重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测 日本血吸虫感染性钉螺

目的　建立重组酶介导的核酸等温扩增荧光（Recombinase aided amplification,RAA）法快速检测日本血吸虫感染性钉螺技术,并探索钉螺样品的最佳处理方式。方法　将钉螺样本分成3组,每组均含7个亚组,其中6个亚组分别为50只阴性钉螺中混合1、2、3、4、5、10只日本血吸虫感染性钉螺,1个亚组为100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺。3组钉螺分别采用压碎去壳核酸试剂盒提取法、压碎去壳核酸粗提法和直接压碎带壳核酸粗提法进行处理,并分别进行荧光RAA与PCR法检测,对检测结果进行比较。结果　建立了荧光RAA检测技术,工作温度为39 ℃,30 min内即可完成日本血吸虫感染性钉螺检测。钉螺群体样本采用压碎去壳核酸试剂盒提取法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺;采用压碎去壳核酸粗提法处理后, 荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合3只感染性钉螺;采用直接压碎带壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺,PCR法仅可检测出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺。结论　成功建立了钉螺群体样本中日本血吸虫感染性钉螺快速检测的荧光RAA法,该方法具有快速、灵敏、操作简便等特点;压碎去壳核酸粗提法为钉螺样品的最优处理方式。     

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能评价

目的 评价重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)荧光法检测日本血吸虫感染性钉螺的效能.方法 采用群体法检测.每50只钉螺作为1个检测样本,阴性样本不含感染性钉螺,阳性样本含不同数量感染性钉螺.设置阴性样本10个和分别含有1、2、3只感染性钉螺的阳性样本各10个...     

重组酶介导核酸等温扩增荧光法用于日本血吸虫感染性钉螺早期检测的研究北大核心CSCD

目的探索重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)荧光法用于日本血吸虫感染性钉螺早期检测的可行性。方法用日本血吸虫毛蚴人工感染200只湖北钉螺,随机分为阳性对照组和实验组各100只,另取100只未感染钉螺作为阴性对照组。将阳性对照组钉螺饲养至70 d,通过逸蚴法观察感染情况并计算阳性率。实验组钉螺分别在3 h以及5、20、40、70 d随机取20只,压碎镜检,同时提取钉螺软体DNA,进行荧光RAA法检测,获得不同时间点的阳性率,并与阳性对照组相比较。通过二代测序法对RAA检测阳性的特异性扩增产物进行测序鉴定。结果毛蚴感染后3 h、5 d、20 d、40 d、70 d实验组钉螺RAA法检测阳性率分别为60%、60%、65%、60%、70%,压碎镜检的阳性率分别为0、0、0、15%、65%,除70 d外其余时间点两种检测方法的阳性率差异均有统计学(χ^2=17.14,χ^2=17.14,χ^220 d=19.26,χ^2=8.64,均P<0.01);各时间点间阳性率差异无统计学意义(χ^2=0.68,P>0.05),各时间点阳性率与阳性对照组阳性率64.6%比较差异均无统计学意义。RAA扩增产物经二代测序后与数据库比对,确认为血吸虫特异性基因片段。结论 RAA荧光法敏感、特异,可用于日本血吸虫感染性钉螺的早期检测。     

基于重组酶介导核酸等温扩增技术的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法的建立

目的　结合重组酶介导核酸等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay,RAA）和核酸试纸条建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法　以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,设计并合成引物、荧光探针,建立日本血吸虫核酸试纸条检测方法。通过检测不同拷贝数的含SjG28基因片段的重组质粒和不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA,对该方法敏感性进行评价;通过检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA,对该方法特异性进行评价。结果　以重组质粒为模板,建立的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法最低检测限为10拷贝/μL;以成虫基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μL。该方法检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论　本研究结合RAA技术和核酸试纸条建立了一种可快速、简便、可视化检测日本血吸虫特异性基因片段的核酸试纸条法。     

重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立

目的 建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（RAA）。方法 以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应（PCR）同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性。结果 建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成。以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL。建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。结论 本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。     

浙江开化县应用LAMP技术检测感染性钉螺的效果分析

目的 对环介导等温扩增（ｌｏｏｐ － ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ,ＬＡＭＰ） 技术检测感染性钉螺的条件进行优化,并评估其在浙江开化县感染性钉螺检测的应用。 方法 优化 ＬＡＭＰ 反应条件,建立基于ＬＡＭＰ 方法的血吸虫感染性钉螺的检测方法,并用于开化县的钉螺监测。 对传统压碎镜检法与 ＬＡＭＰ 法进行比较。 结果 引物 ０２ － ＳｊＲ２８ 为最优引物、６５℃ 为最优反应温度、７． ８ ｍＭ 为最优 Ｍｇ２ ＋ 浓度。 ＬＡＭＰ 技术检测结果与压碎镜检法鉴定结果完全相符;ＬＡＭＰ 法与压碎镜检法相比,结果观察方便,定性可靠,大规模筛查快速,但存在费用高,少量钉螺检测试验耗时长,设备携带不方便,专业要求高,定量有缺陷等不足。 结论开化县建立 ＬＡＭＰ 方法用于感染性钉螺的检测,是一种有效、能切实在防治工作中应用的血吸虫病防治检测手段,目前适用于大规模实验室筛查。     

新型等温扩增技术推动寄生虫病现场快速检测能力提升

随着分子生物学的快速发展,等温扩增技术凭借其高效、快速和简便等优势,现已开始应用于寄生虫病病原核酸检测,并成为推进寄生虫病现场检测和防控工作的重要手段.新型等温核酸扩增方法——重组酶介导的等温扩增技术(Recombinaseaided isothermal amplification assay)可在等温条件下(一般为...     

重组酶介导的斯氏并殖吸虫等温扩增荧光检测方法的建立及检测效果初步评价

目的 建立一种基于重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification,RAA)技术的斯氏并殖吸虫快速核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价.方法 从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,提取基因组DNA进行分子鉴定.以斯氏并殖吸虫线粒体...     

快速检测田鼠巴贝西虫重组酶介导核酸等温扩增方法的建立北大核心CSCD

目的 建立快速检测田鼠巴贝西虫的重组酶介导核酸等温扩增方法(RAA)。方法 选取田鼠巴贝西虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cox I)序列,设计检测田鼠巴贝西虫的通用引物,并对引物进行筛选和特异性检测,建立并优化田鼠巴贝西虫的重组酶介导核酸等温扩增体系。分别采用重组质粒和田鼠巴贝西虫成虫DNA为模板测试方法的灵敏度;利用其他种类寄生虫DNA,包括输血传播寄生虫评估该方法的特异性并对42例外籍献血者进行田鼠巴贝西虫筛查。结果 筛选出1组扩增效果良好的引物。RAA反应过程在37℃20 min完成,最低可扩增浓度为10^(-1)copies/μL的重组质粒和浓度为10^(-3)ng/μL的田鼠巴贝西虫基因组。RAA方法具有良好的特异性,与其他寄生虫无交叉阳性反应。应用RAA方法检测42例外籍献血者标本均为阴性。结论 成功建立了一种敏感、特异的检测田鼠巴贝西虫的RAA法,该方法可用于献血者血液筛查时的快速检测以及田野调查时大规模样品检测。     

中国大陆湖北钉螺种下分化研究进展

湖北钉螺是日本血吸虫的惟一中间宿主,在日本血吸虫病传播过程中起重要作用,其种下分化及鉴别在血吸虫病防治、钉螺控制等方面具有重要意义。本文基于形态学、细胞生物学、分子生物学等方面证据综述了湖北钉螺种下分化的研究进展,并对今后的研究方向提出了建议。     

目平外睾吸虫日本血吸虫不同间隔时间双重感染湖北钉螺螺体血淋巴细胞存在情况的比较

目的 外睾吸虫与日本血吸虫双重感染湖北钉螺,后进入螺体的血吸虫幼虫全部被击毁,双重感染间隔时间愈长,血吸虫幼虫被击毁的效力愈强烈.为要了解钉螺血淋巴细胞在所有螺体存在及进入血吸虫幼虫体内情况是否相同,开展了本实验观察.方法与结果 共检查双重感染间隔时间21d、37d、55 d、70 d、85d5组不同时龄的血吸虫幼虫50条.50条血吸虫幼虫周围螺组织大中小3种血淋巴细胞总数:大1 43粒、中386粒、小219粒;血吸虫幼虫体内3种血淋巴细胞总数:大40粒、中65粒、小60粒;两者总数:大183粒、中451粒、小279粒;每条血吸虫幼虫体及其周围的平均数为:大3.7粒、中9粒、小5.6粒.5组每种血淋巴细胞平均数及百分比情况如下:间隔21d:9(45％)、15.9(35％)、7.4(27％);间隔37 d:4.1(21％)、11(24％)、7.8(29％);间隔55d:3.6(18％)、8.6(18％)、5.2(1 9％);间隔70 d:2(10％)、7.9(17％)、3.4(1 3％);间隔85 d:1.2(6％)、2.9(6％)、3.1(11％).结论 显示间隔时间愈长,大中小3种血淋巴细胞数均逐步下降.     

湖北钉螺被目平外睾吸虫与日本血吸虫不同间隔时间感染后分泌物的检测与分析

观察被目平外睾吸虫和日本血吸虫双重感染钉螺后钉螺体内外分泌物及其血吸虫幼虫被击毁的关系。方法 观察钉螺感染外睾吸虫21 d、37 d、55 d、70 d和85 d后再感染血吸虫,经482 d后,取钉螺软体组织作埋蜡连续染色制片。结果与结论 无论单独感染目平外睾吸虫或两种吸虫双重感染,均可在螺软体发现多种分泌物,随时间延长分泌物数量逐渐增多。螺体内含小细胞核的分泌物和螺副腺细胞都出现在各时期的血吸虫残骸体内。     

重视羊血吸虫病防治 推进我国消除血吸虫病进程

虽然我国血吸虫病防治工作已取得举世瞩目的成就,但日本血吸虫病仍是我国重要的公共卫生问题之一。日本血吸虫可自然感染四十余种哺乳动物。自2004年以来,我国实施了以传染源控制为主的血吸虫病综合防治策略,并将牛作为重点防控对象,重点实施了家畜圈养、封洲禁牧、以机代牛、安全牧场以及对感染牛化疗等控制措施,取得了显著成效,流行区人和牛血吸虫感染率以及感染性钉螺面积均已降至历史最低水平,全国血吸虫病防治进程正由传播控制向传播阻断乃至消除迈进。羊是血吸虫易感动物之一,既往流行病学资料显示部分流行区羊血吸虫感染率较高。但羊作为日本血吸虫病主要传染源在疾病传播过程中的作用尚未得到足够重视,且目前尚缺乏有关羊在我国日本血吸虫病传播中作用的专项调查和系统研究。江苏省血吸虫病防治研究所梁幼生研究员课题组通过实验室研究和现场调查,对羊在日本血吸虫病传播中的作用进行了系统研究。课题组对日本血吸虫在山羊体内的发育与繁殖（产卵）、羊粪对环境的污染、温度和湿度对羊粪中血吸虫虫卵存活的影响等进行了观察和调查,进一步明确了羊在日本血吸虫病传播中的作用,并结合既往研究成果,提出羊是我国日本血吸虫病重要传染源之一,有必要将羊日本血吸虫病综合治理纳入国家层面的防控规划。课题组还对羊血吸虫感染粪便孵化技术进行了改进,优化了羊血吸虫病病原诊断技术。这些创新性研究工作填补了国内在羊日本血吸虫病研究领域的一些空白,研究成果将丰富我国以传染源控制为主的血吸虫病综合防治策略,在我国消除血吸虫病进程中发挥应有的作用。鉴于血吸虫病流行会严重影响流行区养羊业发展和当地农民收入,且羊已经成为部分流行区血吸虫病传播重要的传染源之一,做好羊血吸虫病防控工作有助于推进我国消除血吸虫病进程。建议重点做好以下两方面工作：① 重视羊血吸虫病防控工作,将羊血吸虫病综合治理纳入国家层面的防控规划; ② 研发适用于羊血吸虫病防控的技术、产品和措施。     

迈向血吸虫病消除阶段的钉螺控制策略

钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主,钉螺控制是血吸虫病防治的重要措施之一。随着防治进程推进,我国血吸虫病呈低水平流行状态,但钉螺孳生和血吸虫病传播风险依然严峻。在新时期血吸虫病防治目标和环境保护等要求下,在钉螺控制中引入精准识别、精准干预和精准评价,巩固现有防治成效,将有助于推进我国消除血吸虫病进程。     

日本血吸虫幼虫在钉螺及感染外睾吸虫钉螺发育的比较

湖北钉螺先感染外睾吸虫后再感染日本血吸虫,血吸虫幼虫在其体内被击杀(唐崇惕等,2008;2009),本文用日本血吸虫毛蚴分别接触已感染外睾吸虫21d的钉螺和阴性钉螺,观察血吸虫幼虫在此2组实验钉螺体内发育情况。从感染外睾吸虫钉螺再感染血吸虫的28个(73.7%)阳性螺,查获4～82d血吸虫幼虫共300条(侵入率26.74%),全部虫体结构异常停留在早期母胞蚴阶段。从单独感染血吸虫的25粒(69.4%)阳性螺,查获5～61d正常血吸虫母胞蚴67条(侵入率13.96%)和许多不同发育期子胞蚴,感染后75d阳性螺含血吸虫成熟子胞蚴和尾蚴。单独感染血吸虫钉螺的血淋巴细胞增生情况与双重感染外睾吸虫和血吸虫的钉螺存在差异。     

1989～2009年广西玉林市血吸虫病监测及控制措施

目的总结和分析玉林市1989-2009年血吸虫病慌测结果,评价监测措施,为传播阻断后期血防成果巩固提供科学依据。方法回顾性收集并分析1989～2009年玉林市血吸虫病传播阻断达标后的监测和控制资料。结果21年间在原有螺区查螺1475．239hm^2．查出螺点2个．钉螺面积0．43hm2;毗邻螺区共查螺2024．865hm^2,未发现钉螺．灭螺15次．共计3．283hm^2;疫区居民血吸虫皮试阳性率为0．81％（72／8844）,血清学阳性率为0．35％（11／3171）;粪检1614人,未发现阳性;解剖野鼠4957只、家犬44条,粪检耕牛3923头,均未发现血吸虫虫卵阳性。结论玉林市维持在血吸虫病传播阻断状态．但螺情监测工作仍存在薄弱环节,需进一步加强．     

1989～2009年广西玉林市血吸虫病监测及控制措施

目的总结和分析玉林市1989-2009年血吸虫病慌测结果,评价监测措施,为传播阻断后期血防成果巩固提供科学依据。方法回顾性收集并分析1989～2009年玉林市血吸虫病传播阻断达标后的监测和控制资料。结果21年间在原有螺区查螺1475．239hm^2．查出螺点2个．钉螺面积0．43hm2;毗邻螺区共查螺2024．865hm^2,未发现钉螺．灭螺15次．共计3．283hm^2;疫区居民血吸虫皮试阳性率为0．81％（72／8844）,血清学阳性率为0．35％（11／3171）;粪检1614人,未发现阳性;解剖野鼠4957只、家犬44条,粪检耕牛3923头,均未发现血吸虫虫卵阳性。结论玉林市维持在血吸虫病传播阻断状态．但螺情监测工作仍存在薄弱环节,需进一步加强．