结核分枝杆菌及多重耐药性的快速检测:MTB/RIF实验及检测诊断系统

我国是结核病及耐药结核高发地区,年新发结核病例130万,新发结核病例耐药率为5.7％.痰涂片抗酸染色和临床放射影像学是结核病尤其是肺结核的主要诊断手段.但痰涂片阳性率偏低,新发肺结核病例涂阳率仅28％,而且结核病的影像学表现缺乏特异性.缺乏简单、准确、快速的诊断手段一直是我国实现结核病防控目标的瓶颈.结核分枝杆菌/利福平耐药(MTB/RIF)检测诊断系统运用半槽式(hemi-nested)RT-PCR及荧光探针报告技术(beacon technology),特异性扩增并检测结核分枝杆菌特有并与利福平耐药密切相关的rpoB基因片段.以PCR循环阈值反映标本中的结核分枝杆菌载量,进行半定量分析.该系统以结核杆菌培养作为标准对照,对疑诊肺结核患者痰标本的诊断总体敏感性为73.1％～90.0％,特异性99.0％～99.5％;对利福平耐药基因(MDR-TB的分子生物学标记物)诊断的敏感性为97.2％、特异性为98.3％.上样后系统可在2h内自动完成诊断及结果打印程序.由于系统特异性扩增rpoB基因片段,因此与非结核分枝杆菌及呼吸系统常见病原体无交叉反应.除外痰标本,该系统还能用于多种体液(胸腔积液、尿、脑脊液以及支气管肺泡灌洗液等)和肺组织匀浆中结核分枝杆菌的检测.该系统的诊断敏感性较抗酸染色高l00倍,与结核分枝杆菌培养相近,但后者从加样至报告的平均时间为16d(平板培养基)或30d(液体培养基).与传统结核诊断实验室诊断技术相比,本系统还具有操作简便、不产生传染性生物气溶胶等优点.     

T淋巴细胞斑点试验检测在盆腔结核诊断中的应用

目的：探讨外周血和盆腔积液T淋巴细胞斑点试验（T-SPOT.TB）检测在盆腔结核诊断中的应用价值。方法采集28例确诊为盆腔结核患者及36例盆腔肿瘤患者（对照组）的外周血和盆腔积液，分离单个核细胞，采用T-SPOT.TB法检测特异度T淋巴细胞反应，同时对盆腔积液进行荧光定量PCR法检测，根据检测结果比较3种方法的灵敏度及特异度。结果外周血和盆腔积液T-SPOT.TB检测、盆腔积液荧光定量PCR法检测灵敏度分别60.71%，75.00%和28.57%，外周血和盆腔积液T-SPOT.TB检测2种方法比较，差异无统计学意义（χ2=1.310，P＞0.05），外周血和盆腔积液T-SPOT.TB检测与荧光定量PCR法均有统计学意义（χ2=7.292，P＜0.01和χ2=14.000，P＜0.001）。外周血和盆腔积液T-SPOT.TB检测、荧光定量PCR法检测特异度分别为91.97%、88.89%和86.11%。结论外周血和盆腔积液T-SPOT.TB检测对于盆腔结核的诊断有较好的应用价值。     

高原扁桃体反复感染伴OSAHS患者血中CRP、TNF-a的相关性研究

目的：观察高原（2300m～3700m）扁桃体反复感染伴阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSABS）患者血中C-反应蛋白（CaP）、肿瘤细胞坏死因子-a（TNF—a）水平影响。方法：选择通过多导睡眠仪（PSC）确诊的30例OSAHS患者和29例正常对照组。用放射免疫法测定两组血清TNF-a水平，用散射比浊法测定两组血清CRP水平，进行对照分析。结果：OSAHS患者呼吸暂停-低通气指数（AHI）与CRP、TNF—a水平呈正相关（r=0．37，P〈0．01），与夜间最低SaO2呈负相关（r=-0．56，P〈0．001）。OSAHS患者CRP、TNF—a水平较对照组显著性增高（P〈0．001）。结论：OSAHS患者CRP、TNF—a血清水平增高与炎症、低氧血症的发生相关。     

SARS病毒全基因组芯片在临床检测中的应用

目的：利用冠状病毒全基因组芯片检测SARS患者血、便和痰标本中的冠状病毒核酸，为SARS病毒核酸的诊断提供线索。方法：提取SARS患者血、便和痰样本中的冠状病毒RNA，经全基因组随机反转录和PCR扩增标记成荧光探针，与SARS病毒全基因组芯片进行杂交，同时用体外培养的病毒RNA和从健康人分离的白细胞的RNA分别做阳性和阴性对照，杂交后的芯片用Axon4100A扫描仪扫描和分析。结果：SARS患者的3种标本中都能检测到冠状病毒核酸的存在，与整个病毒基因组比较大都为一些不连续的片断。其中痰和便标本中的基因谱较为相似，并且发现编码S1蛋白的核酸在多数痰和便标本中是连续的。结论：冠状病毒全基因组芯片能够检测出SARS患者血、便和痰标本中的冠状病毒核酸，同时能够监测不同样本中该病毒全基因组变化的特点，初步显示该芯片用于临床检测的可行性。     

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测结核分枝杆菌

目的建立快速检测结核分枝杆菌环介导的恒温扩增法。方法针对结核分枝杆菌特异性保守靶序列IS6110,采用环介导的恒温扩增法（LAMP）引物设计原则设计6条引物,特异性识别靶基因序列上8个独立区域。LAMP反应过程中会产生焦磷酸镁白色沉淀,可以通过实时监测反应液浊度来判断反应结果。结果试验表明,在60～65℃恒温条件下,LAMP反应60 min内即可完成;如果在反应前添加钙黄绿素,可通过反应液颜色的变化来判断反应结果;LAMP方法的最低检出核酸浓度为101 pg/μl,其灵敏度是PCR方法最低检出浓度1.01 ng/μl的10倍,且具有良好的特异性。结论 LAMP方法检测结核分枝杆菌具有简单、快速、价廉、特异性强、灵敏度高等特点,适用于疾控工作及临床筛查或快速检测结核杆菌。     

血清C-反应蛋白与冠心病相关性的研究

目的：探讨超敏血清C-反应蛋白（high—sensitivity c—reactive protein，hs—CRP）与冠心病（coronary heartdisease，CHD）的相关性。方法：随机选取138洌经冠状动脉造影证实的冠心病患者，其中74例稳定型心绞痛（sA）、41例不稳定型心绞痛（UA）、23例急性心肌梗死（AMI）．25例健康者作为对照。用乳胶增强免疫透射比浊法（终点法）检测血清其hs—CRP含量。同时探讨hs—CRP与肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CKMB）的关系。并参考比较不同hs—CRP水平各组患病数。结果：冠心病各亚组hs—CRP水平均高于对照组（P〈0．05）；UA组血清hs—CRP浓度显著高于SA组；AMI组血清hs—CRP浓度分别显著高于UA组与SA组，均有统计性差异（P＜0．05）。结论：冠心病患者血清hs—CRP水平升高，是冠心病的一项独立危险因子，与冠状动脉粥样硬化斑块内的炎症反应有关；血清hs—CRP水平对冠心病的病变程度具有预测价值。     

C-反应蛋白检测在临床中的应用

C-反应蛋白（CRP）是一种急性相蛋白,健康人血清中浓度很低,当细菌感染引发炎症、组织损伤和术后,其浓度显著增高,在炎症进程开始后6～12h就可检测到。因为CRP通常在细菌感染后增高,而病毒感染时不增高,所以可用来作为鉴别细菌或病毒感染的一个首选指标。CRP对应于病情的浓度变化,比常用的血沉（ESR）要快得多。当病人康复时,CRP会在几天内降至10mg／L以下。     

荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中Tb DNA诊断肺结核的临床价值

目的探讨荧光定量PCR（FQ-PCR）技术测定支气管肺泡灌洗液中Tb DNA在肺结核诊断中的价值。方法对43例肺结核患者、63例非肺结核患者支气管肺泡灌洗液（BAFL）用FQ-PCR检测Tb DNA。结果荧光定量PCR检测BALF诊断肺结核的度=65．1％；特异度=98．4％；准确度=84．9％。结论荧光定量PCR方法检测BALF中Tb DNA诊断肺结核具有很好的敏感性、特异性，对肺结核的诊断有价值。     

三种结核分枝杆菌耐药基因检测的临床应用和评价

采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌耐药基因（rPOB、katG和rPSL），评估它的临床应用价值。通过Bactec-960快速培养、PCR－SSCP和药物敏感试验了解123例肺结核病人结核分枝杆菌耐药情况，分析了临床治疗效果。近1／3的初治肺结核病人至少耐一种抗结核药物，RFP、INH和SM敏感株SM敏感株rPOB、katG和rPSL基因突变率分别为6．2％、10．8％和25．4％，耐药株基因突变率分别为60．2％、48．0％和61．5％，耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。药敏试验联合耐药基因检测指导治疗效果满意。耐药基因检测指导治疗是一种新探索，与药敏试验联合应用可互相弥补，有可能成为临床指导用药的较好方法。     

实时荧光定量PCR检测痰中结核分枝杆菌临床评价

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测临床痰标本中结核分枝杆菌诊断肺结核的意义。方法收集我院2011年9月-2013年8月期间收治的126例确诊为肺结核的患者和80例非结核性呼吸道疾病患者的痰液标本,分别采用漂浮集菌涂片镜检、BACT／ALERT3D快速培养法和FQ-PCR法检测痰中结核杆菌,分析检出结果。结果126例确诊为肺结核患者的痰标本中对结核分枝菌杆的检验以FQ-PCR检出率最高达到53．2％,高于快速培养法的46．8％（P〈0．05）和痰漂浮集菌涂片镜检法的32．5％（P〈0．01）。FQ-PCR与痰培养法总体一致性为95．1％,K=0．88。对痰涂片阳性标本,两者敏感性差异无统计学意义（P〉0．05）;对痰涂片阴性标本,FQ-PCR敏感性明显高于快速培养法（P〈0．01）。结论FQ-PCR具有快速、敏感、特异、可定量和自动化的优点,值得应用于痰中结核杆菌的检测及肺结核的诊断。     

急性主动脉夹层患者C反应蛋白浓度变化及其临床意义

目的检测急性主动脉夹层患者（acute aortic dissection,AAD）血清C反应蛋白（CRP）浓度及外周血白细胞（WBC）计数变化,探讨其在急性主动脉夹层的诊断及预后评价中的临床意义。方法测定55例原发性高血压伴急性主动脉夹层患者（AAD组）、55例不伴急性主动脉夹层的原发性高血压患者（EH组）及55例健康体检者（对照组）的血清CRP浓度及外周血WBC计数,并比较三组患者CRP浓度及WBC计数变化。然后根据CRP浓度增高程度将AAD组分为3个亚组：AAD1亚组（CRP≤30mg/L）、AAD2亚组（30mg/L〈CRP〈60mg/L）、AAD3亚组（CRP≥60mg/L）,观察3个亚组患者住院期间1周内死亡率。结果AAD组较EH组及对照组的血清CRP浓度及外周血WBC计数明显增高（P〈0.001）;AAD3亚组（CRP≥60mg/L）患者死亡率明显高于AAD1及AAD2亚组。结论炎症反应在高血压及主动脉夹层的发生发展中发挥了重要的作用,伴有高浓度CRP及外周血WBC增高的高血压患者更易发生主动脉夹层,CRP水平较高的AAD患者短期死亡率更高。因此,监测CRP浓度对了解病情、评价主动脉夹层预后具有重要的临床价值。     

血管内皮生长因子和C-反应蛋白在蛛网膜下腔出血患者中的表达和临床意义

目的：研究蛛网膜下腔出血（SAH）患者血清中血管内皮生长因子（VEGF）和C-反应蛋白（CRP）的表达。方法：检测60例SAH患者人院时血清VEGF和CRP水平,60例健康体检者作为对照组。结果：SAH患者VEGF和CRP水平明显高于健康人（P〈0．05）,并与SAH严重程度及预后密切相关（P〈0．05）。结论：血清VEGF和CRP可作为SAH的辅助诊断和预后指标。     

重组结核分枝杆菌Rv2389c蛋白的纯化及其生物学功能的初步研究

目的：纯化晕组的结核分枝杆菌促进复活因子（resuscitation-promoting factor，Rpf）Rv2389c蛋白，并研究其对结核分枝杆菌、卡介苗（BCG）和藤黄微球菌的生长有无促进作用？方法：用亲和层析柱纯化重组的结核分枝杆菌Rv2389c蛋白，并将其加到一定浊度的结核分枝杆菌、BCG和藤黄微球菌培养液中，每隔一定时间测定菌液OD600值。结果：经过纯化，得到了去掉谷胱苷肽转移酶（GST）标签的重组Rv2389c蛋白，浓度为306.9μg／ml，且发现Rv2389c蛋白对结核分杆菌、BCG和藤茧微球菌的牛长都有一定的促进作用。结论：成功纯化了重组结核分枝杆菌Rv2389c蛋白，并证实它具有生物学活性，能促进结核分枝杆菌、BCG和藤黄微球菌的生长，为进一步研究其机制奠定了基础。     

C反应蛋白检测在感染性疾病中的意义

目的：探讨血清C反应蛋白（CRP）检测在感染性疾病中的意义。方法：对确诊为各类感染性疾病100例（观察组）与健康对照组20例血液标本的白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、CRP等进行检测和对比分析。结果：观察组白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞等与对照组比较,无显著差异（P〉0．05）;单核细胞、CRP差异显著（P〈0．05）。结论：对于急性感染性疾病的诊断,检测血清CRP较白细胞总数更敏感、更准确。     

检测BALF中CRP和T细胞亚群对肺结核与肺癌鉴别诊断的意义

目的评价联合检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中C反应蛋白（CRP）浓度及T淋巴细胞亚群在肺癌及肺结核鉴别诊断中的意义。方法对43例确诊的肺癌患者、37例肺结核患者以及20例健康体检者,采用免疫比浊法检测BALF中CRP浓度,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群水平。结果肺结核组BALF中CRP浓度高于健康对照组和肺癌组（P〈0.05）,与肺结核组和健康对照组相比,肺癌组BALF中的T细胞亚群中CD4＋细胞比例和CD4＋/CD8＋比值显著下降（P〈0.05）,而CD8＋比例无明显差异（P〉0.05）。各种肺癌类型之间,CD4＋、CD8＋细胞比较无明显差异（P〉0.05）。诊断肺结核时,BALF中CRP浓度为29.2 mg/L时特异性最高,为91.4%;诊断肺癌时,BALF中T细胞分类CD4＋细胞比例为34.2%时特异性最高,为87.9%。结论联合检测BALF中CRP及T淋巴细胞亚群,对肺癌与肺结核的鉴别诊断具有一定的价值。     

结核T细胞酶联免疫斑点试验诊断结核感染的临床应用

 目的 探讨结核T细胞酶联免疫斑点试验(T-SPOT.TB)诊断结核感染的临床应用价值。方法 选择结核分枝杆菌感染者103例及非结核病对照者30例,用酶联免疫斑点试验检测外周血单个核细胞经结核特异性蛋白6KD早期分泌靶向抗原,以及培养滤液蛋白10刺激产生γ-干扰素的T淋巴细胞数,并与血清抗结核抗体、结核菌素皮肤试验结果比较。结果 T-SPOT.TB诊断结核感染的敏感性和特异性为95.15% 、93.33%;阳性预则值和阴性预测值为98.00%、84.85% ;阳性似然比和阴性似然比为14.27%、0.05%,均优于血清抗结核抗体、结核菌素皮肤试验(P<0.01),但方法间一致性较弱(Kappa＜0.40,P<0.001),差异有统计学意义。结论 T-SPOT.TB检测在结核分枝杆菌(MTB)感染的筛查,快速早期辅助结核病诊断和排除感染方面意义重大。     

系统性红斑狼疮患者实验室检查与病情活动及感染的关系

目的：通过分析SLE病情活动和／或伴感染患者的临床和血清学特点，寻找对疾病活动和感染有鉴别意义的实验室指标。方法：2000—2004年我科住院359例SLE患者的回顾性分析，比较无感染病情活动者233例（SLE无感染组）和伴感染者126例（SLE伴感染组）的临床表现及相关实验室检测的变化。结果：感染组患者发热、口腔溃疡、雷诺现象、浆膜炎及心、肾、肝损害等临床表现的发生率及中性白细胞分类、C-反应蛋白（CRP）、ESR、α1球蛋白及尿β2-MG、尿IgG、尿α2-MG等均明显高于无感染组（P〈0．01）。通过比较多种实验室相关指标发现，CRP受感染外因素影响较少，无感染组患者CRP均数正常，伴感染则明显升高。结论：①SLE伴感染时多数患者CRP可明显升高；②SLE患者病情活动时CRP大多正常或轻度增高，但少数（尤其有浆膜炎者）CRP可呈较高水平。因此，CRP对于鉴别SLE病情活动与是否伴感染具有重要临床应用价值。     

急性盆腔炎患者CRP、IL-2及T细胞亚群测定的临床意义

目的：检测急性盆腔炎CRP（C-反应蛋白）、IL-2（白细胞介素-2）和T淋巴细胞亚群水平的临床意义。方法：血清CRP测定采用免疫透射比浊法，IL-2测定采用EHSA法，T淋巴细胞亚群采用APAAP法。结果：与对照组比较，急性盆腔炎患者血清CRP水平显著升高（P〈0．01），IL-2水平和CD3^＋、CD4^＋及CD4^＋／CD8^＋比值明显降低（P〈0．01）。结论：急性盆腔炎患者细胞免疫功能低下和紊乱，易致反复感染，CRP是急性盆腔炎早期诊断、病情监测、疗效判定的敏感指标。     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

CRP临床应用

CRP（C—reactlvc protein，CRP）C-反应蛋白是由细胞因子白细胞介素-6（IL-6）诱导肝脏合成的急性时相蛋白，近年来，随着分子生物学和免疫学的发展．新的检测方法和仪器得到广泛的应用，这对CRP的研究进展起到了推动作用。CRP的临床应用价值引起了人们的特别关注．CRP在临床上得到广泛的应用．特别是它在监别感染性疾病以及心血管疾病的诊断、监别、预后以及实验室检测方面具有重要的临床应用价值。越来越多的证据表明CRP不仅是炎症感染、组织损伤、坏死和恶性肿瘤的一个非特异性和敏感的指标．而且动物模型实验表明还具有一定的治疗作用。