游离脂肪酸对人近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制

目的探讨游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFAs）对人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）的影响及作用机制。方法用含有不同浓度（0、125、250、500μmol／L）软脂酸的DMEM—F12培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）在0h、24h、48h三个时段：MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡的影响,免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及凋亡相关蛋白caspase8蛋白表达的变化。结果FFAs呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖（P〈0．05）,并可诱导细胞凋亡（P〈0．05）。经FFAs作用后,iNOS及Caspase8的表达增加。结论游离脂肪酸有抑制HK-2细胞增殖,促进其凋亡的作用,FFAs可能通过激活肾小管上皮细胞内的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,加剧肾小管上皮细胞的凋亡,而caspase8参与了其发生和发展的过程。     

非诺贝特对游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨非诺贝特对游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响。方法通过MTT法检测细胞的增殖,分光光度法检测细胞MDA表达和SOD活性;ELISA法检测细胞上清中的MCP-1和IL-8;Real-time PCR法及Western blot分别检测Bax和Bcl-2的m RNA和蛋白表达水平。结果游离脂肪酸的刺激呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖,并使细胞Bax的m RNA与蛋白表达显著上升,Bcl-2的m RNA和蛋白的表达显著下降。非诺贝特的加入显著减轻游离脂肪酸对HK-2细胞增殖的抑制作用;并使细胞bax的m RNA与蛋白表达下降,而Bcl-2的m RNA与蛋白的表达上升。同时细胞SOD表达水平上升,MDA的表达水平下降;炎性介质MCP-1和IL-8表达水平均下降。结论游离脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有时间和剂量依赖性,非诺贝特可通过减少氧化应激,抑制炎性反应,上调Bcl-2以及下调Bax的表达来抑制游离脂肪酸诱导的细胞凋亡,从而减少其肾毒性。     

重组人IL-6对近曲肾小管上皮细胞增殖及生物学表型的影响

【目的】观察重组人白细胞介素6（rIL-6）在体外对人近曲肾小管上皮细胞株（HK-2）增殖及生物学表型的影响。探讨rIL-6对HK-2细胞作用的时间-效应及剂量-效应关系。【方法】用MTT比色法检测rIL-6对细胞增殖的影响；用流式细胞术检测rIL-6对细胞周期及α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）阳性细胞百分率的影响；倒置显微镜观察rIL-6对HK-2细胞形态改变的影响。【结果】MTT比色法示，rIL-6在10～50ng／mL作用浓度范围内促进HK-2细胞增殖，呈剂量、时间依赖效应；rIL-6作用浓度为100～200ng／mL时抑制细胞增殖，随作用浓度增加抑制作用加强（F=201．582，P〈0．001），（F=43．943，P〈0．001）。rIL-6影响HK-2细胞的DNA合成。HK-2细胞有基础量的α—SMA表达，25ng／mL rIL-6与HK-2孵育1～48h后，α—SMA阳性细胞百分率高峰出现在48h（F=442．22，P〈0．001）。rIL-6干预下，HK-2细胞形态由卵园型渐转变为长棱型、长条型。【结论】rIL-6可促进HK-2细胞增殖及生物学表型的转化，但大剂量的rIL-6可抑制HK-2细胞增殖。     

游离脂肪酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的实验研究

目的 探讨游离脂肪酸（FFAs）对大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）的凋亡作用及凋亡机制。方法 用含有不同浓度（0、125、250、500μM）软脂酸的DMEM-F12培养肾小管上皮细胞（NRK-52E）,在24h、48h两个时段以原位末端标记（TUNEL法）检测细胞凋亡率,用硝酸还原酶法测定以上各组培养液中一氧化氮（NO）水平。在48h时段用免疫细胞化学法检测caspase-3表达水平。结果 随着软脂酸浓度的增高、作用时间的延长：①NRK-52E细胞的凋亡率逐渐增高,24h时三个软脂酸组按软脂酸浓度由低到高的凋亡率依次为（9.7±1.9）%、（14.2±4.5）%、（23.4±5.3）%,48h时为（16.2±3.7）%、（24.8±4.4）%、（35.4±5.7）%,与对照组相比均有统计学意义（P〈0.05）;②在凋亡率增高组的培养液中测得NO浓度也增加,差异均有显著性（P〈0.05）。③48h时各软脂酸干预组caspase-3阳性表达率增高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论 游离脂肪酸具有促进肾小管上皮细胞凋亡的作用,而这种作用与其自身在FFAs作用下产生过多的NO使caspase-3高表达有关。     

IL-18对肾小管上皮细胞Col-Ⅳ及MCP-1表达和分泌的影响

目的探讨白细胞介素-18(IL-18)对肾小管上皮细胞Col-Ⅳ及MCP-1表达和分泌影响。方法应用终浓度为0,0.1,1,10,100ng/ml的IL-18处理体外培养人类近端肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)24,48,72h,用RT-PCR法检测IL-18对HK-2细胞Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA表达;采用ELISA法测定细胞培养上清中Col-Ⅳ及MCP-1分泌水平。结果IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-ⅣmRNA和MCP-1mRNA的表达,IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-Ⅳ的分泌,呈剂量依赖性地促进HK-2细胞MCP-1分泌,但其蛋白分泌量在24h即达高峰,未见时间依赖关系。结论IL-18可能部分通过促进细胞外基质的过度分泌和炎症细胞趋化,参与促进肾间质纤维化的进程。     

重组人IL-6对近曲肾小管上皮细胞增殖及生物学表型的影响

 【目的】观察重组人白细胞介素6（rIL-6）在体外对人近曲肾小管上皮细胞株（HK-2）增殖及生物学表型的影响。探讨rIL-6对HK-2细胞作用的时间-效应及剂量-效应关系。【方法】用MTT比色法检测rIL-6对细胞增殖的影响；用流式细胞术检测rIL-6对细胞周期及α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）阳性细胞百分率的影响；倒置显微镜观察rIL-6对HK-2细胞形态改变的影响。【结果】MTT比色法示，rIL-6在10～50ng／mL作用浓度范围内促进HK-2细胞增殖，呈剂量、时间依赖效应；rIL-6作用浓度为100～200ng／mL时抑制细胞增殖，随作用浓度增加抑制作用加强（F=201．582，P〈0．001），（F=43．943，P〈0．001）。rIL-6影响HK-2细胞的DNA合成。HK-2细胞有基础量的α—SMA表达，25ng／mL rIL-6与HK-2孵育1～48h后，α—SMA阳性细胞百分率高峰出现在48h（F=442．22，P〈0．001）。rIL-6干预下，HK-2细胞形态由卵园型渐转变为长棱型、长条型。【结论】rIL-6可促进HK-2细胞增殖及生物学表型的转化，但大剂量的rIL-6可抑制HK-2细胞增殖。     

IL-18对肾小管上皮细胞Col-IV及MCP-1表达和分泌的影响

目的 探讨白细胞介素18（IL-18）对肾小管上皮细胞Col-IV及MCP-1表达和分泌影响。 方法 应用终浓度为0、0.1、1、10、100ng/mL的IL-18处理体外培养人类近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）24h、48h和72h。应用RT-PCR法检测IL-18对HK-2细胞Ⅳ型胶原（Col-IV）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNA表达;采用ELISA法测定细胞培养上清中Col-IV及MCP-1分泌水平。 结果 IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-IVmRNA和MCP-1 mRNA的表达,IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-IV的分泌,呈剂量依赖性地促进HK-2细胞MCP-1分泌,但其蛋白分泌量在24h即达高峰,未见时间依赖关系。 结论 IL-18可能部分通过促进细胞外基质的过度分泌和炎症细胞趋化,参与促进肾间质纤维化的进程。     

低氧对肾小管上皮细胞TGF—β1表达及增殖的影响

进展性肾脏疾病是以肾功能进行性减退为特征的一组肾脏疾病。当原始刺激终止后 ,肾脏病变仍进行性恶化 ,其机理尚未完全阐明。目前有研究者提出慢性低氧是肾脏疾病进展的原因之一[1] 。本研究观察了低氧对肾小管上皮(Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙｃａｎｉｎｅｋｉｄｎｅｙ ,ＭＤＣＫ)细胞的作用 ,以探讨低氧在肾小管间质病变进展中的作用机理。材料与方法一、实验材料ＭＤＣＫ细胞由法国Ｔｅｎｏｎ医院赠送。流式细胞仪由上海第二医科大学生物物理教研室提供。二、实验方法ＭＤＣＫ细胞于含 10 %小牛血清的ＤＭＥＭ培养液中培养 ,培养传代如常。细…     

乙醛对人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1的影响研究

目的 通过研究乙醛对体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌转化生长因子-β1 (TGF-β1)的影响,以探讨乙醛导致肾小管间质纤维化的机制.方法 选取人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)培养于含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液中.以不同浓度的乙醛(0、50、100、200、400 μmol/L)刺激HK-2细胞24 h.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HK-2细胞中TGF-β1的基因表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中TGF-β1的蛋白表达.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清液中TGF-β1的水平.结果 RT-PCR和Western blot结果显示,乙醛呈剂量依赖性地增加HK-2细胞中TGF-β1基因和蛋白的表达;ELISA法结果显示,乙醛呈剂量依赖性地增加HK-2细胞培养上清液中TGF-β1的水平.结论 乙醛能够促进体外培养的人肾小管上皮细胞合成分泌TGF-β1,从而促进肾小管间质纤维化的进展.     

马兜铃酸对体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞的损伤作用

目的:观察马兜铃酸(aristolochic acid,AA)对体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的损伤作用。方法:体外培养NRK-52E,分别以不同浓度的AA-Na刺激细胞,每组设6个复孔,孵育24 h。透射电镜观察NRK-52E细胞的超微结构,MTT法检测不同浓度AA对NRK-52E细胞增殖的影响,流式细胞仪检测NRK-52E细胞的凋亡,免疫细胞化学法检测AA对NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响;检测不同时间段(12、24、48 h)马兜铃酸对NRK-52E细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)及内皮素-1(ET-1)mRNA和Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达的影响。结果:①AA浓度低于10μg/ml时对NRK-52E的增殖无明显影响,20~40μg/ml浓度的AA可明显抑制NRK-52E细胞的增殖;②较高浓度的AA(40μg/ml)可明显刺激细胞凋亡;③AA5、10、20、40μg/ml均可刺激NRK-52E表达α-SMA,其中AA10μg/ml对α-SMA表达较强;④AA刺激NRK-52E细胞24 h后TGF-β1mRNA、ET-1 mRNA表达最多,48 h时表达水平下降,而COL-I的表达水平随时间的延长而上调,呈时间依赖性。结论:AA可直接损伤肾小管上皮细胞,促进其表达肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA,即有促转分化作用,且其对NRK-52E细胞的损伤作用呈剂量及时间依赖性。     

肾小管上皮细胞转分化在高脂血症大鼠肾损害中的作用

目的 探讨肾小管上皮细胞转分化在脂质肾损害发病中的可能作用。方法 用含4%胆固醇和1％胆酸钠的高脂饲料饲喂大鼠建立高脂模型，观察大鼠血脂、尿蛋白、血肌酐和肾间质病理改变，并用免疫组化技术检测肾小管上皮细胞a-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、角蛋白的表达。结果 高脂大鼠血脂、尿蛋白和血肌酐升高，肾间质出现明显病理改变，免疫组化显示肾小管上皮细胞α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白表达增高，角蛋白表达下调。结论 肾小管上皮细胞转分化在促进脂质肾损害发生发展的过程中起重要作用。     

阿昔洛韦诱导的人肾小管上皮细胞NGAL、IL-18表达及其意义

目的观察不同浓度阿昔洛韦诱导的体外培养人近端肾小管上皮细胞（HK-2）的形态变化、IL-18、NGAL的表达及其意义。方法将正常培养的HK-2细胞分组：1正常组;22μg/ml阿昔洛韦组;33μg/ml阿昔洛韦组（模型组）。各组干预12 h后,倒置显微镜下观察各组细胞状态、细胞数量变化,逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测各组细胞IL-18、NGAL基因表达水平,Western-blotting法检测各组IL-18、NGAL蛋白表达。结果12μg/ml阿昔洛韦及3μg/ml阿昔洛韦组,细胞生长与正常组比较无差异,但细胞形态异常;2在mRNA水平,模型组干预后,IL-18水平明显增高,NGAL水平明显增高,与正常组比较P〈0.01;与蛋白水平表达方面类似。结论阿昔洛韦对HK-2细胞的生长有浓度依赖性抑制作用;高浓度的阿昔洛韦可导致HK-2细胞结晶,低浓度阿昔洛韦诱导的肾小管上皮细胞损伤伴有NGAL、IL-18的异常表达和分泌,对临床早期监测阿昔洛韦所致急性肾损伤有重要意义。     

醋酸铅对体外培养人肾小管上皮细胞的毒性效应

目的  探讨醋酸铅对人肾小管上皮细胞系HK-2的毒性效应。方法  醋酸铅处理HK-2后,Giemsa及HE染色法检测观察细胞形态学变化;细胞免疫化学法检测凋亡相关蛋白P53、Bax、Bcl-2的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果  经10μmol/L和20μmol/L醋酸铅处理48h后,Giemsa及HE染色均显示醋酸铅组细胞成凋亡形态学改变。HK-2的细胞免疫化学结果示醋酸铅组的P53和Bax阳性表达升高,而Bcl-2的阳性表达下降。流式细胞仪检测结果表明,醋酸铅组细胞凋亡率较对照组明显升高。结论  醋酸铅可损伤HK-2,促进其凋亡及影响肾脏。     

不同浓度尿酸对体外培养肾小管上皮细胞氧化应激及凋亡的影响

目的：探讨不同浓度尿酸对肾小管上皮细胞氧化应激及凋亡的影响。方法将人近曲小管上皮细胞株(HKC?8)随机分为对照组和尿酸A组、尿酸B组和尿酸C组,每组15例,对照组加入培养液,尿酸A组、尿酸B组和尿酸C组分别加入0.1 mmol/L、0.4 mmol/L和0.8 mmol/L尿酸,培养24 h,光泽精化学发光法检测各组肾小管上皮细胞内超氧阴离子生成量,紫外分光光度法检测还原型辅酶ⅡNADPH酶蛋白水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL）检测肾小管上皮细胞凋亡率。结果尿酸A组、B组和C组肾小管上皮细胞内超氧阴离子生成量和NADPH酶蛋白水平高于对照组,且呈剂量依赖,差异均有统计学意义(P<0.05);尿酸A组、B组和C组肾小管上皮细胞凋亡率高于对照组,亦呈剂量依赖,差异均有统计学意义(P<0.05);尿酸A组、B组和C组肾小管上皮细胞凋亡率分别为(73.4±11.7)%、(322.6±23.2)%、(432.7±34.1)%,均高于对照组的(16.9±1.2)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论尿酸干预能够影响肾小管上皮细胞内超氧阴离子生成量、NADPH酶蛋白水平和肾小管上皮细胞凋亡率,尿酸浓度越高,超氧阴离子生成量、NADPH酶蛋白水平和肾小管上皮细胞凋亡率越高。     

葡萄糖、游离脂肪酸对培养的人血管内皮细胞一氧化氮含量的影响

目的：观察不同浓度的葡萄糖(Glu)、软脂酸（PA）和油酸（OA）对培养24小时的人血管内皮细胞一氧化氮（NO）生成的影响。方法：采用硝酸还原酶法。结果：Glu（30mmol/L)组和Glu30mmol/L PA0.25mmol/L组细胞上清液中NO含量明显高于对照组（P＜0．05）；OA（0．025、0．5mmol/L）组，PA＋OA（PA0．25mmol/L＋OA0．5mmol/L）组及Glu＋PA＋OA（Glu30mmol/L＋PA0．25mmol/L＋OA0.5mmol/L）组细胞上清液中NO含量明显低于对照组（P＜0．05）；PA（0．125、0．25、0．5mmol/L）组与对照组，上清液中NO含量坎明显差异（P＞0．05）。结论：高浓度Glu作用于内皮细胞24小时使用内皮细胞生成NO增多，而OA抑制内皮细胞生成NO。高浓度OA与高浓度Glu联合作用时，OA抵消了Glu的作用，仍然使NO降低。高浓度Glu和游离脂肪酸对内皮细胞NO生成出现的相反效应的机制应进一步研究。     

人环状RNA＿0114428对脂多糖诱导的人肾小管上皮HK-2细胞损伤的作用及其机制

目的：探讨人环状RNA＿0114428 (circ＿0114428)对脂多糖(LPS)诱导的人肾小管上皮HK-2细胞损伤的作用,阐明circ＿0114428通过调节微小RNA-139-5p (miR-139-5p)/转化生长因子β受体2 (TGFBR2)轴改善HK-2细胞损伤的可能分子机制。方法：体外培养HK-2细胞,双荧光素酶报告基因实验验证miR-139-5p与circ＿0114428和TGFBR2的靶向调控关系,CCK-8法筛选合适的LPS干预浓度和时间。给予10 mg·L^-1 LPS干预12 h构建HK-2细胞损伤模型,HK-2细胞分为对照组、LPS组、LPS+circ＿0114428沉默对照(LPS+si-NC)组、 LPS+circ＿0114428沉默(LPS+si-circ＿0114428)组、LPS+circ＿0114428沉默+miR-139-5p抑制剂对照(LPS+si-circ＿0114428+in-NC)组和LPS+circ＿0114428沉默+miR-139-5p抑制剂(LPS+si-circ＿0114428+in-miR-139-5p)...     

软脂酸对肾小管上皮细胞TLR4表达的影响

目的通过研究软脂酸(PA)对肾小管上皮细胞Toll样受体4(TLR4)表达的影响,初步探讨游离脂肪酸(FFA)在引发肾脏微炎症反应的相关作用机制。方法体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),采用不同浓度软脂酸进行干预,用RT-PCR法检测12 h、24 h后肾小管上皮细胞TLR4 mRNA水平,ELISA方法检测24 h后IL-6、TNF-α的表达。结果软脂酸组的TLR4、IL-6、TNF-α表达较对照组均明显升高,且呈现一定的浓度依赖趋势(P<0.05)。结论软脂酸可能是通过刺激肾小管上皮细胞表达TLR4而促进肾脏炎症反应。     

马兜铃酸作用下大鼠肾小管上皮细胞尾加压素Ⅱ含量的变化

目的研究马兜铃酸(AA)作用下大鼠肾小管上皮细胞尾加压素Ⅱ(UⅡ)含量的变化。方法采用机械分离和酶消化法获取大鼠肾小管上皮细胞并进行培养、鉴定;用RT-PCR和Western blot法分别测定不同浓度(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)AA作用下大鼠肾小管上皮细胞中Ⅶ基因和蛋白表达情况。结果培养的细胞经Cytokeratin-18免疫细胞化学染色确定为肾小管上皮细胞。AA以剂量依赖的方式促进肾小管上皮细胞UIImRNA和蛋白表达,5ng/ml AA作用下肾小管上皮细胞UⅡ mRNA表达即显著增强(P<0.01),其蛋白表达在10ng/ml AA作用下明显增强(P<0.05)。结论AA作用下大鼠肾小管上皮细胞UⅡ含量明显增加,推测UⅡ在AA所致大鼠肾小管上皮细胞损伤中可能有一定作用。     

肾小管上皮细胞转分化与IgA肾病预后的相关性分析

目的 检测IgA肾病中肾小管上皮细胞转分化及小管间质纤维化程度,并探讨其与IgA肾病预后的相关性。 方法 选取74例IgA肾病患者的肾穿活检组织,分为3组：轻度系膜增生组（27例）、局灶增生组（28例）和增生硬化组（19例）。检测患者的血压、血清肌酐及24 h尿蛋白定量。采用免疫组化及Masson方法观察肾小管间质内α-SMA、Vimentin、TGF-β和胶原纤维的表达。 结果 IgA肾病患者的血压、血清肌酐及24 h尿蛋白定量随病理分级增加逐渐升高,增生硬化组患者的各项临床指标均显著高于轻度增生组和局灶增生组（P＜0.01),局灶增生组24 h尿蛋白定量与轻度增生组间差异有显著性（P＜0.01); IgA肾病小管间质α-SMA、Vimentin及TGF-β表达及表示纤维化程度的胶原纤维表达随分级增加逐渐增高,各组间有差异（P＜0.05或 P＜0.01)。IgA肾病组织中α-SMA、Vimentin、胶原纤维与临床指标血清肌酐、24 h尿蛋白定量中度相关（P＜0.05）, Vimentin与α-SMA、胶原纤维的表达均呈高度相关（P＜0.01)。　结论 IgA肾病中肾小管上皮细胞转分化程度与小管间质纤维化及肾功能异常具有相关性,肾小管上皮细胞转分化可能是肾脏预后不良的关键因素之一,ɑ-SMA和Vimentin的表达可能作为评估临床IgA肾病预后指标之一。     

肌醇加氧酶在糖尿病肾病发病机制中的作用

[目的]研究高糖环境下大鼠肾近曲小管上皮细胞肌醇加氧酶（myoinositol oxygenase,MIOX）的表达及糖尿病肾病大鼠体内肌醇耗竭的机制。[方法]体外培养大鼠近曲肾小管上皮细胞株（NRK-52E）,将其分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）和渗透浓度对照组（MG）,并分别于12、24、48、72h应用RT—PCR法检测MIOX的mRNA表达,免疫荧光细胞化学法检测其蛋白的表达。[结果]HG组MIOXmNA与蛋白表达水平在12h出现升高,二者分别在24h与48h达高峰。NG组的MIOXmRNA及蛋白表达水平各时间点差异无显著性意义（P〉0．05）;与NG组和MG组相比,HG组MIOX的mRNA及蛋白表达均明显升高（P〈0．01）。MG组明显高于NG组（P〈0．05）。[结论]高糖能促进大鼠肾近曲小管上皮细胞肌醇加氧酶（MIOX）的表达,并可能通过MIOX的形成增加介导肌醇的耗竭,提示MIOX参与了糖尿病肾病的发生发展。