组织(肾肿瘤癌旁正常组织,对照组)基因组DNA为模板,PCR扩增GGCX基因5'-侧翼启动子区1329 bp片段(-1270～+58 bp),电泳鉴定后,分别对两组PCR产物测序.筛选差异启动子序列克隆至萤光素酶报告基因载体pGL3-basic,转染293细胞,双萤光素酶检测启动子活性.结果 与Emembl正常序列比较,尿石组启动子片段测序共发现4处变异位点,-804 bp处TT缺失(refsnp ID:rs11433794),-704 bp处A→G、-511 bp处A→G、-115 bp处T→C.其中尿石组rs1143794SNP发生明显高于对照组(P＜0.05).构建含rs11433794SNP位点的萤光素酶重组子pGL3-GGCX Promoter(804TT),与正常序列的重组子pGL3-GGCX Promoter比较,pGL3-GCA2X Pro-motet(804TF)转录活性明显下降(P＜0.01).结论 GGCX启动子区rs11433794 SNP位点可能与草酸钙尿石症发生存在一定关系,该SNP位点可导致启动子转录活性下调,导致GGCX基因表达下降.     

斑马鱼notch1a对pka报告基因转录调控作用

目的通过双荧光素酶报告基因研究斑马鱼notch1a对pka的转录调控作用。方法利用NCBI数据库获得斑马鱼notch1a基因序列,克隆notch1a基因的胞内段NICD(Notch intracellular domain),构建pCMV-N1aICD表达载体,利用蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白的表达水平;利用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器数据库获得斑马鱼pka基因的启动子序列,构建pGL3-pka报告基因载体,然后在HEK293T细胞系中证实构建的报告基因载体具有活性;将重组荧光素酶报告载体和N1aICD表达载体共转染HEK293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证notch1a胞内段对pka基因转录水平的调控作用。结果经测序验证克隆成功后,蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白能够正常表达,且蛋白大小与预测结果一致。双荧光素酶报告基因显示,pGL3-pka组活性为pGL3空载组的3.25倍。转染pGL3-pka和pCMV-N1aICD组活性为转染pGL3-pka和pCMV空载对照组的0.31倍。结论斑马鱼notch1a对pka启动子具有转录抑制作用。在骨形成和骨重建中,Notch通路可能通过调控pka来参与成骨与破骨细胞的分化。