云南小耳猪胰岛细胞肝内移植对糖尿病猴的治疗作用

目的探讨云南小耳猪胰岛细胞经门静脉肝内异种移植的可行性,观察其对恒河猴糖尿病的治疗作用.方法 STZ诱导法复制恒河猴糖尿病模型,经胃网膜右静脉输注分离纯化的云南小耳猪胰岛细胞,移植在糖尿病猴肝内,移植后使用小剂量无激素免疫抑制方案,监测移植前后胰岛素用量、血糖以及血清C肽水平和肝肾功能的变化,评价猪-猴异种胰岛细胞移植对恒河猴糖尿病的治疗作用.结果 STZ能成功诱导恒河猴糖尿病模型;移植后第3天实验组糖化血红蛋白较术前降低,而对照组糖化血红蛋白一直呈上升状态;实验组外源性胰岛素用量较术前明显减少(P<0.05),对照组胰岛素用量无明显变化;实验组C肽水平较术前升高(P<0.05),对照组C肽一直维持在较低水平;无栓塞、感染、出血,肝肾功能无明显异常改变.结论云南小耳猪-恒河猴异种胰岛细胞移植能够降低糖尿病猴的高血糖状态,改善糖尿病症状,无明显副作用.     

免疫抑制剂依维莫司对大鼠胰岛细胞的毒性作用

目的 观察依维莫司等免疫抑制剂对大鼠胰岛瘤细胞(INS-1)和SD大鼠正常胰岛细胞代谢活性和功能的影响,旨在探讨依维莫司在胰岛移植免疫抑制治疗中的安全性和可行性.方法 不同浓度梯度免疫抑制剂依维莫司、西罗莫司、环胞霉素A和霉酚酸酯处理INS-1和正常胰岛细胞,用MTT法检测细胞的代谢活性;用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测胰岛细胞的胰岛素分泌功能.结果 临床血药浓度以上的依维莫司和西罗莫司高浓度组胰岛细胞增殖抑制率低于环胞霉素A和霉酚酸酯(P＜0.05);依维莫司在临床血药浓度范围和其它免疫抑制剂一样可以抑制胰岛细胞的胰岛素分泌功能,各组间的刺激指数差异无统计学意义.结论 依维莫司和西罗莫司对INS-1细胞及SD大鼠胰岛的毒性作用较小,环胞霉素A和霉酚酸酯对INS-1和SD大鼠胰岛具有较为明显的毒性作用,依维莫司有望作为新型免疫抑制剂应用于临床胰岛移植.     

免疫抑制剂对移植术后血脂异常的研究

心脑血管合并症是导致长期存活器官移植患者移植器官功能死亡的主要原因之一。在导致心脑动脉硬化的诸多因素中,高脂血症是其中最重要的原因。文章详细地论述了不同免疫抑制剂对血脂的影响,包括皮质类固醇激素、环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤等,最终发现吗替麦考酚酯是对血脂影响最小的药物之一。     

新生猪胰岛移植治疗糖尿病病人的临床研究

目的:评估新生猪胰岛移植治疗1型糖尿病方法的安全性和有效性.方法:所有22例病人均接受经肝动脉新生猪胰岛移植治疗,移植后病人接受多种免疫抑制治疗方案;第1组14例病人使用环孢菌素、骁息和甲基强的松龙,没有接受猪C肽检测;第2组2例病人只使用环孢菌素和骁息,第3组6例病人的免疫抑制方案是OKT3、他克莫司、西罗莫司和甲基...     

半自动纯化法分离纯化成年猪胰岛细胞的实验研究

目的探索大规模猪胰岛细胞分离纯化的方法.方法采用胶原酶消化法和Ficoll液不连续密度梯度离心进行分离纯化;采用双硫腙染色、AO-PI染色、胰岛素释放试验检测胰岛的纯度和活性.结果消化后平均获取的胰岛细胞团数量为（4 387±617）IEQ/g胰腺组织;纯化后平均为（3 192±756）IEQ/g胰腺组织;获取的猪胰岛细胞平均纯度为（60.15±2.35）%,活率为（80.00±0.47）%.结论所获得的胰岛细胞有较好的纯度和良好的生物活性,显示半自动纯化法分离纯化成年云南小耳猪胰岛细胞是成功可行的,可以满足进一步异种移植的研究需要,可为大规模分离纯化猪胰岛细胞提供技术支持.     

西罗莫司和FTY720对大鼠胰岛细胞体外分泌功能的影响

目的:探讨西罗莫司(sirolimus)和FTY720对大鼠胰岛细胞体外分泌胰岛素功能的影响.方法:将大鼠胰岛细胞分别与西罗莫司和FTY720共培养后进行糖刺激胰岛素释放试验,用ELISA方法检测培养液中胰岛素含量并进行比较研究.结果:FTY720和西罗莫司对大鼠胰岛细胞胰岛素分泌无明显影响.结论:FTY720和西罗莫司对大鼠胰岛细胞及分泌功能无明显影响,FTY720和西罗莫司有可能作为临床胰岛细胞移植的主要免疫抑制剂使用.     

新生猪胰岛移植治疗糖尿病病人的临床研究

目的:评估新生猪胰岛移植治疗1型糖尿病方法的安全性和有效性.方法:所有22例病人均接受经肝动脉新生猪胰岛移植治疗,移植后病人接受多种免疫抑制治疗方案;第1组14例病人使用环孢菌素、骁息和甲基强的松龙,没有接受猪C肽检测;第2组2例病人只使用环孢菌素和骁息,第3组6例病人的免疫抑制方案是OKT3、他克莫司、西罗莫司和甲基强的松龙.在移植治疗前和移植后1年,病人进行了血糖、外源性胰岛素用量、糖化血红蛋白、猪内源性反转录病毒(PERV)和肝功能的评估,第2组和第3组的8例病人接受了血清猪C肽检测.6例病人在移植后4～6年进行了复查.结果:第1组14例病人移植后胰岛素用量减少和HbAlc水平降低.第2组2例病人在移植后代谢指标没有变化,猪C肽检测阴性.第3组的6例病人在移植3个月以后,胰岛素用量均减少,HbAlc正常,6例病人血清均检测到有意义的猪C肽.其中2例病人接受了第2次新生猪胰岛移植,1例病人短暂脱离胰岛素治疗7d.所有病人在移植后均未出现严重不良反应,没有PERV感染的证据.6例病人在新生猪胰岛移植4～6年后接受检查,此6例病人均在接受移植治疗1年后停止免疫抑制治疗,复查时6例病人均接受胰岛素治疗.其中4例病人严格限制糖的摄入,2例病人为自由饮食;这2例病人中,有1例出现2次酮症,有轻度糖尿病视网膜病变;1例出现1次由于急性胃肠炎导致的酮症;其余4例均未出现任何并发症.6例病人再次接受PERV检测均为阴性.结论:异种胰岛可以在人体内存活并发挥其功能,没有发现严重不良反应.     

异种移植微囊化新生猪胰岛细胞受体感染PERV潜在风险分析

目的:研究新生猪胰岛细胞(neonatal pig islets,NPIs)经微囊化后异种移植到狗体内,受体感染猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的风险.方法:将10只狗随机分成实验组和对照组,分别移植微囊化猪胰岛细胞和未被微囊化猪胰岛细胞.应用放射免疫的方法检测狗体内血清特异性猪C-肽以判断胰岛移植物活性;采用免疫组织化学技术检测28 d后肝移植部位是否有微囊化猪胰岛细胞;PCR和RT-PCR技术分别检测不同时间点狗外周血中PERV及猪mt DNA.结果:移植微囊化猪胰岛细胞2周后,给受体注射葡萄糖,15～30 min狗的外周血中猪C-肽表达明显升高,而对照组检测不到猪C-肽;免疫组化结果表明,狗肝脏移植部位周围可检测到少量微囊化猪胰岛细胞,肝组织无明显异常;PCR和RT-PCR结果表明,移植微囊化猪胰岛细胞在不同时间点狗外周血内均未检测到猪mt DNA及PERV表达,而对照组于移植后4 d内检测到猪mt DNA及PERV呈微弱表达,10 d后均未见表达.结论:微囊化猪胰岛细胞能够在受体肝脏内存活并发挥作用,受体内不存在PERV的感染,提示海藻酸钠微囊可以有效地防止猪mt DNA及PERV的穿越,可能在异种移植中具有较好的应用前景.     

口服免疫抑制剂三年使用情况调查

目的分析第三军医大学第二附属医院2010~2012年口服免疫抑制剂的使用情况,为合理使用免疫抑制剂,降低医药成本提供参考。方法从第三军医大学第二附属医院计算机HIS系统中调取2010~2012年各类口服免疫抑制剂的使用数据,计算各类药品的用药频率(DDDs),日均费用(DDDc)及联合用药数据,综合分析临床用药情况。结果抑制嘌呤合成类"吗替麦考酚酯"和钙调神经素抑制剂"他克莫司"的使用最为广泛,平均占35.33%和36.03%,但日均费用排名却相对靠后;免疫抑制剂方案的选择中,二联疗法(吗替麦考酚酯+他可莫司/环抱素)及三联疗法(吗替麦考酚酯+他可莫司/环抱素+咪唑立宾/西罗莫司)的使用比例分别占20.3%和79.7%,三联疗法的使用比例远高于二联疗法。结论该院口服免疫抑制剂的使用基本合理,但在进一步优化联合用药方案,合理控制药品费用方面仍需加大监管力度。     

云南小耳猪胰岛细胞的分离和纯化方法

目的探索云南小耳猪胰岛细胞分离和纯化的有效方法.方法采用胶原酶胰导管注射负荷技术,静止消化与物理消化相结合消化分离小耳猪胰腺;不连续密度梯度比重离心纯化,胰岛素释放试验检测胰岛细胞功能.结果胰岛收获量为（4580±257）IEQ/g胰腺,纯化后为（3660±449）IEQ/g胰腺,纯度为80%左右,胰岛素释放反应良好.结论采用本方法消化分离小耳猪胰岛,腱岛细胞产量、纯度较高,功能良好,为进一步成人胰岛细胞的分离纯化提供了实验依据.     

糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立

目的：建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型及探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用.方法：（1）体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶联合淋巴细胞分离液的方法来分离纯化胰岛,人工挑取胰岛细胞并收集胰腺外分泌细胞.链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB/C小鼠成为糖尿病小鼠.单纯移植组（n=10）每只小鼠于左肾被膜上极移植胰岛细胞250个,共同移植组（n =10）每只小鼠于左肾被膜上下极同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞,持续观测血糖及生命体征变化,1个月后切除左肾并继续检测血糖.（2）体外实验：利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,利用台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的活性,以及用葡萄糖刺激胰岛素释放实验来检测胰岛功能.结果：（1）胰岛移植后,单纯移植组及共同移植组血糖均逐步降至正常,共同移植组较单纯移植组血糖恢复正常时间延迟,移植术后第2,3,4,5天,单纯移植组受鼠血糖低于共同移植组,差异有统计学意义（P＜0.05）.切除两组受鼠左肾3d后,两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.（2）每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=2.90）.结论：（1）成功建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型.（2）胰腺外分泌细胞与胰岛细胞同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间.     

改良的新生猪胰岛细胞体外培养

介绍一种通过细胞分离及体外培养获得大量新生猪胰岛细胞团的方法。新生猪胰腺经 0 .5～ 1mg .ml- 1的V型胶原酶消化 8～ 1 2min ,再经体外培养 7d ,可获大量纯化的胰岛细胞团。同时 ,新生猪胰岛内的B细胞不仅胰岛素分泌功能良好 ,而且其超微结构正常。提示新生猪胰岛细胞可作为异种移植治疗 1型糖尿病重要的供体来源。     

东方田鼠三个脂肪肝相关基因的克隆及分析

目的以C57BL／KsJ—db／＋表型正常小鼠为对照组,研究自发性Ⅱ型糖尿病动物C57BL／KsJ—db／db小鼠的体生长曲线、糖代谢曲线、血清胰岛素水平变化、主要脏器重量、脏器系数等部分生物学特性,并探讨其肝脏、肾脏和胰腺等组织病理学变化。方法实验为期20周,从第4周开始,每周测定db／db以及db／＋小鼠体重、血糖,每2周测定血清胰岛素水平,20周龄处死,脏器、脂肪称重,部分组织用10％中性甲醛固定,制作病理切片。结果①db／db小鼠体重、血糖和血清胰岛素水平比同龄对照组高（P〈0．01）;②db／db小鼠各脂肪系数明显大于db／＋小鼠（P〈0．01）,而脾脏、胰腺以及肾脏则相对萎缩,特别是脾脏和雌性小鼠的胰腺与对照组相比差异极显著（P〈0．01）;③db／db小鼠肝细胞大片坏死、脂肪变性、炎细胞浸润、纤维组织增生;肾问质组织充血、水肿,肾小管内见蛋白管型、上皮细胞脂肪变性;胰岛数量明显减少、体积缩小,岛内细胞数量也相对减少。结论db／db小鼠是一种肥胖的,伴有高血糖、高度胰岛素抵抗,肝脏、肾脏病变和胰岛功能不足的适用性Ⅱ型糖尿病动物模型。     

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

茶多酚对胰岛素分泌和胰岛内钙离子浓度的影响

目的研究茶多酚对胰岛素分泌和胰岛内Ca~（2＋）浓度的影响。方法在显微镜下挑选单个胰岛,收集5个胰岛为1组,放置在含有不同浓度（0～150μg/mL）茶多酚的葡萄糖溶液中孵化,检测上清液中胰岛素的含量;收集100个胰岛个体,用Fluo-3/AM染色,放置于含不同浓度茶多酚的葡萄糖溶液中孵化,用激光扫描共聚焦显微镜检测胰岛个体内Ca~（2＋）荧光信号强度。结果与对照组（不含茶多酚的葡萄糖孵化溶液）相比,不同茶多酚浓度孵化液中胰岛素的浓度提高2～11倍（P〈0.01）;胰岛内Ca~（2＋）荧光信号强度提高3～30倍（P〈0.01）。结论茶多酚能够提高胰岛内Ca~（2＋）浓度,并在胰岛水平上促进胰岛素分泌。     

霉酚酸酯对糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1与OPN表达的影响

目的探讨霉酚酸酯（MMF）对糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子-β1（TGF-β1）和骨调素（OPN）表达的影响和肾保护作用。方法应用链脲佐菌素（STZ）将SD大鼠制作为糖尿病肾病大鼠模型,将SD大鼠分为健康对照组（NC组）、糖尿病肾病组（DM组）和霉酚酸酯干预组（MMF组）。12周后观察24 h尿蛋白定量、血糖、肾功能、肾重/体重比,处死后采用免疫组化观察肾组织中TGF-β1、OPN的表达。结果 DM组和MMF组的尿蛋白定量、血糖、肾重/体重比较NC组明显升高,免疫组化检查TGF-β1、OPN的表达明显增加,而MMF组中TGF-β1、OPN的表达较DM组明显减少,而且TGF-β1、OPN的表达与尿蛋白、肾重/体重比成正比。结论糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF-β1、OPN的表达明显增加;MMF对TGF-β1、OPN的表达有抑制作用;MMF可以减少蛋白尿,减轻肾小球、肾小管的硬化和纤维化,机制可能与MMF对TGF-β1、OPN表达有抑制作用相关,对糖尿病肾病有一定的治疗作用     

胰岛细胞移植治疗成人Ⅰ型糖尿病的临床应用初探

目的初步探讨成人胰岛细胞移植治疗成人Ⅰ型糖尿病的临床应用价值.方法自2006年开始经不断探索和反复的动物实验,初步掌握了成人胰岛细胞移植技术,并应用于1例临床I型糖尿病伴严重肠系膜血管病变患者.结果利用胶原酶灌注消化以及Ficoll分离液分层纯化技术的方法能够成功获得纯化的成人胰岛细胞;经胰岛素释放实验表明,实验中收获的胰岛具有良好的胰岛素分泌功能;经临床实践,该例糖尿病患者输注此胰岛后,血糖和糖化血红蛋白较移植前下降（P〈0.05）,腹泻症状较术前明显改善,体重增加了4.5kg,移植后无特殊并发症发生.结论成人胰岛细胞移植治疗I型糖尿病安全有效,此例为云南省成人胰岛细胞移植平台的建立和应用提供了理论和实验依据.     

Effect of different warm ischemic time on islet isolation and function in pigs

Objective To study the effect of different warm-ischemia time on islet structure, yield and function. Methods Adult pigs were studied, and according to warm ischemic time (WIT, 0, 10, 20, 30, 45 min), the porcine pancreata were divided into 5 groups (A, B, C, D, and E group). The isolation of adult porcine pancreas was carried out by injection of Hanks into pancreatic duct and digestion with collagenase Ⅴ and Ⅰ. A discontinuous Ficoll 400 solution was applied for purifying islets. The structure, purity and viability of islets were determined by dithizone staining and AO/PI staining, and the function of islets was evaluated by the glucose stimulating insulin release test. Results There were little islets debris in group A, B and C. But it was very difficult to obtain integrate islets in group E. There was no significant difference between the groups of 0, 10 and 20 min in islet number before and after islet purification ( P ＞ 0.05 ), while the difference was significant when warm ischemic time was prolonged to 30 min and 45 min ( P ＜ 0. 01 ). In respect of islet function, the similar results were found in different groups. Conclusions When WIT is within 20 min, there is no deleterious effects on islet morphology and yield as well as function. However, when WIT is prolonged to 30 min, the loss in islet yield is severe, and the islet function is significantly impacted.