嗅成鞘细胞提取液对阿尔茨海默病脑移植的影响

目的　探讨嗅成鞘细胞提取液对胆碱能神经元移植治疗阿尔茨海默病大鼠的影响。方法　SD大鼠双侧海马注射Aβ1－40，建立AD大鼠模型。实验动物分为4组：正常对照组、空白对照组、人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组，每组８只。运用行为学测试、NADPH-d组化、刚果红组织学染色结合积分吸光度测定等技术，观察、比较各组AD模型大鼠移植2个月后学习记忆能力、一氧化氮合酶阳性神经元数以及老年斑的变化。结果　①行为学测试：人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组大鼠达到学会标准所需TN、EN、D、TRT少和短于空白对照组(P<0.05)；以OECs提取液移植组更为显著(P<0.05)。②NADPH-d组化反应：人工脑脊液移植组、OECs提取液移植组NOS阳性神经元数较空白对照组明显增多(P<0.05)，且前两组之间差异有显著性 (P<0.05)。③刚果红染色：移植组及空白对照组三组间差异均有显著性 (P<0.05)，以OECs提取液移植组SP-IA值最小。结论　嗅成鞘细胞提取液能明显提高胆碱能神经元移植治疗阿尔茨海默病大鼠的效果。     

嗅成鞘细胞提取液脑室内注射对大鼠阿尔茨海默病的治疗作用

目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)提取液脑室内注射对大鼠阿尔茨海默病的治疗作用.方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1-40,建立AD大鼠模型.实验动物分为4组:正常对照组、AD模型组、人工脑脊液注射组、OECs提取液注射组,每组8只.运用行为学测试、NADPH-d组化、刚果红组织学染色结合积分吸光度测定等技术.观察、比较各组AD模型大鼠注射4周后学习记忆能力、一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元数以及老年斑的变化.结果 ①行为学测试:OECs提取液注射组大鼠达到学会标准所需训练次数(TN)、错误反应次数(EN)、潜伏期(D)、全天总反应时间(TRT)分别为(18.82±2.64)次、(4.81±1.85)次、(5.18±4.86)s、(1236.78±97.26)s,均明显少于和短于AD模型组[(48.33±5.10)次、(10.83±2.98)次、(11.32±12.23)s、(2264.32±244.60)s(P=0.000)].②NADPH-d组化反应:OECs提取液注射组NOS阳性神经元数为(16.08±2.51)个/视野,比AD模型组(5.08±0.89)个/视野明显增多(P=0.000).③刚果红染色及其吸光度(SP-IA)测定:OECs提取液注射组为(74.39±9.14),比AD模型组(481.15±144.18)明显减少(P=0.000).④人工脑脊液注射组与AD模型组间上述指标均差异无显著性.结论 嗅成鞘细胞提取液脑室内注射对大鼠阿尔茨海默病具有明显的治疗作用.     

嗅鞘细胞移植后脊髓半横断大鼠睫状神经营养因子和FGF-2表达的变化

目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植到损伤的脊髓后,能否分泌睫状神经营养因子(CNTF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2),以及能否引起脊髓组织内CNTF和FGF-2表达的变化及脊髓的细胞有何数量改变.方法:体外分离培养大鼠嗅球嗅鞘细胞,通过免疫荧光细胞化学染色检测其CNTF和FGF.2的表达.将嗅鞘细胞移植入脊髓半横断SD大鼠,观察术后7天和21天嗅鞘细胞在脊髓内的存活情况,并对脊髓组织切片进行CNTF和FGF-2免疫荧光组织化学染色,计数阳性细胞并计算阳性面积百分比.结果:嗅鞘细胞在体外培养和移植后都能表达CNTF和FGF-2.同未移植组对比,移植组脊髓CNTF和FGF-2表达明显增强(P<0.05),神经元和少突胶质细胞数量增加(P<0.05),星型胶质细胞数量无明显改变.结论:嗅鞘细胞移植入损伤的脊髓后能分泌CNTF和FGF-2,并使脊髓组织内CNTF和FGF-2的表达增加,引起神经元和少突胶质细胞数量增加.     

嗅鞘细胞移植治疗帕金森病动物模型的相关研究

目的 利用大鼠同种异体嗅鞘细胞移植的方式对帕金森病模型大鼠进行治疗,初步探究在PD模型大鼠脑内移植嗅鞘细胞能否成为治疗帕金森病的一种有效手段。方法 提取和培养原代OECs,利用6-OHDA两点注射法建立帕金森病动物模型,通过APO诱导方式验证模型及检测治疗效果,通过HE染色进行大鼠黑质细胞形态学观察,利用抗TH荧光染色细胞计数对比治疗前后TH阳性神经元表达情况差异。结果 从嗅鞘细胞移植后的第4周开始,PD模型的行为学诱导旋转圈数明显减少。HE染色结果示:PD模型大鼠毁损侧的黑质致密部的神经元变性明显,且TH阳性神经元数量降低,经OECs治疗后的帕金森大鼠的患侧黑质部位神经元变性改善,且TH阳性神经元含量明显增高。结论 嗅鞘细胞能够改善帕金森模型大鼠的行为学变化。嗅鞘细胞能够提高帕金森模型大鼠患侧黑质部位多巴胺神经元含量。     

嗅鞘细胞移植对脊髓前角神经元保护作用的实验研究

目的 观察嗅鞘细胞(OECs)脊髓内移植对坐骨神经损伤后脊髓前角运动神经元的作用.方法 将培养、纯化OECs采用倒置相差显微镜、细胞免疫组织化学染色观察并计算纯度.48只大鼠坐骨神经夹伤后随机分为OECs实验组与生理盐水组.通过尼氏染色计数并计算运动神经元的存活百分率,观察神经元的超微结构.结果 神经生长因子受体p75...     

嗅鞘细胞移植促进脑损伤大鼠神经功能恢复及其作用机制研究

目的 观察嗅鞘细胞移植对脑损伤大鼠神经功能恢复及神经元存活的影响并探讨其作用机制.方法 对经培养纯化的嗅鞘细胞作NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定并制备移植用细胞悬液,部分细胞预作荧光标记用于移植后观察存活情况;24只SD大鼠平均分成3组:假手术无损伤组(A组),大鼠脑皮质运动区损伤组(B组),相同脑损伤后嗅鞘细胞移植组(C组);术后当天及第3,7,14天分别对各组动物进行神经功能缺损严重程度(NSS)评分;术后第14天取损伤部位组织作神经元核心抗原免疫组化(NeuN)检测并计数阳性细胞数量;数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析.结果 (1)培养的嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性,阳性率90%;(2)移植14d后核荧光标记的嗅鞘细胞在宿主体内存活良好;(3)术后第14天B组NSS评分为[(2.00±0.53)分],C组为[(1.25±0.46)分],明显优于B组(P<0.05);(4)NeuN阳性细胞计数B组为[(39.2±7.1)分],C组为[(45.8±6.0)分],明显优于B组(P<0.05).结论 嗅鞘细胞移植可明显促进脑损伤大鼠神经功能恢复,其机制可能与嗅鞘细胞促进宿主神经元存活有关.     

双侧内嗅皮质注射β淀粉样蛋白对大鼠学习记忆能力的影响及局部病理改变

目的 观察β淀粉样蛋白(Aβ)的在体神经毒作用及其对大鼠学习记忆能力的影响.方法 将聚集态Aβ微量注射于大鼠双侧内嗅皮质(EC),对照组注射生理盐水(NS),术后第7,8天采用Y-迷宫进行行为学测试,测试后处死动物取材,分别采用尼氏染色、HE染色、刚果红染色观察EC的病理改变.结果 NS组大鼠获得记忆和再现记忆累积尝试次数分别是(19.17±5.58)次、(10.56±1.72)次,AB组大鼠获得记忆和再现记忆尝试次数分别是(31.13±6.98)次、(18.47±4.64)次,组间差异有显著性(P<0.01);Aβ组注射区刚果红染色阳性,并有Aβ沉积、神经元丢失、胶质细胞增生,受损面积明显大于NS组,受损面积与动物的学习记忆水平呈现出负相关性(r=-0.241,P<0.05).结论 双侧EC注射聚集态Aβ可以引起动物学习记忆障碍,注射区局部的病理改变与阿尔茨海默病(AD)典型的老年斑(SP)相似,说明聚集态Aβ具有明确的神经毒作用,EC内注射Aβ有望成为研究AD发病机理与Aβ相关药物筛选的动物模型之一.     

嗅鞘细胞联合神经干细胞对大鼠急性脊髓损伤及脑源性神经营养因子表达的影响

目的:探讨嗅鞘细胞(OECs)联合神经干细胞(NSCs)对大鼠急性脊髓损伤及脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)表达的影响。方法:取新生3 d SD大鼠的海马和嗅球制备神经干细胞和嗅鞘细胞,对80只SD大鼠做急性脊髓损伤造模,随机分为对照组(假手术组)、NSCs移植组、OECs移植组、NSCs+OECs联合移植组(记为实验A、B、C组),细胞移植。于术前,术后1、3、7、14、21 d行BBB评分、斜板实验和运动诱发电位(MEP N1波)潜伏期检测,在各组随机抽一只SD大鼠做免疫组化,观察比较受损脊髓中BDNF的表达情况。结果:(1)BBB评分变化:除第1天外,各实验组恢复程度均明显大于对照组(P0.05),第7天开始各实验组间两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。(2)斜板试验角度变化:第1周开始,四组中任意两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。(3)MEP(N1波)潜伏期变化:自第3天,四组中任意两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。(4)BDNF染色阳性细胞数变化:细胞移植后,各组大鼠受损脊髓中BDNF开始升高,第3天到高峰后减少。术后第3天开始,四组中任意两组比较均有统计学意义(P0.05)。结论:采用细胞移植治疗大鼠急性脊髓损伤,OECs与NSCs联合移植治疗效果最佳;单细胞移植时,OECs比NSCs移植治疗效果更强。联合移植组中BDNF表达最高。     

嗅成鞘细胞移植治疗脑梗塞大鼠的实验研究

目的探讨嗅成鞘细胞移植在皮层梗塞灶中的治疗价值。方法从成年SD大鼠嗅球取材,差异贴壁法纯化培养,移植时Hoechst33342标记;按双肾双夹方法复制RHRSP模型,RHRSP术后10周,移植组和对照组制作MCAO模型,假手术组不电凝大脑中动脉。选择皮层梗塞10d后的大鼠,在立体定向架上将Hoechst标记的嗅成鞘细胞植入皮层梗塞灶周围,对照治疗组则注入达乐伯克改良培养基,于移植前及移植术后第2周、第6周进行行为、触觉功能检查并从各组随机抽取7只大鼠处死,取大脑,制作冰冻切片用于荧光观察及生长相关蛋白-43及神经中丝免疫组化染色。结果移植后的OECs沿着胼胝体大量向梗塞灶及对侧皮层迁移;移植组和对照组大鼠均出现功能恢复,移植组大鼠运动、感觉功能恢复优于对照组(P<0.05);移植组和对照组都有神经纤维向梗塞中心区生长,移植组的神经纤维数量明显多于对照组(P<0.01);在移植后的第2周、第6周,移植组胼胝体区及梗塞灶相应的对侧皮层区出现GAP-43表达局部升高,其阳性信号值明显高于对照组(P<0.01);梗塞灶周围再生神经纤维的数量与运动功能评分之间存在正相关(r=0.93),P<0.01。结论OECs植入体内可以长时间存活,并有自我迁移能力;OECs移植具有明显促进脑梗塞后神经纤维再生和功能恢复的作用,胼胝体及梗塞灶对侧层的轴突再生也是移植组大鼠功能恢复的可能机制。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

肝干细胞--肝卵圆细胞的研究进展

对于肝卵圆细胞的研究已有一定时间，但近几年才明确其属于干细胞范畴，笔者简要综述了肝卵圆细胞的特征、来源、调控分化及与肝病的关系。     

体外定向诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞及其与脐静脉内皮细胞的比较

目的：研究干细胞定向分化为内皮细胞的效率,并与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)比较。方法：用两步法诱导干细胞HUES9分化为内皮细胞,前3 d在N2B27培养基中加入骨形态发生蛋白4 (25 ng/mL)和肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂CHIR99021(10 μmol/L)使细胞分化到中胚层状态,第4天开始用 VEGF165(200 ng/mL)和Forskolin(2 μmol/L)将细胞诱导为内皮细胞。观察分化第6天细胞形态,并与HUVECs比较。用 CD144作为内皮细胞表面标志物,流式细胞术检测分化效率及分化后细胞的身份。比较两种内皮细胞迁移和成管能 力。结果：分化后的内皮细胞与HUVECs在显微镜下形态一致。分化细胞表面标志物阳性率达到73.4%,重新培养后 的内皮细胞表面CD144阳性率达到86.6%,HUVECs为94.4%。分化后的内皮细胞与HUVECs均具有良好的迁移和成管 能力,但分化后的内皮细胞能力不如HUVECs强。运用SB431542后,能够提高分化后内皮细胞的迁移和成管能力。 结论：此两步法将干细胞分化为内皮细胞有较高的分化效率,可作为理想的分化方法。     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

人胚胎原生殖细胞中胚胎干细胞的分离培养

目的：探讨人胚胎原生殖细胞分离培养的条件及在体内、外的分化能力．方法：从5～9wk人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞(PGC），将其置于饲养层上培养，采用大鼠心肌细胞条件培养基(RH-CM)，改变了常规使用添加白血病抑制因子(LIF)的培养液．结果：成功地完成了对PGC的第4代培养；经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合胚胎干细胞(ES)的特性：AP染色呈阳性；体外分化实验显示此细胞具有发育多能性；悬浮培养时能够自然分化成类胚体(EB)．结论：离散生殖嵴和增殖的。PGC克隆的时机和方法是影响建系的关键；PMEF和HEF对人PGC克隆的影响无显差异；添加RH-CM可有效抑制PGC的分化。     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

人骨髓间质干细胞对树突状细胞成熟和功能影响的实验研究

目的探讨人骨髓间质干细胞对树突状细胞成熟和功能的影响以及人骨髓间质干细胞发挥免疫抑制作用的可能机制。方法以Friedenstein法分离培养骨髓间质干细胞,以密度梯度离心法分离培养外周血单个核细胞,在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组人白介素-4的培养条件下制备树突状细胞。在LPS(1ng/mL)诱导下获得成熟树突状细胞。将骨髓间质干细胞与成熟树突状细胞共培养48h后,混合淋巴细胞反应检测经骨髓间质干细胞处理前后树突状细胞对同种异体T细胞的增殖能力,流式细胞仪检测处理前后其表面共刺激分子CD86和成熟标记物抗原CD83的表达,ELISA法测定混合淋巴细胞反应上清中细胞因子的表达。结果与未成熟DCs组比较,成熟DCs组表面抗原CD86,CD83的表达均增加,对T淋巴细胞刺激能力增强,致炎细胞因子分泌(IL-12,IFN-γ)增多,而抑炎因子(IL-10)分泌减少,成熟DCs组经hMSCs处理后,表面抗原表达水平明显下降,致炎细胞因子分泌减少,而抑炎因子分泌增加,对T淋巴细胞刺激能力减弱,与未处理成熟组比较差异具有显著性,而与未成熟组比较差异无显著性。结论hMSCs能逆转成熟DCs为未成熟DCs状态,从能间接抑制DCs启动的T淋巴细胞增殖,抑制炎症因子的分泌,发挥免疫抑制作用。