拉米夫定耐药HBV毒株的RT区序列分析

目的分析拉米夫定耐药HBV毒株部分RT区序列，以了解RT区YMDD基序之外HBV的变异情况。方法采用PCR方法对拉米夫定临床耐药患者治疗前及耐药后血清HBV部分RT区序列进行扩增，扩增的核苷酸片段覆盖HBV RT的B区～E区及S基因“a”决定簇，对PCR产物进行直接测序，将HBV RT区核苷酸和推导的氨基酸序列-与治疗前50株HBV野毒株序列和Genebank中77株不同基因型野毒株序列进行比较，同时对HBV进行血清分型。结果60例患者有YMDD变异，其中26例为adw亚型，占43．33％；34例为adr亚型，占56．67％。另外12例患者(16．67％)未发现YMDD变异。16例患者出现11个RT保守区氨基酸变异(不包括550和526位氨基酸变异)；25例患者出现19个HBVRT非保守区氨基酸变异。结论拉米夫定耐药株的氨基酸变异不仅见于RT B区的526和C区550两个位点，B、C区的其他位点、保守区以及RT非保守区也可发生多个变异。     

拉米夫定耐药与HBV YMDD变异关系的研究

探讨拉米夫定耐药与HBVYMDD变异之间关系。对拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎进行肝功能、乙肝病毒血清学指标、YMDD耐药基因变异检测。 10 2例慢性乙型肝炎血清中 ,HBVDNA阴性 6 3例 (6 1 8% ) ,39例阳性 ,其中HBVYMDD变异 2 2例 ,变异率为 5 6 4 % ,并与用药时间长短有关 ,9- 17个月和 18- 30个月变异检出率分别为5 1 7%和 70 % ,HBVYMDD变异组ALT为 (5 9 94± 8 6 0 )U/L ,显著高于无HBVYMDD变异组的 (5 0 6 0± 6 12 )U/L。基因芯片技术检测HBVYMDD变异有一定的临床意义 ,YMDD变异是HBV对拉米夫定耐药的原因之一。     

HBV YMDD变异者采用阿德福韦和恩替卡韦治疗144周临床比较

目的 评价阿德福韦(ADV)和恩替卡韦(ETV)治疗慢性乙型肝炎HBV YMDD变异患者144周的疗效和安全性.方法 2005年6月至2007年6月在门诊和住院的经拉米夫定(LAM)治疗后出现HBV YMDD变异的慢性乙型肝炎患者120例,随机分为4组,A组单用ADV 10 mg/d治疗144周;B组采用ADV 10 ...     

拉米夫定与HBV YMDD耐药变异及临床相关因素分析

目的:用PCR-RFLP方法检测慢性乙型肝炎患者HBV-YMDD变异发生的情况,并分析与YMDD变异发生有关的因素。方法:从慢性乙型肝炎患者血清中提取的HBV DNA,扩增HBV多聚酶YMDD主型区核苷酸序列,用针对突变位点的特异限制性内切酶酶切扩增产物,经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳后用限制性片段长度多态性技术鉴定HBVYMDD变异。结果:在152例慢性乙型肝炎患者中,72例单用拉米夫定治疗、41例接受拉米夫定与干扰素联合治疗、39例未接受拉米夫定治疗的患者,HBV YMDD变异检出率分别是47.2％、19.5％、7.7％;72例单用拉米夫定治疗的患者,36例治疗2周～6个月、20例治疗7～12个月、16例治疗13～27个月,HBV YMDD变异检出率分别是25％、55％、87.5％。结论:在使用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的过程中可发生YMDD耐药变异,且随拉米夫定治疗时间的延长,变异发生率增加,但拉米夫定与干扰素联合进行抗病毒治疗可延迟或阻滞YMDD变异的发生。HBVYMDD变异可能自然存在或发生。HBV基因组其他位点的变异也可能使HBV对拉米夫定产生耐药性。     

乙型肝炎病毒耐药相关的几个重要问题

拉米夫定（LAM）、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定（telbivudine）为4种获准在我国上市用于慢性乙型肝炎治疗的核苷（酸）类药物。LAM是第一个获准上市的此类药物,长达10年的临床广泛运用中保持着良好的安全用药记录。然而,LAM耐药成为日益凸现的临床难题,随着服药时间的延长,[第一段]     

德发现对阿德福韦耐药的HBV变异株

据医业网4月29日报道（原载 N Engl J Med 2006；354：1807-1812），研究确定了对逆转录酶抑制剂阿德福韦（adefovir）原药耐药的乙型肝炎病毒（HBV）变异株；阿德福韦通常作为发生拉米夫定耐药时的后备用药。     

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD野毒株和变异株的变化

目的 观察慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者应用拉米夫定治疗前后,YMDD野毒株及变异株的动态变化,并分析其临床意义。方法 取5例CHB患者治疗前与治疗48周的10份血清标本,先用PCR法扩增包括YMDD基序的乙型肝炎病毒(HBV)部分核苷酸序列,然后进行DNA序列测定,同时分别进行克隆,每份标本随机挑选20～24株单克隆,用实时荧光PCR法检测YMDD野毒株及其变异株。结果 5例CHB患者治疗前PCR产物直接测序结果未检出YMDD变异,治疗48周时有4例检出YMDD变异,但对每株克隆的分别检测显示：治疗前YMDD变异株(YIDD／YvDD)所占比率分别为0％、9．5％、0％、4．5％、5．6％;治疗48周时所占比率分别为100％、100％、65％、100％、0％。其中1例患者治疗前检出YIDD变异株,而治疗48周时YVDD变异株则变成优势株。治疗52周时,4例YMDD变异患者中2例HBVDNA和血清丙氨酸转氨酶(ALT)突破,1例患者ALT突破,但HBVDNA为阴性。结论 YMDD变异株在拉米夫定治疗前的血清中已存在,在服用拉米夫定后,由于选择性抑制了野毒株,使YMDD变异株由弱势株变成优势株,部分患者可导致拉米夫定临床耐药。YVDD变异株可能比YIDD变异株的复制能力强。     

拉米夫定耐药患者乙型肝炎病毒多聚酶区基因突变的检测分析

目的建立以基因测序检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶区基因突变的方法,并分析拉米夫定耐药者HBV多聚酶区基因主要耐药突变的分布情况。方法采用巢式PCR方法对174例拉米夫定耐药患者血清HBV多聚酶区进行扩增,对PCR产物进行直接测序,将YMDD突变阳性与阴性的病例分别进行HBV耐药基因突变的分析和比较。结果本研究154例YMDD突变阳性的患者中有10种突变类型,其中以rtM204I突变最多见,为46例（29．9％）,其次为rtL180M／M204V（26．6％）、rtL180M／M204I（17．5％）、rtV173／L180M／M204V（13．0％）、rtM204V（2．6％）、rtL180M／M204V／M204I（5．8％）、rtV173L／L180M／M204V／M204I（1．3％）、rtV173L／M204IrtM204I／M204V（1．3％）、rtM204I／M204V（1．3％）。另外,rtM204V联合rtL180M或rtV173L的突变率较rtM204I联合rtL180M或rtV173L显著增高。从rtL180M突变角度来看,rtL180M与rtM204V的联合突变率最高,其次为rtL180M联合rtM204I突变,rtL180M与rtL173M的联合突变率最低。从rtV173L突变角度来看,rtV173L联合rtM204V或rtL180M突变的发生率均高于rtV173L联合rtM204I的突变率,且rtV173L突变多联合rtM204V和rtL180M突变同时发生。结论拉米夫定耐药株的氨基酸突变复杂多样,需要对拉米夫定耐药多个相关位点进行检测。     

慢性HBV感染前C区变异与病毒复制水平关系

探讨HBV前C基因变异与病毒复制水平的关系在慢性HBV感染者中的意义。应用错配聚合酶链反应（PCR）－限制性片段长度多态性（RFLP）分析与荧光定量聚合酶链反应检测HBVDNA相结合,对30例HBsAg（＋）、抗－HBe( )及抗－HBc( )慢性HBV感染者,其中无症状携带者（AsC)9例、慢性乙型肝炎（CHB）12例及慢性重症肝炎（CHF）9例进行前C区基因变异与HBVDNA水平关系进行分析。AsC组3例（33．33％）,CHB组9例（75％）及CHF组8例（88．89％）有A83(nt1896)变异。荧光定量PCR结果表明HBVDNA含量在CHF组中最高。HBV前C变异与HBV不同感染状态中都可见,其病毒复制水平与肝病活动相关。     

HBV PRt204+180以外位点变异与拉米夫定耐药关系探讨

目的 探讨慢性乙型肝炎患者HBV P区常见耐药位点Rt204±180以外位点变异与拉米夫定耐药关系.方法 收集27例接受拉米夫定初治患者治疗基线和获得病毒学应答后出现病毒学反弹的血清标本,采用PCR产物直接测序技术,检测治疗基线和病毒学反弹时HBV DNA的P区变异位点,对位点变异与拉米夫定耐药关系进行分析.结果 HBV P区的rtA181V、rtM171R、rtN/H238T/A和rtI187V变异不伴随有P区rtM204V/1±rtL180M耐药位点的变异.结论 HBV P区的rtA181V、rtM171R、rtN/H238T/A和rtI187V变异可能是拉米夫定耐药的新变异位点.     

ADV初治耐药与LAM耐药者再耐药时HBV-RT区的变异特征

目的:研究阿德福韦酯(adefovir,ADV)初治耐药和ADV用于挽救治疗拉米夫定(lamivudine,LAM)耐药者再耐药时HBV毒株RT区变异特征的差异性.方法:我院就诊的ADV初治耐药者73例,ADV用于挽救治疗LAM耐药者后再耐药者34例,共计107例,在HBVDNA突破时采用PCR方法扩增HBV-RT区基因,对PCR产物直接测序,用Chromas2.0软件分析HBV-RT区基因的核苷酸和氨基酸差异、变异模式,同时使用Clustalx1.81.msw进行基因型分析.结果:在107例患者中,存在rtA181V变异36例,rtA181T变异43例,rtN236T变异47例,rtM204I/V±rtL180M变异20例,其他相关变异如rtA181S/C、rtH/N238S/T/R/A/K、rtV214I/A、rtQ215H共12例.ADV初治组检测到rtA181V/T变异27例(36.99%)、rtN236T变异14例(19.18%)、rtA181V/T+rtN236T变异28例(38.36%),rtA181T/V和rtN236T以外的变异4例(5.48%).其中发生rtA181V和rtA181T变异患者分别有33.3%、64.5%合并rtN236T变异(P=0.0091);ADV挽救治疗LAM耐药者再耐药,检测到rtA181V/T变异21例(61.76%)、rtN236T变异2例(5.88%)、rtA181V/T+rtN236T变异3例(8.82%),rtA181T/V和rtN236T以外的变异8例(23.53%).其中发生rtA181V患者25%合并rtN236T变异,而rtA181T变异患者未检测到rtN236T变异(P=0.2311).20例(58.83%)患者合并rtM204I/V变异,这20例患者中12例(35.29%)合并rtA181V/T和/或rtN236T变异的多重耐药变异.有12例未检测到rtA181T/V和rtN236T变异,但检查到rtA181S/C(2例)、rtV214I/A(3例)、rtQ215H(1例)、rtH/N238S/T/R/A/K(6例)等ADV耐药相关变异,其中ADV挽救治疗LAM耐药患者8例,ADV初治患者4例,两组间存在统计学差异(P=0.0169).结论:ADV初治耐药主要发生rtA181V/T和rtN236T变异,ADV挽救治疗LAM耐药再耐药主要发生rtA181V/T变异,且后者耐药模式更复杂.     

阿德福韦酯单药挽救治疗对拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者3年疗效观察

目的总结阿德福韦酯(ADV)单药挽救治疗拉米夫定(LAM)耐药慢性乙型肝炎患者效果,分析疗效影响因素,探讨单药挽救LAM耐药的可行性。方法 60例慢性乙型肝炎应用LAM耐药后入组挽救治疗。收集患者的基本特征:如年龄、性别、肝生化指标、HBV DNA及HBV M。纪录治疗持续时间及应答,并进行分组对照。结果 60例中,HBV DNA定量反弹≥1log10拷贝/ml 20例,HBV DNA测序rtM204I/V、rtL180M位点变异40例。生化学突破的LAM耐药患者,给予ADV单药治疗。完成156周治疗者42例。HBV DNA低复制组(基线水平HBV DNA 103～105拷贝/ml)治疗后第12至156周HBV DNA转阴率均为80.0%,高复制组(基线水平HBV DNA≥106拷贝/ml)转阴率为40.7%～44.7%,两组相比差异有统计学意义(P<0.01)。HBV DNA转阴率随治疗时间延长渐增加。治疗156周时,HBeAg阳性血清学转换率24.1%。4例因检测出rtA181V/I/S位点变异改用恩替卡韦(ETV)。结论 ADV单药挽救治疗LAM耐药慢性乙型肝炎,具有一定的疗效,且更适合于低病毒载量患者。     

Impact of hepatitis B e antigen-suppressing mutations on the replication efficiency of entecavir-resistant hepatitis B virus strains

Hepatitis B e antigen (HBeAg)-negative hepatitis B commonly requires long-term treatment with nucleos(t)ide analogues aiming at persistently suppressing hepatitis B virus (HBV) replication to halt progression of liver disease and prevent complications. Entecavir (ETV) is widely used in HBeAg-negative hepatitis B, but distinct HBV polymerase mutations can confer resistance against ETV, in conjunction with lamivudine resistance. Precore (PC) and basal core promoter (BCP) mutations that underlie HBeAg-negativity enhance replication of lamivudine-resistant mutants. To comprehensively analyse the impact of PC or BCP mutations on viral replication of ETV-resistant HBV mutants, replication-competent HBV constructs were generated harbouring lamivudine resistance (rtM204V/rtL180M, rtM204I) plus ETV resistance (rtS202G, rtS202I or rtT184G) on wild-type (WT)-, PC- and BCP-backgrounds. Functional consequences on viral fitness and susceptibility to antivirals were assessed in vitro. The presence of any ETV resistance drastically reduced viral replication when compared to WT HBV. In rtS202G mutants (plus lamivudine resistance), addition of either PC or BCP mutations moderately enhanced the reduced replication, without reaching WT HBV levels. In rtS202I or rtT184G mutants, PC and BCP mutations did not significantly improve viral fitness. All ETV-resistant constructs, independently of PC or BCP mutations, showed resistance towards ETV and lamivudine, but remained susceptible to tenofovir. Our data demonstrate that HBeAg-suppressing PC or BCP mutations cannot restore the strongly reduced replicative capacity of ETV-resistant HBV mutants to WT level, although they moderately increase replication of rtS202G combination mutants. ETV resistance thereby differs from lamivudine resistance alone, corroborating that ETV is in short term a safe option for HBeAg-negative patients.     

慢性HBV感染者抗病毒治疗前HBV基本核心启动子及前C区突变的检测及意义

目的研究慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者抗病毒治疗前HBV基本核心启动子（BCP）突变和前C区（PreC）突变与HBeAg、HBV DNA水平和慢性肝病进展的关系。方法收集283例慢性HBV感染者抗病毒治疗前的血清标本,其中慢性乙型肝炎（CHB）185例,肝硬化（LC）98例。采用PCR后直接测序法检测HBV BCP和PreC区突变,同时确定基因型。结果在HBeAg阴性和HBeAg阳性CHB患者中,前C区A1896变异率分别为44.6%（37/83）和21.6%（22/102）（χ2=11.154,P=0.001）,LC患者分别为43.4%（23/53）和17.0%（8/47）（χ2=8.101,P=0.004）。在HBeAg阳性患者中,BCP T1762/A1764双突变率LC组和CHB组分别为89.4%（42/47）和70.6%（72/102）（χ2=6.310,P=0.012）。在单变量分析中,只有年龄（≥45岁）（χ2=27.861,P〈0.001）、BCP T1762/A1764双突变（χ2=8.675,P=0.003）和HBV DNA（≥105拷贝/ml）（χ2=20.499,P〈0.001）与LC进展有关。多因素Logistic回归分析（匹配年龄和性别）发现,BCP T1762/A1764双突变（OR=3.260,95%CI：1.401～7.586;wald=7.517,P=0.006）和HBV DNA（≥105拷贝/ml）（OR=4.640,95%CI：2.331～9.237;wald=19.089,P〈0.001）是LC进展的危险因素。结论前C区A1896突变与HBeAg的消失有关;年龄（≥45岁）、BCP T1762/A1764双突变和HBV DNA高载量（≥105拷贝/ml）与肝硬化进展有关。     

Long-term follow-up of chronic hepatitis B after the emergence of mutations in the hepatitis B virus polymerase region

Treatment of chronic hepatitis B has been greatly improved by the use of lamivudine, but mutations occur in the polymerase region of hepatitis B virus (HBV) and lamivudine-resistant mutants frequently develop. The emergence of lamivudine-resistant strains of HBV is a problem for treating chronic hepatitis B using lamivudine. We observed biochemical and virological changes in 15 patients with chronic hepatitis B for a median period of 29 months (range: 4-42 months) after the emergence of lamivudine-resistant mutants of HBV. Patterns of mutation of the polymerase gene were examined by sequencing the LLAQ motif in domain B and the YMDD motif in domain C. Exacerbation of liver dysfunction occurred in 14 (93.3%) of the 15 patients at a median of 4 months after the emergence of mutations. However, exacerbation of liver dysfunction was observed only in four patients (26.7%) at the time of appearance of the first mutations and in 80.0% of the patients at the time of appearance of the second mutations. Increase in serum alanine aminotransferase (ALT) levels was significantly greater at the time of appearance of second mutations (P = 0.0096). In most cases, wild-type HBV was mutated with the substitution of only rtM204I at first, and rtL180M/M204I mutations and then rtL180M/M204V mutations subsequently appeared. Further mutations of the polymerase region caused clinical deterioration. Thus as mutations emerge in the polymerase region, the clinical outcome deteriorates. Thus, monitoring the patterns of mutation of the polymerase gene is useful when using lamivudine for treating HBV.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA和松弛环状DNA耐药突变检测及比较

目的 建立检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)逆转录酶区(RT)耐药位点的方法,并分析HBV cccDNA与松弛环状DNA(rcDNA)RT区耐药位点及耐药突变率的差异. 方法利用滚环扩增法(RCA)同时扩增20例慢性乙型肝炎患者肝组织中HBVcccDNA和HBV载量为108拷贝/ml血清中的rcDNA,再以该扩增产物为模板,以跨缺口引物扩增HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区;巢式PCR直接扩增同一患者血清中HBV rcDNA RT区.HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区扩增片段经测序后采用Vector NTI Suite8.0及chromaslite201分析其耐药突变位点;采用x2检验比较rcDNA和cccDNA RT区的耐药突变率. 结果以RCA产物为模板用跨缺口引物成功扩增并获得肝组织cccDNA RT区片段,阴性对照组及HBV载量为108拷贝/ml血清rcDNA组均无扩增产物;巢式PCR.直接扩增获得同一患者血清中HBV rcDNART区片段.序列测定结果显示,本组试验中10例有抗病毒史的慢性乙型肝炎患者发生rcDNA RT区耐药者有6例,突变率为60%,1例发生cccDNA RT区突变,突变率为10%,两者比较,P=0.019,差异有统计学意义.10例无抗病毒史的慢性乙型肝炎患者有2例发生rcDNA耐药,耐药突变率为20%,1例发生cccDNA耐药突变,突变率为10%,两者比较,P=0.531,差异无统计学意义.产生耐药突变的患者其cccDNA与rcDNA RT区耐药突变位点均不相同.结论 RCA可用于HBV cccDNA RT区耐药突变位点检测;有抗病毒史的患者的rcDNA与cccDNA RT区耐药突变不同步.在辅助临床治疗中,对HBV cccDNA进行耐药监测比对HBV rcDNA耐药监测更有意义.     

乙型肝炎核心相关抗原对慢性乙型肝炎患者拉米夫定耐药的预测作用

目的评价乙型肝炎核心相关抗原（HBcrAg）对慢性乙型肝炎患者拉米夫定（LAM）耐药的预测作用。方法收集2009年1月至2011年12月期间住院和门诊收治的43例慢性乙型肝炎初治患者,拉米夫定治疗≥6个月,随访≥6个月,根据随访期间HBV DNA测序结果分为耐药组2l例,非耐药组22例。分别检测各研究节点ALT、HBsAg、HBeAg、HBcrAg、HBV DNA水平。计量资料两组问比较采用独立样本t检验,方差不齐采用Mann—Whitney U检验;计数资料采用卡方检验。相关性分析采用Spearman分析。影响因素采用Logistic回归分析。结果LAM抗病毒前HBcrAg与HBV DNA水平有较好的一致性,Spearman相关系数为0．863（P〈0．001）。LAM抗病毒治疗后,外周血HBcrAg与HBV DNA水平均有所下降,但HBcrAg下降速度与幅度均低于HBV DNA。Logistic回归分析显示,随访结束时HBcrAg水平可能为LAM耐药的影响因素（P〈0．01）。HBcrAg对LAM耐药预测价值较高,ROC曲线下面积为0．872（P〈0．001）。结论LAM抗病毒前外周血HBcrAg与HBV DNA有较好的一致性,随访结束时HB—crAg水平可较好的预测LAM耐药。     

Low rate of YMDD motif mutations in polymerase gene of hepatitis B virus in chronically infected patients not treated with lamivudine

Background Lamivudine is used for the treatment of chronic hepatitis B (CH-B), and exhibits excellent antiviral activity. However, longterm administration increases the likelihood of the emergence of resistant viruses, with an accompanying relapse of hepatitis. However, recent studies have reported lamivudine-resistant viruses in patients with CH-B before such treatment. The aim of this study was to investigate whether YMDD mutants occur in nature.Methods The existence of lamivudine-resistant viruses was examined in 20 asymptomatic carriers of hepatitis B virus (ASC), 10 patients who lost hepatitis B surface antigen (HBsAg) during follow-up and in 20 lamivudine-treated patients with and without breakthrough hepatitis. Both polymerase chain reaction (PCR) restriction fragment length polymorphism and SMITEST hepatitis B virus (HBV)-YMDD mutation detection methods were used to detect resistant viruses.Results No YMDD mutants were detected in the sera of the 20 ASC at the initial and final medical examinations, nor were YMDD mutants detected in sera collected at the initial medical examination, about 6 months before, or immediately after the loss of HBsAg in the 10 patients. In the 20 patients treated with lamivudine, YMDD mutants were not detected in any of them before treatment, whereas mutants were detected in the sera of 10 patients during treatment.Conclusions Our results suggest that lamivudine-resistant YMDD mutant viruses were present in a few patients with HBV infection who before they have been treated with lamivudine.