^125碘—标记弓形虫感染孕鼠后胎鼠脑放射示踪研究

应用１２５碘－标记弓形虫经尾静脉感染受孕１４ｄ的昆明种小鼠，动态观察分布和受侵细胞变化情况，结果显示：孕鼠脑感染率为３０．６０％，胎鼠头感染率为７１．２０％，胎鼠头／躯干的放射性比值为１．３２～５．９５，随受染时间的延长而增高。放射自显影的光电镜观察提示，弓形虫感染后４～８ｈ虫体即在胎鼠脑胶质细胞内被发现。４８ｈ细胞核内可见，细胞退变崩解。７２ｈ脑神经细胞显著减少。实验结果为妊娠期感染弓形虫易导致胎儿神经管畸形提供实验病理学基础。     

软骨链蛋白在小鼠体内分布和代谢的示踪研究

目的　研究软骨链蛋白125I的标记和在小鼠体内的分布与代谢,为该蛋白质在肿瘤、软骨、结缔组织疾病以及地方病等领域的基础研究提供方法学指导和代谢参数.方法　氯胺-T法标记软骨链蛋白,亲和凝胶层析法分离标记物进行体内示踪研究.结果　软骨链蛋白标记率为89.90%,放射化学纯度为92.77%,样品比活度为8.13×10     

软骨链蛋白在小鼠体内分布和代谢的示踪研究

目的 研究软骨链蛋白125I的标记和在小鼠体内的分布与代谢,为该蛋白质在肿瘤、软骨、结缔组织疾病以及地方病等领域的基础研究提供方法学指导和代谢参数.方法 氯胺-T法标记软骨链蛋白,亲和凝胶层析法分离标记物进行体内示踪研究.结果 软骨链蛋白标记率为89.90%,放射化学纯度为92.77%,样品比活度为8.13×109Dpm/μg,该蛋白与透明质酸的最大结合率为89.23%.平均血浆半减期为1.84小时,血浆清除率为1.75ml/h,排除速率为10.03ml/h,稳态双库代谢模型为：Ct=2.4986e-0.5635t+3.24e-0.2833t.结论 为临床相关疾病的研究提供实验指导和代谢参数.     

^125I标记单克隆抗体4E5的制备及其在小鼠体内的分布

目的：探讨放射性核素^125I标记单克隆抗体4E5的方法,观察标记物在正常小鼠体内的生物学分布。方法：采用Iodogen法进行单克隆抗体4E5的Ⅲ标记,标记产物用SephadexG-50分离纯化,三氯醋酸（TCA）法测定标记率和放化纯,并对标记物的稳定性进行分析。取45只昆明小鼠随机分成9组,每只小鼠从尾静脉注入剂量为148KBq／0．2ml的^125I-4E5,分别于注药后5min、15min、30rain及1h、2h、6h、24h、48h、72h各处死一组小鼠,取主要脏器称重并测量其放射性计数,计算各脏器每g组织百分注射剂量率（％ID／g）。结果：”I标记4E5的标记率为（79．24-2．6）％,放射化学纯度为（97．1±1．1）％,比活度为294．5MBq／mg;^125I－4E5加入到血清及PBS中放置1w后,放化纯度仍〉90％;体内分布显示^125I-4E5在小鼠体内主要分布于肝、脾、肾,在血液中清除较快。结论：Iodogen法^125I标记4E5的标记率和放化纯度高,方法简便,标记物的稳定性好;。I-4E5在小鼠体内主要通过肝和肾代谢,血液中清除较快。     

用32p整体放射自显影技术对人体十二经脉循行路线和穴位示踪的初步研究

有关经络循经感传和可见经络现象的生理功能和病理特点的研究 ,都取得了一定成果[1 ] ,证实了经络现象的存在。 1 981年以来 ,人们为寻找经络现象的物质基础 ,先后有罗马尼亚[2 ] 、法国[3] 和中国[4 6] 的学者们用纯γ放射性核素99ｍＴｃ ,通过闪烁照相技术 ,研究经穴位注射99ｍＴｃ后出现的线状放射性迁移轨迹。但因γ射线在机体软组织中的穿透力很强 ,所显示的线状放射自显影像不可能在毫米级范围内精确定位。因此 ,本组改用纯 β放射性核素 3 2Ｐ作示综剂 ,其 β射线在机体软组织中的最大射程不超过 1ｃｍ ,有放射程不足 4ｍｍ ,在经络…     

磷[32P]核素示踪家兔经脉循行路线的实验研究

目的 在家兔经脉循行路线宏观显示基础上,进一步进行细胞水平的研究.方法 用穴位测定治疗仪在对应人体的外关、内关、昆仑、太溪经穴处对家兔的经穴定位,经穴位注入磷[32P]酸氢钠(sodium phosphate,Na2H32PO4),用32p 整体和光镜放射自显影术对家兔经脉循行路线进行宏观及细胞水平显示,观察家兔经脉循行路线走向、形状及分布在何种组织结构中.结果 实验获得了家兔经脉循行路线整体放射自显影像,影像线性较宽,形状单一且较粗大,影像走向与通过家兔皮肤导电量测定获得的经穴走向相似.光镜放射自显影术研究发现32P大量分布在表皮层中.结论 结果表明家兔体表存在与人体相近的具有低阻抗性的经穴,32P放射自显影术可以实现家兔经脉循行路线的宏观显示,家兔人体经脉循行路线的组织结构与人体经脉循行路线的组织结构相似.     

用32P光镜放射自显影示踪术对人体经脉循行路线组织结构的研究

目的 :研究人体经脉循行路线的组织结构究竟是什么的问题。方法 :用32 P光镜放射自显影示踪技术对人体经脉循行路线进行了 2例组织结构的研究。结果 :发现32 P不但大量分布在表皮的生发层中 ,而且还广泛分布于皮神经纤维和触觉小体内。结论 :提示人体经脉循行路线的组织结构与皮神经纤维的关系十分密切     

用^32P整体放射自显影技术对足三阴经循行路线示踪的初步研究

目的和方法：应用＾３２Ｐ整体放射自显影技术，对足三阴经进行３０例循环路线的示踪研究。结果：阳性２５例，阳性率达８３．３％，其中有１５例与脾经、２１例与肾经、１９例与肝经的走向大致相符，并有１５例出现串经，尤其是在三阴交穴可见两经相交者４例，三经相交者２例。此外还进行了６例０￣４８小时与４８￣９６小时放射自显像对比，结果两者影像完全一样，唯有前者的影像黑度较后者为深。结论：＾３２Ｐ放出的β射线在机体     

磷[~（32）P]核素示踪家兔经脉循行路线的实验研究

目的在家兔经脉循行路线宏观显示基础上,进一步进行细胞水平的研究。方法用穴位测定治疗仪在对应人体的外关、内关、昆仑、太溪经穴处对家兔的经穴定位,经穴位注入磷[32P]酸氢钠（sodium phosphate,Na2H32PO4）,用32P整体和光镜放射自显影术对家兔经脉循行路线进行宏观及细胞水平显示,观察家兔经脉循行路线走向、形状及分布在何种组织结构中。结果实验获得了家兔经脉循行路线整体放射自显影像,影像线性较宽,形状单一且较粗大,影像走向与通过家兔皮肤导电量测定获得的经穴走向相似。光镜放射自显影术研究发现32P大量分布在表皮层中。结论结果表明家兔体表存在与人体相近的具有低阻抗性的经穴,32P放射自显影术可以实现家兔经脉循行路线的宏观显示,家兔人体经脉循行路线的组织结构与人体经脉循行路线的组织结构相似。     

放射性125碘标记阿莫西林研究临床分离MRSA青霉素结合蛋白

目的本文以放射性125碘标记阿莫西林研究临床分离MRSA青霉素结合蛋白(PBPs),探讨高耐药及低耐药不产酶MRSA青霉素结合蛋白的改变.方法用125Ⅰ-阿莫西林与ATCC25923、临床分离MRSA及MSSA结合,SDS-PAGE分离检测PBPs的改变.结果SDS-PAGE分离检测PBPs,高耐药株在78KDa处有放射性,低耐药株放射性低于敏感株.结论125Ⅰ-阿莫西林与MRSA结合降低,高耐药株产生低亲和力的PBP2a,低耐药株PBPs与阿莫西林结合下降.     

弓形虫速殖子入侵对宿主细胞窖蛋白-1的表达变化

胞膜窖Caveolae,又称细胞膜穴样凹陷,是细胞表面特异性的内陷微区,Caveolin-1是其的标记蛋白.Caveolae结构和caveolin蛋白在多种细胞生理功能方面如细胞信号转导、胆固醇转运、内吞和肿瘤抑制等发挥着重要作用.在动脉硬化、肌营养不良和Alzheimer'S综合征等多种疾病中均发现存在caveola...     

TLR2 as an essential molecule for protective immunity against Toxoplasma gondii infection

To investigate the role of the Toll-like receptor (TLR) family in host defense against Toxoplasma gondii, we infected TLR2-, TLR4- and MyD88-deficient mice with the avirulent cyst-forming Fukaya strain of T. gondii. All TLR2- and MyD88-deficient mice died within 8 days, whereas all TLR4-deficient and wild-type mice survived after i.p. infection with a high dose of T. gondii. Peritoneal macrophages from T. gondii-infected TLR2- and MyD88-deficient mice did not produce any detectable levels of NO. T. gondii loads in the brain tissues of TLR2- and MyD88-deficient mice were higher than in those of TLR4-deficient and wild-type mice. Furthermore, high levels of IFN-gamma and IL-12 were produced in peritoneal exudate cells (PEC) of TLR4-deficient and wild-type mice after infection, but low levels of cytokines were produced in PEC of TLR2- and MyD88-deficient mice. On the other hand, high levels of IL-4 and IL-10 were produced in PEC of TLR2- and MyD88-deficient mice after infection, but low levels of cytokines were produced in PEC of TLR4-deficient and wild-type mice. The most remarkable histological changes with infiltration of inflammatory cells were observed in lungs of TLR2-deficient mice infected with T. gondii, where severe interstitial pneumonia occurred and abundant T. gondii were found.     

匹多莫德增强弓形虫新基因wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保护研究

目的 探讨匹多莫德增强弓形虫新基因wx2b4a表位疫苗刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果.方法 将昆明小鼠分成4组,分别用pcDNA3-W2b4a质粒、pcDNA3-W2b4a+匹多莫德、pcDNA3及生理盐水肌注3次.ELISA法检测血清IgG抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群,末次免疫后第4周,小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察小鼠生存时间.结果 pcDNA3-W2b4a+匹多莫德组、pcDNA3-W2b4a组小鼠血清IgG抗体水平显著高于pcDNA3组和生理盐水对照组(P＜0.05);各免疫组小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞数量显著高于对照组(P＜0.05);pcDNA3-W2b4a+匹多莫德组CD4+T细胞数量、CD4+/CD8+比值高于pcDNA3-W2b4a组(P＜0.05).小鼠攻击试验表明,pcDNA3-W2b4a+匹多莫德组小鼠存活时间明显长于对照组和pcDNA3-W2b4a组(P＜0.05).结论 匹多莫德可增强弓形虫新基因wx2b4a表位疫苗诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫.     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列，对比不同毒力弓形虫株（PRU、RH、ME49）中SAG2C基因序列。进行生物信息学分析。方法根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从Prugniaud（PRU）株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因，克隆入pMD19-T载体并进行序列测定。应用DNAMAN软件、NCBI网站（http：／／www。ncbi．nlm．nih.gov／）分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性；利用生物信息学网站ExPASy（http：／／us.expasy．org／）对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列．酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明，获得SAG2C基因序列1225bp，全长cDNA序列1095bp，编码364个氨基酸。同源性分析显示。弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97．14％；Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96．89％；编码氨基酸序列同源性为92％。N端为信号肽，C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白．存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域。结论成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列。序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白。     

两种免疫调节剂增强弓形虫W2b2a表位疫苗的小鼠保护作用

目的:探讨匹多莫德、沙利度胺增强弓形虫W2b2a表位疫苗刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果。方法:将匹多莫德、沙利度胺分别与弓形虫W2b2a表位疫苗混合肌注免疫小鼠,检测其细胞免疫和体液免疫,并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存时间。结果:pc DNA3-W2b2a加匹多莫德组、pc DNA3-W2b2a加弗氏佐剂组、pc DNA3-W2b2a加沙利度胺组小鼠血清IFN-γ水平显著高于pc DNA3-W2b2a组(P0.05);pc DNA3-W2b2a加匹多莫德组、pc DNA3-W2b2a加弗氏佐剂组Ig G抗体水平、CD4+/CD8+比值、T细胞增殖活性显著高于pc DNA3-W2b2a组和pc DNA3-W2b2a加沙利度胺组(P0.05);小鼠攻击试验表明,免疫组小鼠存活时间明显长于对照组(P0.05)。结论:匹多莫德、沙利度胺可增强弓形虫W2b2a表位疫苗免疫小鼠的保护作用。     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

早孕期弓形虫感染对大鼠胎盘RT.BM1及RT1-E基因转录的影响

通过检测正常妊娠和早孕期弓形虫感染的Wister大鼠胎盘RT.BM1和RT1-E mRNA的表达水平,发现二者在正常妊娠中的规律,进而探索早孕期弓形虫感染对胎盘RT.BM1和RT1-E mRNA表达的影响,以阐明弓形虫感染致不良妊娠结局的分子免疫机制。将48只孕鼠随机分为感染组和正常组,每组24只。感染组于妊娠第5天腹腔注射1×105个弓形虫强毒株(RH株)速殖子/只,正常组不作任何处理。两组于孕第9、13、15、17天分别处死6只孕鼠,无菌剖腹,观察胎鼠情况,计数死胎及活胎数。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测胎盘RT.BM1和RT1-E mRNA表达水平。结果:①正常组活胎数204只,死胎3只,死胎率1.4%,感染组活胎数133只,死胎27只,死胎率16.9%,死胎率明显高于正常组(P<0.05);②正常组RT.BM1 mRNA在孕第9、13、15、17天的相对表达水平为(3.21±1.32)、(4.35±1.29)、(3.96±1.49)、(11.1±2.15),前三个时间点表达水平基本一致(P>0.05),第17天则明显增高(P<0.01);RT1-E mRNA在各时间点相对表达水平为(0.79±0.45)、(2.15±1.03)、(2.13±1.74)、(2.39±1.85),第9天明显低于后三个时间点(P<0.05);③感染组各时间点RT.BM1 mRNA相对表达水平为(12.4±2.86)、(11.5±3.67)、(6.89±1.59)、(17.3±3.06),第9、13、15天与正常组相比有显著差异(P<0.01);而RT1-E mRNA分别为(1.83±0.886)、(4.72±1.59)、(4.24±2.26)、(3.83±2.26),第9、13、15天与正常组相比均有显著差异(P<0.01)、(P<0.05)、(P<0.01)。结果显示弓形虫感染量合适,动物模型成功建立;RT.BM1和RT1-E mRNA在大鼠胎盘的表达水平与妊娠进展密切相关;大鼠早孕期弓形虫感染可致胎盘局部RT.BM1和RT1-E表达增高,从而打破正常妊娠所需的胎盘局部免疫平衡状态,可能是早孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子机制之一。     

弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定

本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）,并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His—ROP2,最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性。本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

脂质体介导弓形虫SAG1与SAG3复合基因诱导小鼠免疫应答研究

目的评价弓形虫SAG1与SAG3基因真核表达质粒DNA免疫小鼠的免疫应答效果。方法以PCR方法扩增出SAG1与SAG3目的基因片段,并插入载体pEGFP-N3以构建重组质粒pE- SAG1／SAG3,瞬时转染细胞Cos-7。质粒pESAG1／SAG3以10μg剂量,脂质体介导肌肉注射BALB／c小鼠,免疫3次,最后一次免疫后4周,观察体液和细胞免疫。RT-PCR方法检测注射部位目的基因的转录;斑点杂交方法检测目的基因是否与小鼠染色体基因组整合。结果质粒pESAG1／SAG3转染细胞后观察到绿色荧光;Western blot显示pESAG1/SAG3表达识别条带在相对分子质量(Mr)66．2×103附近。小鼠免疫后,血清产生抗弓形虫速殖子抗体,诱导IFN-γ及IL-2水平高于对照组。RT-PCR显示首次免疫15 d后,目的基因在肌肉组织中仍有转录,斑点杂交显示目的基因未与小鼠的基因组发生整合,混合质粒注射的小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长。结论脂质体介导弓形虫SAG1与SAG3复合编码基因质粒接种小鼠能明显诱导体液和细胞免疫应答。