HCMV感染对人神经胶质瘤U251细胞p38MAPK活性的影响

人巨细胞病毒(HCMV)在人群中的感染非常普遍。随着器官移植的广泛开展、艾滋病的传播以及耐药病毒株的出现,对HCMV致病、致畸机制的研究越来越受到重视。MAPK是细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,它介导的信号转导通路是生物信号引起核反应的重要通路,参与细胞生长、分化、凋亡等多种生理过程,并在细胞恶性转化等病理过程     

肠道病毒71型对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响

  目的  探讨肠道病毒71型（EV71）对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响。  方法  采用非洲绿猴肾细胞Vero对EV71进行增殖,用Reed-Muench公式计算病毒液的50%细胞感染剂量（50% tissue culture infective dose,TCID₅₀);将EV71接种于U251细胞,光学显微镜下观察细胞形态,激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态,透射电镜观察线粒体超微结构的改变;Western blot检测线粒体分裂蛋白Drp1、p-Drp1(S637)和融合蛋白Opa1的表达水平;ATP试剂盒检测线粒体ATP水平;MitoSOX染色检测线粒体超氧化物水平。  结果  EV71的TCID₅₀为10－5.4/ 0.1 mL; EV71感染U251细胞24 h、48 h后细胞明显出现皱缩、变圆或死亡。激光共聚焦显微镜和透射电镜结果显示,EV71感染后细胞线粒体明显延长,线粒体嵴模糊不清;Western bolt结果显示,EV71感染U251细胞24 h和48 h后,Drp1、Opa1表达降低,而p-Drp1（S637）在48 h表达升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。EV71感染48 h后,与未感染EV71的U251细胞相比,线粒体ATP生成减少,线粒体超氧化物水平升高（P<0.05）。  结论  EV71感染U251细胞后,能引起线粒体形态及动力学改变,进而导致线粒体功能的变化,这可能是其引起神经系统功能紊乱的机制之一。     

抑制OGG1增加替莫唑胺对神经胶质瘤细胞U251的敏感性及机制探讨

目的探讨8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（OGG1）对脑神经胶质瘤细胞增殖及替莫唑胺(temozolomide,TMZ化疗敏感性的影响。方法采用光镜、CCK-8、活性氧（ROS）检测试剂盒DCFH-DA探针、Western blot观察及检测替莫唑胺处理后神经胶质瘤细胞的形态、细胞活力、细胞内活性氧水平及OGG1蛋白的表达水平; Real time-PCR技术检测OGG1m RNA干扰率; OGG1下调后,U251的细胞存活率及OGG1蛋白的表达水平。结果与对照组相比,替莫唑胺处理后,U251细胞的生存能力显著下降（P<0.05）,ROS水平显著增加（P<0.05）,OGG1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,当替莫唑胺剂量为100μmol/L时,对U251细胞的损伤最大（P<0.01）。当OGG1 si RNA干扰U251细胞OGG1后,OGG1 m RNA及OGG1蛋白的表达水平降低（P<0.05）,而利用低剂量的替莫唑胺对U251细胞处理时,细胞存活率显著降低（P <0.05）。结论 OGG1通过ROS通路,介导替莫唑胺对神经胶质瘤细胞U251的氧化损伤,OGG1抑制可增强神经胶质瘤细胞对TMZ的化疗敏感性。     

Klf4基因在人神经胶质瘤细胞U251中的稳定表达

目的:建立稳定表达Klf4基因的神经胶质瘤细胞U251 ,为探讨该基因在神经胶质瘤细胞中的功能奠定基础.方法:以低表达Klf4基因的人胶质瘤细胞系U251为材料,以Klf4基因转染U251细胞系,G418筛选,获取G418抗性单克隆进行培养,扩增后分别用免疫荧光技术、免役印迹技术(Western blot)验证获得的表达细胞株.结果:经转染和G418筛选后,荧光显微镜下见有明显表达Klf4基因的细胞,Western blot检测到转染基因Klf4后细胞KLF4蛋白的表达增高,而作为对照的转空载体的细胞Klf4的表达较低.结论:该方法成功建立了稳定转染基因Klf4的人胶质瘤U251细胞系,为进一步探讨该基因在肿瘤细胞的功能奠定了一定基础.     

枸杞多糖联合卡铂对人胶质瘤U251细胞生长抑制和凋亡作用

目的观察枸杞多糖联合卡铂对神经胶质瘤U251细胞生长抑制和凋亡作用。方法将U251细胞随机分为四组,A组（空白组）加常规培养液,B、C、D三组分别加枸杞多糖、卡铂、枸杞多糖＋卡铂联合组;通过细胞形态学、噻唑蓝法（methylthiazdyl tetrazolium,MTT）、DNA断端末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）及流式细胞仪,观察U251细胞生长抑制及凋亡情况。结果 B、C、D三组细胞生长抑制率及凋亡率均升高,但D组升高更明显,P〈0.05。结论枸杞多糖联合卡铂更易使U251胶质瘤细胞生长受抑制,且诱导其凋亡。     

CDK7抑制剂THZ1对人胶质瘤细胞U251放疗的增敏性

目的 探讨细胞周期蛋白酶抑制剂7(CDK7)THZ1对人胶质瘤细胞U251的体外放射增敏性.方法 体外培养人胶质瘤细胞U251.MTT检测THZ1对U251的毒性作用,绘制不同浓度(0、8、16、32、64、128、256、512 noml/L)THZ1处理下的细胞存活曲线,并计算其IC50及IC20,将IC20作为后...     

人巨细胞病毒pp65抗原检测在肾移植后HCMV感染状况的研究

目的人巨细胞病毒pp65蛋白（HCMVpp65）抗原血症检测已被认为是预测活动性感染非常好的指标。但临床医生对移植患者此项检查的最佳时机掌握并不十分准确。本文拟探讨HCMVpp65抗原移植患者阳性率、移植术后HCMVpp65抗原检测的最佳时期。方法①回顾性分析100例次HCMVpp65抗原检测，计算阳性率。②对10例HCMVpp65阳性患者，计算初次阳性出现时期例数分布情况。结果①移植患者术后HCMVpp65抗原阳性率为10．0％；②HCMVpp65抗原术后检测出现阳性时期集中在术后第一至三个月，此后极少。结论①肾移植患者术后HCMVpp65抗原阳性率为10．0％。②术后第一至三个月患者易感HCMV，为HCMVpp65抗原高密度检测最佳时期，第四个月至1年可低密度监测。     

榄香烯联合热疗对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响

目的观察榄香烯联合热疗对人神经胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响。方法将培养的U251细胞随机分为4组,其中A组加常规培养液,B、C、D 3组分别进行单纯热疗、单纯榄香烯及榄香烯联合热疗培养。分别通过细胞形态学、MTT法、DNA断端末端标记(TUNEL)法及流式细胞仪法,检测U251细胞增殖及凋亡情况。结果 B、C、D 3组细胞增殖抑制率及凋亡率均升高,但以D组最明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论榄香烯联合热疗对胶质瘤U251细胞具有抑增殖及促凋亡作用。     

CD82/KAI1在神经胶质瘤细胞株中的表达及对细胞迁移能力的影响

目的 研究CD82/KAI1在胶质瘤CHG-5及U251细胞株的表达及意义.方法 RT-PCR、免疫细胞化学、免疫荧光检测CHG-5及U251细胞中CD82/KAI1的表达;分别设立1∶100、1∶200 CD82/KAI1抗体干预组和空白对照组,通过划痕实验对CD82/KAI1对细胞迁移能力的影响进行分析.结果 ①U251细胞中CD82/KAI1的mRNA表达高于CHG-5细胞(P<0.01);U251细胞中CD82/KAI1的蛋白水平表达高于CHG-5细胞(P＜0.01).②CD82/KAI1抗体干预组迁移细胞数量均显著高于对照组(P<0.05),且迁移细胞数量随抗体浓度升高而增加(P<0.05).结论 CD82/KAI1在恶性胶质瘤细胞株中表达,且在U251细胞中表达较CHG-5细胞高.CD82/KAI1可抑制胶质瘤U251细胞的迁移.     

性病患者血清HCMV pp65特异性IgM表达水平

目的建立检测人HCMV pp65特异性lgM的酶联捕获技术,并分析性病患者HCMV感染状态。方法利用抗人IgM（μ链特异性）抗体包被固相载体,采用辣根过氧化物酶（HRP）标记HCMV pp65单克隆抗体或HCMV pp65抗原,建立抗体捕获HCMV pp65特异性IgM酶联免疫技术。用该法检测688例性病患者及450名健康献血员血清样本,并与HCMV-pp65抗原表达水平进行比较。结果性病患者血清HCMV pp65-IgM阳性分别为274例（39.8%,酶标抗体法）和262例（38.1%,酶标抗原法）,与正常对照组（0.89%）存在显著性差异（P〈0.05）。酶标抗体法与酶抗原法在抗体捕获HCMV pp65特异性IgM检测时无显著性差异（P〉0.05）,阳性符合率95.6%,且不受类风湿因子（RF）的影响。结论酶联捕获HCMVpp65特异性lgM法具有简便、快速、特异和敏感等特点,可诊断HCMV活动性感染。     

人白细胞介素-33在胶质瘤中高表达并能促进胶质瘤细胞U251的侵袭作用

目的:探讨人白细胞介素(interleukin,IL)-33在胶质瘤中的表达及在胶质瘤细胞U251侵袭中的作用?方法:采用免疫组化法检测了16例正常脑组织及86例不同级别胶质瘤标本IL-33蛋白的表达情况;应用Transwell小室检测IL-33对U251侵袭的影响;应用Western blot检测IL-33对胶质瘤细胞NF-κB及其磷酸化状态的影响?结果:免疫组化结果显示,IL-33在胶质瘤组织中表达高于正常脑组织(54.65% vs. 6.25%,P < 0.001)?IL-33在低级别胶质瘤(WHO Ⅰ?Ⅱ级)和高级别胶质瘤(WHO Ⅲ?Ⅳ级)组织中的阳性表达率分别为17.4%和68.3%(P < 0.001)?体外胶质瘤细胞的功能试验中,IL-33能促进U251细胞的侵袭(P < 0.05),并伴随NF-κB蛋白表达上调(P < 0.05)?结论:IL-33在胶质瘤中高表达,IL-33可能通过促进胶质瘤细胞NF-κB磷酸化,从而促进胶质瘤细胞的侵袭能力,对IL-33作用机制的进一步研究将为胶质瘤的临床治疗提供新思路?     

重组改构人TNF-α联合顺铂对人胶质瘤U251细胞的生长抑制作用

目的:观察重组改构人肿瘤坏死因子α(rmhTNF-α)联合顺铂(CDDP)对人胶质瘤细胞生长的抑制作用.方法:人胶质瘤U-251细胞分为对照组(不加药);T组:加入rmhNF-α(20μg/L);C组:加入CDDP(2 mg/L);T C组:加入rmhTNF-α(20μg/L)及CDDP(2 mg/L).MTT法检测细胞生长抑制率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期变化情况,用免疫组织化学方法检测细胞PCNA、Bcl-2、P170蛋白的表达情况.结果:T组、C组细胞生长抑制率、细胞凋亡率均高于对照组(P＜0.05),T C组细胞生长抑制率、细胞凋亡率均高于其他各组(P＜0.05).T组PCNA-LI、Bcl-2蛋白表达低于对照组(P＜0.05),T C组PCNA-LI、Bcl-2蛋白表达均明显低于其他各组(P＜0.05),对照组、T组及T C组P170蛋白表达低于C组(P＜0.05).结论:rmhTNF-α能抑制人胶质瘤细胞生长,其机制与诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖活性有关,且rmhTNF-α与CDDP联用有协同增效作用.     

lncRNA SNHG30基因敲除通过抑制PHF5A表达影响胶质瘤U251细胞增殖

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)SNHG30基因敲除对胶质瘤U251细胞增殖能力的影响及可能的机制。 方法根据人源SNHG30基因序列特征构建px330-sgRNA质粒并转染U251细胞。采用PCR方法和测序鉴定筛选敲除SNHG30基因的U251细胞株。通过GEPIA2网站分析SNHG30在胶质瘤中的表达情况,CCK-8检测SNHG30敲除对U251细胞增殖的影响,使用CYTOSCAPE软件进行关键基因PHF5A分析并进行qRT-PCR验证。 结果成功获得一株SNHG30基因完全敲除的U251细胞株。SNHG30在胶质瘤组织中高表达,而SNHG30基因敲除U251细胞株的增殖能力和PHF5A的表达量降低。 结论lncRNA SNHG30基因敲除的U251细胞株增殖能力下降,可能与其抑制PHF5A的表达有关。     

ING4蛋白对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨ING4(inhibitor of growth family4)蛋白对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响.方法 用PEI转染ING4蛋白过表达(pEGFP-C2/ING4转染组)及阴性对照载体(pEGFP-C2转染组)至人胶质瘤U251细胞,G418筛选后建立ING4蛋白稳定表达细胞株;RT-PCR、免疫...     

雷公藤甲素对U251细胞自噬活性的影响及机制研究

目的 探讨雷公藤甲素对U251细胞自噬活性的影响及机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测雷公藤甲素对U251细胞的增殖抑制率、半数抑制浓度(IC50);免疫荧光化学法测定细胞中LC3-Ⅱ表达,Western blot法测定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、磷酸化P70、磷酸化Erk、磷酸化AKT蛋白的表达.结果 雷公藤甲素作用于U251细胞后,细胞增殖受抑制,24 h的IC50为0.73 μmol/L,48 h的IC50为0.27μmol/L.免疫荧光法测定6、12、24 h后LC3-Ⅱ水平增高;Western blot法测定LC3-Ⅱ水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随时间增高;Beclin-1水平增高,磷酸化P70、磷酸化Erk表达降低、磷酸化AKT无明显变化.结论 雷公藤甲素可抑制U251细胞增殖并促进自噬,并可通过上调Beclin-1表达和抑制mTOR的活性来促进自噬.     

重组人巨细胞病毒pp65蛋白与金叶败毒颗粒联合抗人巨细胞病毒效应

目的 比较重组人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白与中药金叶败毒颗粒的抗HCMV作用并探讨二者间的关系.方法 用重组HCMV pp65蛋白刺激培养的人外周血单个核细胞,制备HCMV抗原特异性细胞毒T细胞,即pp65-CTL.分别将pp65-CTL、金叶败毒颗粒、pp65-CTL 金叶败毒颗粒、更昔洛韦作用于HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HEL),比较各组对HEL细胞病变的抑制作用,同时用RT-PCR法半定量检测作用前和作用不同时间点HCMV mRNA表达水平的变化.结果 pp65-CTL组在HEL细胞感染后72 h才开始出现少许细胞病变,有显著抗HCMV作用;pp65-CTL 金叶败毒颗粒组作用不同时间点对HCMV mRNA表达及HCMV所致细胞病变的抑制作用明显强于单一用药.结论 重组HCMV pp65蛋白刺激培养的pp65-CTL对HCMV有明显的抑制作用,与中药金叶败毒颗粒有显著的协同作用,可共同应用于HCMV活动性感染的治疗.     

冬凌草甲素诱导人脑胶质瘤U251细胞的凋亡及其机制

目的 研究冬凌草甲素对人脑胶质瘤U251细胞体外生长抑制及诱导凋亡的作用及其机制。方法 MTT法检测冬凌草甲素对U251细胞的生长抑制作用;倒置显微镜法和荧光显微镜Annexin V-FITC/PI双染色法观察细胞的形态学变化;流式细胞仪Annexin V FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率;Realtime PCR法检测冬凌草甲素作用U251细胞后的bcl 2、bax及caspase-3基因表达水平的变化。结果 冬凌草甲素对U251细胞有明显的生长抑制作用（P<0.05）,呈明显的时间和浓度效应关系。冬凌草甲素作用U251细胞24h后出现明显的细胞凋亡形态学改变。随着冬凌草甲素作用浓度增加,凋亡和坏死细胞数均增加,浓度越高,诱导细胞凋亡的作用越明显（P均 <0.05）。随着冬凌草甲素作用时间延长,U251细胞的bax和caspase-3基因的表达逐渐增强,bcl-2基因的表达逐渐减弱（P均<0.05）。结论 冬凌草甲素能诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡,其凋亡机理可能与bax和caspase 3基因表达的上调,bcl-2基因表达的下调相关。     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

抑制α-烯醇化酶的表达可降低胶质瘤细胞的糖代谢和生长

目的 探讨抑制α-烯醇化酶(ENO1)表达对胶质瘤细胞糖代谢和细胞生长的影响.方法 在胶质瘤细胞U251中,利用siRNA抑制ENO1表达后,利用葡萄糖摄取和乳酸生成实验检测糖代谢水平的改变;利用3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)和5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EDU)着色的方法检测细胞增殖和细胞周期的改变.Western blot活性分析抑制ENO1表达糖代谢标志基因Hexokinase 2(HK2)和Lactate dehydrogenase A(LDHA)基因的表达水平改变.结果 成功筛选了抑制ENO1的siRNA片段.在抑制ENO1表达,胶质瘤U251细胞摄取葡萄糖的能力明显降低(P=0.023)以及乳酸生成能力明显下降(P=0.007).进一步,MTT和EDU着色分析显示,在抑制ENO1表达后,细胞的增殖能力从第2天开始明显降低(P<0.05);除此之外,细胞周期G1/S转化能力明显抑制(P=0.0425).机制分析显示,ENO1下调后糖代谢标志基因HK2和LDHA表达也明显下降.结论 ENO1作为候选癌基因,通过正调控葡萄糖代谢从而促进了胶质瘤细胞的生长.     

LRRC4通过MAPK信号通路阻滞U251细胞于G0/G1期

目的:探讨脑胶质瘤抑瘤基因LRRC4通过MAPK信号通路阻滞U251细胞于G0/G1的机制.方法:通过脂质体转染法将LRRC4基因转染至U251细胞,G418筛选构建稳定转染的LRRC4/U251细胞株并验证LRRC4的阳性表达;通过Western-blot检测LRRC4对MAPK信号通路的关键分子ERK,JNK及P38的表达影响;流式细胞仪、荧光素酶活性检测分析LRRC4对U251细胞周期及细胞周期素(cyclin D1)的影响.结果:LRRC4能够下调磷酸化ERK的表达,上调总蛋白JNK2和磷酸化c-Jun的表达.LRRC4下调了U251细胞中突变型P53的表达,以及cyclin D1的启动子活性和它的表达.LRRC4的重表达将U251细胞阻滞于G0/G1期.结论:LRRC4主要通过MAPK通路的关键分子JNK2上调磷酸化的c-Jun,抑制突变型的P53的表达,进而下调cyclin D1的启动子活性和cyclin D1的表达,将U251细胞阻滞于G0/G1期.