HPV16E6真核表达载体的构建及其在CaSki细胞中的表达及定位

目的:构建pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,转染CaSki细胞,检测其在CaSki细胞中的表达。方法:用RT-PCR法从CaSki细胞中扩增出带有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点的HPV16E6基因片段,将HPV16E6基因全长片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上,通过脂质体将pEGFP-C2-HPV16E6转染入CaSki细胞。结果:pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体构建成功,转染CaSki细胞48h后经RT-PCR及Western-blot检测可见HPV16E6蛋白的高表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白主要在CaSki细胞核内表达。结论:成功构建了pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,为进一步对HPV16E6的研究奠定了基础。     

Dectin-1融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Dectin-1融合蛋白真核表达质粒并进行真核表达初步研究.方法 运用RT-PCR技术扩增小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因的细胞外碳水化合物识别域(CRD),与真核表达载体pSecTag2C进行双酶切之后进行连接反应,构建重组融合表达载体,转染入293细胞中,目的 蛋白在细胞培养基中分泌表达,表达产物经蛋白浓缩、纯化后经SDS-PAGE、Western印迹鉴定.结果 获得重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,测序结果 证明质粒DNA序列完全正确,并在转染入293细胞后检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,为进一步纯化蛋白研究真菌检测方法 及Dectin-1与真菌相互作用机制、功能等奠定了基础.     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

HBV核心抗原EGFP融合蛋白表达质粒的构建及在Hep G2细胞中的表达

目的探讨采用构建的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白的可行性.方法克隆HBV核心抗原基因进入真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体法转染HepG2细胞后在荧光显微镜下观察增强型绿荧光蛋白表达,并行RT-PCR及细胞免疫组化分析融合蛋白的表达.结果重组pHBc-EGFP质粒可在HepG2细胞内瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白融合蛋白.结论pHBc-EGFP质粒构建成功,增强型绿荧光蛋白的表达可报告HBV核心抗原表达.     

HSV 2多功能蛋白ICP27真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

目的构建单纯疱疹病毒2型（HSV 2） 多功能蛋白感染细胞多肽27（ICP27）真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并检测其在非洲绿猴肾细胞（Vero）中的表达。方法提取病毒株HSV 2333 DNA,用高保真DNA聚合酶对多功能蛋白ICP27基因进行高保真扩增,用双酶切连接至真核表达载体pCDNA3.0中。pCDNA3.0 ICP27经双酶切、测序验证,并通过脂质体介导质粒瞬时转染Vero 细胞,经RT PCR和Western blot检测ICP27蛋白的表达。结果pCDNA3.0 ICP27经双酶切可切出目的片段,测序结果经比对,与基因库中的序列完全一致。转染后经RT PCR 和Western blot检测,证实转染重组质粒组有ICP27蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到ICP27的表达。结论成功构建了HSV 2 多功能蛋白ICP27真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并能在Vero 细胞中表达。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型ICP22真核表达载体的构建及其对Vero细胞活性的影响

目的构建单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染细胞蛋白22(ICP22)真核表达载体p EGFP-C2/ICP22并研究其对非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞活性的影响。方法经双酶切实验和测序验证,以Xfect为介导将构建的真核表达载体p EGFP-ICP22转染至Vero细胞,并通过反转录PCR(RT-PCR)和绿色荧光检验其在细胞中的表达,最后以MTT法检测细胞活性。结果 48 h后观察,发现转染重组质粒组细胞经RT-PCR验证有目的基因的转录,并通过荧光显微镜观察到融合蛋白表达。而空白质粒组只检测到荧光蛋白但未检测到目的基因转录本,且对照组未检测到荧光蛋白表达。转染重组质粒的细胞相对活性值为(82.39±6.44)%。结论成功构建了p EGFP-ICP22真核表达载体,实现了其在Vero中的表达,融合蛋白GFP-ICP22明显降低了细胞活性。为进一步探讨HSV-ⅡICP22的功能和HSV-Ⅱ潜伏复发机制奠定了实验基础。     

小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

通用型10-23脱氧核酶表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达

[目的]构建一种新型10-23脱氧核酶(Deoxyribozyme,DRz)的真核表达载体,并鉴定其在细胞内表达10-23DRz的能力. [方法]设计一条包含莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MLV-RT)引物结合序列、多克隆酶切位点及逆转录终止信号序列的寡脱氧核糖核苷酸ODN-PSL,并将其插入框架质粒pBUDCE4.1中PCMV的下游,获取重组质粒pBUD-PSL.通过二步亚克隆将MLV-RT的编码基因克隆至pBUD-PSL中另一启动子PEF-1α的下游,获取重组质粒pS-DE01.将pSDE01转染入巨噬细胞RAW264.7中,RT-PCR法鉴定MLV-RT的表达及逆转录酶活性.设计一taco基因特异性的10-23DRz-DZ1,并将其表达序列克隆入pSDE01中,获取重组表达载体pSDE01-DZ1.将pSDE01-DZ1转染入巨噬细胞RAW264.7中,分别经PCR和斑点杂交法检测DZ1在细胞内的表达. [结果]限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功,将其转染入巨噬细胞RAW264.7后检测到了MLV-RT的表达,而且表达产物具有逆转录酶活性.pSDE01-DZ1转染入RAW264.7细胞后,经PCR和点杂交方法均检测到了DZ1的表达. [结论]成功构建了一种操作简便的通用型10-23DRz表达载体,该载体可在真核细胞内有效表达特异性10-23 DRz.     

小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Western blot）法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot 结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

HCV NS3解旋酶基因原核表达载体pGEX-4T-1的构建

[目的]构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3解旋酶基因原核表达载体,为进一步研究和解析NS3的解旋酶基因对病毒复制的机制准备条件.[方法]将含有NS3基因的pMD-24/HCV NS3质粒转化感受态菌DH-5α并扩增;提取pMD-24/HCV NS3质粒;从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出NS3解旋酶基因;并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与表达载体pGEX-4T-1重组,以得到重组的原核表达载体pGEX-4T-1/NS3解旋酶.[结果]从pMD-24/HCV NS3质粒中扩增出的NS3解旋酶基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列:电泳结果证明已将此片段克隆到pGEX-4T-1内.[结论]成功地构建了HCV NS3解旋酶基因的原核表达载体DGEX-4T-1/NS3解旋酶.     

GFP-hDaxx融合蛋白在巨噬细胞中的表达与定位

目的：构建GFP—hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP／hDaxx并在巨噬细胞中表达，为研究hDaxx对巨噬细胞凋亡及分泌活性的影响提供实验基础。方法：将hDaxx cDNA片段亚克隆入载体pEGFP，构建GFP—hDaxx融合蛋白真核表达载体。将质粒pEGFP/hDaxx转染巨噬细胞，Western blotting鉴定表达产物，荧光显微镜观察GFP—hDaxx融合蛋白在细胞内的表达与定位。结果：成功构建了GFP—hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP／hDaxx，GFP—hDaxx融合蛋白在巨噬细胞中表达并定位于细胞核。结论：pEGFP／hDaxx在巨噬细胞中即时高表达GFP—hDaxx融合蛋白并定位细胞核。     

pEGFP-C3/Tsarg1融合蛋白在GC-1 spg细胞中的表达与定位

目的构建pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体并在GC-1spg细胞中表达,为研究Tsarg1在生精过程中的机制提供实验基础。方法应用RT-PCR从大鼠睾丸中扩增Tsarg1的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到T载体中测序验证。随后,将Tsarg1cDNA片段亚克隆入载体pEGFP-C3,筛选阳性克隆,构建pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体。脂质体介导重组体pEGFP-C3/Tsarg1转染GC-1spg细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位。结果成功构建了pEGFP-C3/Tsarg1真核表达质粒,EGFP-Tsarg1融合蛋白能够在GC-1spg细胞中表达,Tsarg1蛋白定位于细胞胞浆。结论 pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体的成功构建及带GFP标签的Tsarg1融合蛋白在GC-1spg细胞中的成功表达为进一步研究Tsarg1的生物学功能奠定了基础。     

GFP-MOMP融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的 构建GFP-MOMP融合蛋白真核表达重组质粒pEGFP／MOMP，利用脂质体体外转染Heb细胞，观察MOIMP在真核细胞中的表达。方法 PCR法从D型Ct基因组中扩增MOMP全长基因，克隆至pEGFP真核表达载体的相应位点，进行序列分析和酶切鉴定后，脂质体介导重组体pEGFP／MOMP转染Heb细胞，荧光显微镜、Western blot鉴定MOMP基因的表达。结果 PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMID基因片段；成功的构建真核表达重组体pEGFP／MOMP；重组质粒pEGFP／MOMP在HeLa表达出约71kDa大小的融合蛋白。结论 GFP-MOMP能够在体外真核细胞中表达，为进一步研究该蛋白的生物学功能及核酸疫苗的制备提供实验依据。     

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的 构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达。方法 PCR扩增M-CSF基因，定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体，构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，脂质体介导将pEGFP-CSF转染人NH3T3细胞，以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白，RT-PCR检测结果显示RT～PCR扩增产物与M～CSF目的基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的。nRNA。结论 真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达，为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础。     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp92真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的 以梅毒螺旋体(Trepondmapallidum，Tp)外膜蛋白基因Tp92为目的基因，构建Tp真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，并鉴定其在Hela细胞能否正确表达，为进一步开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 应用PCR技术从TpNichols株基因组模板中扩增Tp92基因，定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，脂质体介导将pcDNA3．1( )-Tp92转染入Hela细胞，以免疫酶标法和一步法RT～PCR检测pcDNA3．1( )Tp92在Hela细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建Tp真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，DNA测序显示重组质粒含有2103bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较，载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Tp92基因序列完全一致，同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为95．5％～100％，证实本研究所得到的基因为所需基因，同时也表明该基因为Tp的保守性基因。免疫酶标法结果显示该重组体在Hela细胞能有效表达目的蛋白与梅毒阳性标准血清中相应抗体反应；RT-PCR检测结果显示RT-PCR扩增产物与Tp92基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的mRNA。结论 TD真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92的成功构建及在体外真核细胞中的有效表达，为进一步研制梅毒DNA疫苗及其生物学功能的研究奠定了一定的实验基础。     

肿瘤相关蛋白亚细胞结构定位的研究

目的应用激光共聚焦显微镜技术对肺癌相关蛋白N35进行亚细胞定位，观察它们在肿瘤细胞中的分布和肿瘤细胞周期不同时期的变化，并与其它组织和肿瘤进行比较，了解其特异性。方法利用抗人肺癌单克隆抗体N-35作为免疫探针作免疫荧光标记，应用激光共聚焦技术观察肿瘤相关蛋白亚细胞结构的定位，测定其相关抗原在肺癌细胞系GLC-82、人淋巴细胞系、人胚肺二倍体细胞系（KMB-17）、人皮肤纤维细胞系的存在及分布情况以及在肿瘤细胞周期不周时期的变化。结果肿瘤相关蛋白N35不存在于正常人淋巴细胞、正常肺细胞及人皮肤纤维细胞中，而存在于肺癌细胞蛋白中，在亚细胞结构中主要分布于胞核，在肿瘤细胞有丝分裂进入G2至M期时明确地定位于中心粒（centriole）结构上。结论肿瘤相关蛋白N35可能是一种只存在于肿瘤细胞并与其增殖活动密切相关的重要的肿瘤细胞生长调节蛋白，其功能可能与肿瘤细胞无限制增殖活动有关，是肿瘤标志物之一。可用于临床肿瘤的早期诊断、疗效评估、监测复发、预测转移和推测预后。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

沙眼衣原体ompA基因真核表达载体的构建及在HeLa细胞中的表达

目的　构建沙眼衣原体 (Ct)ompA基因真核表达重组质粒 ,利用脂质体体外转染HeLa细胞 ,为核酸疫苗的研制作准备。　方法　应用PCR技术从D型Ct基因组中扩增ompA全长基因 ,重组入 pUCm -T克隆载体。将pUCm -T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应 ,亚克隆入 pcDNA3 .1真核表达载体的相应位点 ,进行序列分析和酶切鉴定后 ,运用脂质体将重组体 pcDNA3 .1/ompA转染HeLa细胞 ,免疫组化法观察目的基因的表达。　 结果　PCR扩增得到约 1.2kb的特异性ompA基因片段 ;序列测定证实与发布序列一致 ;构建得到真核表达重组体 ;重组质粒pcDNA3 .1/ompA在HeLa表达MOMP。　结论　CtompA基因能够在体外真核细胞中表达 ,为进一步研究CtDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。