人肺腺癌细胞系A549与正常支气管上皮细胞系HBE的比较蛋白质组学研究

目的利用蛋白质组学技术建立人肺腺癌细胞系A549与正常支气管上皮细胞系HBE的差异蛋白质表达谱,并对部分在A549细胞中表达明显上调的蛋白质点进行鉴定。方法提取A549和HBE细胞的总蛋白,进行双向凝胶电泳(2-DE),经图像分析识别差异表达蛋白质点,再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定出部份在A549细胞中表达明显上调的蛋白质。结果 (1)分析两种细胞系的2-DE图谱,发现差异表达蛋白质点共256个,仅在A549细胞中表达的蛋白质点15个,仅在HBE细胞中表达的蛋白质点21个;(2)通过肽质量指纹图谱分析鉴定出在A549细胞中表达明显上调的7种蛋白质,分别是表皮生长因子受体(EGFR)、鼠双微粒体2蛋白(MDM2)蛋白、CD44蛋白、细胞骨架蛋白细胞角蛋白8(CK8)、不均一性核糖体蛋白H(hnRNP H)、热休克蛋白60(HSP60)、磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)。结论运用蛋白质组学技术成功获得了A549细胞与HBE细胞的2-DE图谱,并鉴定出部分在A549细胞中表达明显上调的蛋白质,为进一步筛选用于人肺腺癌诊断、治疗及预后评估的分子标志物奠定了一定的基础。     

P53siRNA对肺腺癌细胞A549中HMGN2表达的影响

目的 探讨P53基因调节人肺腺癌细胞A549中HMGN2蛋白表达情况.方法 采用小分子干扰RNA(P53-siRNA)真核细胞转染人肺腺癌细胞株A549作为实验组P53-si,转染无荧光RNA的A549细胞为空白对照组con-si,未转染任何载体的A549细胞为正常对照组con.Western blot检测HMGN2和P53表达的变化.结果转染P53-siRNA的实验组A549细胞株中HMGN2蛋白表达下调,空白对照组和正常对照组A549细胞中HMGN2的表达均无明显变化;相对于正常对照组,HMGN2的表达率分别为:实验组56％,空白对照组88％(P＜0.01).结论 P53基因能下调人肺腺癌细胞中HMGN2的活性,参与调控HMGN2蛋白的表达,从而为P53基因参与调节HMGN2在小鼠发育过程的机制研究提供实验基础.     

GPC5基因在肺腺癌细胞系中的功能研究

目的 研究GPC5基因在肺腺癌细胞系中的表达情况及其对肺腺癌细胞系生物学行为的影响.方法 采用逆转录PCR (RT-PCR)、实时定量PCR (qRT-PCR)以及Western blot分析肺腺癌细胞系中GPC5基因mRNA及蛋白表达情况;构建GPC5过表达载体及干扰载体,通过转染构建GPC5过表达细胞系及GPC5沉默细胞系;利用CCK-8法分析肺腺癌细胞系生长情况;通过流式细胞术检测肺腺癌细胞系的周期及凋亡变化.结果 检测了GPC5基因在4株肺腺癌细胞系(A549、H1299、H358和H1975)和1株肺正常上皮细胞系(HBE)中的mRNA表达情况,发现与HBE细胞系相比,GPC5基因在A549细胞系中呈低表达,在H1299细胞系中高表达,同时蛋白检测结果与mRNA水平一致;A549细胞中过表达GPC5基因可抑制细胞生长,引起细胞周期阻滞;在H1299细胞中干扰GPC5基因表达促进细胞生长,促进细胞周期;在过表达和干扰细胞模型中均未发现GPC5基因对细胞凋亡的显著影响.结论 GPC5基因可以对肺腺癌细胞系的生物学行为产生影响,可能是肺腺癌的抑癌基因.     

热休克蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义

目的 :研究热休克蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达与膀胱移行细胞癌临床及病理的关系。方法 :采用免疫组织化学技术检测HSP70、HSP90在 30例膀胱移行细胞癌和 15例膀胱良性病变或正常组织中的表达情况。结果 :HSP70和HSP90在膀胱移行细胞癌中阳性表达率分别为 10 0 % (30 /30 )和 96 .7% (2 9/30 )。HSPs在膀胱移行细胞癌中的阳性表达率显著高于良性病变或正常组织 (P <0 .0 1) ,而且HSP70和HSP90在膀胱移行细胞癌中的表达阳性强度随肿瘤分化程度的降低而升高 (P <0 .0 1)。结论 :不同类型的HSPs表达阳性强度与膀胱移行细胞癌的分化程度密切相关。测定HSPs在膀胱移行细胞癌中的表达 ,可以判定其分化程度 ,为临床判断预后及疗效 ,制定治疗方案提供了重要参考指标。     

miR-630在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的研究miR-630在人肺癌组织中的表达,探讨miR-630对肺腺癌细胞系（A549）细胞迁移侵袭的影响及其机制。方法收集37例肺腺癌组织标本及癌旁正常肺组织,通过RT-PCR检测各标本中miR-630、SOX4mRNA的表达情况,Pearson相关分析检验miR-630与SOX4的相关性;通过转染miR-630mimic和miR-630NC至离体培养的A549细胞中,Westernblot检测A549细胞中COL1A1、COL1A5、SOX4的表达情况,划痕试验和Transwell法观察细胞迁移侵袭情况,荧光素酶素试验验证SOX4是miR-630的靶基因。结果与癌旁正常肺组织比较,miR-630在肺腺癌组织中的表达降低（P＜0.05）;肺腺癌组织中SOX4mRNA的表达增加（P＜0.01）;miR-630与SOX4mRNA的表达量呈负相关（r=-0.344,P＜0.01）。与对照组比较,转染miR-630mimic后A549细胞的迁移侵袭减少（P＜0.01）,细胞中COL1A1、COL1A5、SOX4的表达减少（均P＜0.05）;荧光素酶试验结果显示,miR-630能够降低SOX4-3′-UTR质粒的荧光素活性（P＜0.05）。结论miR-630在肺腺癌组织中低表达;miR-630可能是通过下调SOX4抑制A549细胞的迁移和侵袭。     

HOXA10在肺腺癌中的过表达及其临床意义

目的 研究肺腺癌组织和细胞系中HOXA10的表达及其临床意义.方法 运用免疫组织化学方法检测75例肺腺癌及其癌旁组织中HOXA10的表达情况,并分析HOXA10的表达与患者的临床特征及5年生存率的相关性.此外利用反转录PCR、Western blot及免疫荧光染色检测正常肺支气管上皮细胞系HBE以及4种肺腺癌细胞系H322、H1650、A549、H1975中HOXA10的表达情况.结果 HOXA10主要表达于胞浆中,且于75例肺腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01),并与肿瘤的浸润深度(P＜0.05)及淋巴结转移(P＜0.01)有关.而HOXA10高表达与低表达的肺腺癌患者的5年生存率没有显著差异(P＞0.05).反转录PCR、Western blot及免疫荧光染色的结果显示HOXA10在肺腺癌细胞系中的表达明显高于正常肺支气管上皮细胞系.结论 HOXA10高表达于肺腺癌及肺腺癌细胞系中,这可能与肺腺癌的侵袭和恶性淋巴结转移的程度密切相关.     

热休克蛋白70与心肌保护

热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs),也称应激蛋白,是生物体或离体培养细胞在应激状态下产生的一类内源性保护蛋白,根据同源程度及相对分子质量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPs等几个家族。由于HSP70在正常细胞中水平较低,应激状态下可显著升高,目前成为HSPs中最为关注、研究最深入的一个家族[1]。近年研究发现,缺血/再灌注心肌中有HSP70的表达,通过多种机制产生心肌保护作用。1概述1.1 HSP70的分类、表达及分布HSP70家族主要包括Hsp72、Hsp73、Grp78、Grp75四个成员,按表达情况分为诱导型和结构型[1-…     

STAT3、MRP、LRP在肺腺癌A549及A549/CARP耐卡铂细胞株中的表达及关系的研究

目的:探明STAT3与肺腺癌细胞多药耐药之间的关系.方法:采用免疫组化法测定A549及A549/CARP耐卡铂细胞株中STAT3、LRP、MRP蛋白表达情况.结果:STAT3在A549组、A549/CARP组中阳性细胞数无显著性差异(t=1.519,P＞0.05);LRP、MRP在A549组、A549/CARP组中阳性细胞数有显著性差异(t=3.350,P＜0.01)(t=3.747,P＜0.01);STAT3、LRP、MRP之间表达均无相关性(r=0.061,P＞0.05).结论:STAT3并未直接参与介导肺腺癌的多药耐药性;LRP、MRP均参与了诱导肺腺癌的耐药,但二者之间无相关性;STAT3信号传导途径与LRP、MRP蛋白的激活机制可能无关.     

人肺腺癌A549细胞株中HSP70多肽复合物的分离与纯化

目的:探讨肺腺癌细胞中热休克蛋白70多肽复合物分离及纯化的方法.方法:采用裂解液裂解、超声破碎、ConA-Sepharose亲和层析、ADP-agarose亲和层析结合DEAE阴离子交换层析方法,从体外培养的热休克(43℃)处理后的人肺腺癌细胞株A549中分离纯化HSP70多肽复合物,通过SDS-PAGE电泳、Western-blot检测获得蛋白.结果:获得蛋白的相对分子质量约为70 000,能与抗HSP70特异单抗结合.结论:采用ConA-Sepharose亲和层析、ADP-agarose亲和层析结合DEAE阴离子交换层析从肺腺癌细胞株A549中可获得高纯度的HSP70多肽复合物,为进一步研究以HSP70多肽复合物为基础的肺癌免疫治疗提供了依据.     

4-HPR体外诱导A549细胞凋亡与Bax/Bak蛋白相关性研究

目的:观察4-HPR对肺腺癌细胞A549凋亡的影响并探讨其机制。方法:不同剂量4-HPR处理A549细胞,倒置显微镜观察A549细胞形态学变化和对细胞生长的抑制作用,Hoechst33258染色观察凋亡情况,Western Blot分析凋亡相关蛋白Bax/Bak等的表达。结果:细胞数目随药物浓度增加而减少,失去正常生长,光泽度下降,变小变圆;细胞凋亡程度随药物浓度增加而增强,细胞核肿胀变圆,致密浓染或碎裂;凋亡过程,Bax/Bak、P53表达明显增加。结论:4-HPR可明显抑制肺腺癌A549细胞的增殖,增加Bax/Bak、P53的表达,促进A549凋亡,为进一步探讨4-HPR治疗肺腺癌的机制提供实验依据。     

干扰素对肺腺癌A549细胞B7-H4分子表达的影响

目的:探讨IFN-α和IFN-γ对人肺腺癌细胞株A549 B7-H4 mRNA和蛋白表达的影响。方法:用不同浓度(100、500、1 000、2 000 U.ml-1)IFN-α和IFN-γ分别处理A549细胞,未经药物处理细胞作对照(对照组)。用MTT法观察细胞增殖活性的差异,RT-PCR观察B7-H4 mRNA表达水平的变化,蛋白质印迹法观察B7-H4蛋白表达水平的变化。结果:IFN-α和IFN-γ对人肺腺癌细胞株A549增殖有抑制作用,其抑制效应具有时间和剂量依赖性(P<0.05)。随着IFN-α浓度的增加,B7-H4分子mRNA和蛋白表达增强(P<0.05),而IFN-γ对B7-H4分子mRNA和蛋白表达影响不明显(P>0.05)。结论:IFN-α和IFN-γ均可抑制人肺腺癌A549细胞株的增殖;IFN-α可增强B7-H4mRNA和蛋白水平的表达,而IFN-γ对B7-H4分子mRNA和蛋白表达影响不明显。     

靶向Ku70基因siRNA对人肺腺癌细胞顺铂耐药性的逆转作用

目的：研究Ku70与人肺腺癌耐药的相关性,观察调控Ku70表达能否逆转人肺腺癌耐药细胞系（A549/DDP）的耐药性。方法：采用RT-PCR、Western Blotting方法比较Ku70在人肺腺癌亲代细胞（A549）与耐药细胞系（A549/DDP）的表达水平。转染靶向Ku70基因siRNA（si-Ku70）的A549/DDP细胞作为实验组,转染非特异性siRNA（si-Scramble）的A549/DDP细胞作为阴性对照组,同时设空白组(A549/DDP细胞)。加药组在转染后48 h给予顺铂。应用MTT法检测各组细胞在顺铂作用下的生存率,并计算半数抑制浓度（IC₅₀）,采用流式细胞仪定量检测细胞凋亡率;采用分光光度法检测Caspase-3活化程度。结果：Ku70 mRNA和蛋白在A549/DDP细胞表达水平显著高于其亲代A549细胞（P<0.01）;靶向Ku70的siRNA（si-Ku70)明显下调A549/DDP细胞的Ku70 mRNA和蛋白表达水平（P<0.01）;在不同浓度顺铂作用24 h后,实验组细胞的生存率明显低于阴性对照组和空白组（P<0.01）。6 mg/L顺铂作用24 h后,实验组细胞凋亡率及Caspase-3活化程度高于阴性对照组和空白组（P<0.05）。结论：Ku70在人耐药肺腺癌细胞呈现高表达,提示Ku70参与肺腺癌耐药的形成;靶向Ku70siRNA导入人肺腺癌耐药细胞可特异性下调Ku70的表达,促进肺腺癌耐药细胞凋亡,逆转其耐药性,Ku70可能成为逆转肺癌耐药的一个新的分子靶点。     

叉头蛋白3对肺腺癌细胞增殖和化疗药物顺铂敏感性的影响

目的：观察叉头蛋白3（FOXP3）在人肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞增殖和顺铂敏感性的影响，阐明肺腺癌细胞对顺铂耐药的相关机制。方法：收集肺腺癌患者术后石蜡标本50例和正常肺组织10例。免疫组织化学染色方法检测肺腺癌组织和正常肺组织中FOXP3和Ki-67的表达，分析肺腺癌组织和正常肺组织中FOXP3阳性表达率的差异，Pearson相关分析法分析FOXP3和Ki-67表达的相关性。选取对数生长期的人肺腺癌A549细胞进行siRNA转染，将A549细胞分为Mock组（转染脂质体）、Control-siRNA组（转染Control-siRNA）和FOXP3-siRNA组（转染FOXP3-siRNA）。RT-qPCR法检测各组A549细胞中FOXP3 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组A549细胞中FOXP3蛋白表达水平，CCK-8法检测各组A549细胞增殖活性及不同浓度（0、0.63、1.25、2.50和5.00mg·L^-1）顺铂作用后各组A549细胞生长抑制率，RT-qPCR和Western blotting法检测顺铂作用后各组A549细胞中FOXP3 mRNA和蛋白表达水平。结果：FOXP3在肺腺癌和正常肺组织的阳性表达率分别为62.0%和13.3%，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；FOXP3和Ki-67在肺腺癌组织中表达呈正相关关系（r=0.370，P<0.01）；FOXP3-siRNA组A549细胞中FOXP3 mRNA和蛋白表达水平均明显低于Mock组和Control-siRNA组（P<0.01）；顺铂作用48和72 h后，FOXP3-siRNA组A549细胞增殖活性明显低于Mock组和Control-siRNA组（P<0.05）；1.25、2.50和5.00 mg·L^-1顺铂作用后，FOXP3-siRNA组A549细胞生长抑制率均高于Mock组和Control-siRNA组（P<0.05）；1.25和2.50 mg·L^-1顺铂组A549细胞中FOXP3 mRNA和蛋白表达水平均明显高于0 mg·L^-1顺铂组（P<0.05）。结论：沉默FOXP3可抑制肺腺癌细胞的增殖，增加肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。     

反义T-STAR基因转染降低肺腺癌A549细胞端粒酶活性

目的通过反义技术抑制肺腺癌A549细胞T-STAR (testes-signal transduction and activator of RNA)基因内源性表达,观察对细胞端粒酶活性的影响.方法用阳性脂质体法将T-STAR反义基因转染入A549细胞,用RT-PCR及Western blot方法检测转染细胞内源性T-STAR基因mRNA和蛋白表达水平,并用PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性改变.结果反义基因可在mRNA及蛋白水平有效抑制肺腺癌A549 T-STAR基因的表达,同时明显降低细胞端粒酶活性.结论肺腺癌A549细胞T-STAR基因表达的抑制可能下调端粒酶活性.     

Pokemon基因与顺铂作用关系的初步探讨

目的 探讨Pokemon基因与顺铂作用机制的相关性.方法 体外培养人肺腺癌细胞株(A549、AGZY83-a),人肺鳞癌细胞株(HE-99),人肺巨细胞癌细胞株(95D)等4种肺癌细胞株,实验组在培养过程中加入顺铂,对照组在培养过程不加入顺铂;应用RT-PCR、Western印迹检测两组Pokemon基因mRNA和蛋白表达的情况.结果 4种细胞株中Pokemon mRNA及蛋白均呈较高表达.实验组中细胞株经顺铂作用后Pokemon基因表达没有明显变化,与对照组相比差异无统计学意义(均P>0.05).结论 顺铂对A549、AGZY83-a、HE-99、95D细胞株中Pokemon基因的表达没有明显影响.     

CUGBP1在人肺腺癌组织和细胞中的表达

目的比较分析CUGBP1基因在人肺腺癌组织和细胞内表达的特点,及其CUGBP1表达水平与癌细胞增殖活性的关系。方法以人肺腺癌组织标本和人肺腺癌细胞株A549为研究对象,应用免疫组化、WesternBlot、RT—PCR方法检测人肺腺癌组织、细胞内CUGBP1蛋白和基因的表达,并分析其特点。结果CUGBP1基因主要在人肺腺癌组织的细胞核呈强阳性表达,在所有类型腺癌组织中80％以上的癌巢细胞CUGBPl基因呈阳性表达,阳性表达率明显高于正常对照组,差异有显著性（t=100．01,P＜0．001）。95％以上的A549细胞CUGBP1表达呈阳性,且CUGBP1表达量明显低于LPS组,差异有显著性（t=407．53,P＜0．001）。结论CUGBPl基因在人肺腺癌癌巢细胞和A549细胞的胞核内高表达;炎性刺激可增强人肺腺癌细胞株A549的增殖和CUGBPl基因表达;CUGBP1基因可能成为人肺腺癌的早期诊断和增殖状态判断的新指标。     

γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对肺腺癌细胞A549增殖的影响

目的观察γ分泌酶抑制剂MW167阻断Notch信号对肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法正常氧条件下培养肺腺癌细胞A549,通过Western blotting及RT-PCR方法检测Notch受体各亚型的表达。在正常氧条件下,不同浓度(5、10、20μmol/L)MW167处理肺腺癌细胞A549(加药组),48 h后采用Western blotting方法检测Notch1蛋白表达的变化,采用RT-PCR方法检测Notch信号通路下游基因HES1mRNA表达的变化,应用MTT法检测MW167对细胞增殖的影响;每个浓度设二甲基亚砜对照组。结果 Notch1～4各亚型在A549细胞均有表达。5、10、20μmol/L MW167处理肺腺癌A549细胞48 h后,各加药组与对照组相比,Notch1蛋白表达升高(P<0.05),而HES1 mRNA表达下降(P<0.05),随MW167浓度升高,对HES1 mRNA表达的抑制率逐渐升高(r=0.927,P<0.01)。MTT法检测结果显示各加药组吸光度高于对照组(P<0.05),且随MW167浓度升高,细胞增殖率相应升高(r=0.904,P<0.01)。结论在正常氧条件下,MW167可阻断Notch信号通路,对A549细胞起促增殖作用;Notch1信号通路可能在A549细胞中起一定抑癌作用。     

人金属硫蛋白1H基因对肺腺癌细胞A549耐药性的影响

目的：探讨金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因对人肺腺癌A549细胞耐药性的影响．方法：构建真核表达载体pcDNA3．1（-）-MT1H,利用脂质体介导将其转染肺腺癌A549细胞,G418筛选阳性克隆．分别以RT—PCR和Western方法检测MTIH mRNA和蛋白表达情况,MTT法检测细胞对顺铂的药物敏感性;流式细胞仪（FCM）检测顺铂诱导细胞凋亡率．结果：转染pcDNA3．1（-）-MT1H的细胞,其MT1H mRNA和蛋白表达水平显著高于亲本细胞及转染空载体细胞,细胞对顺铂药物敏感性明显下降,顺铂诱导的凋亡率明显降低．结论：MT1H能促进A549细胞耐药,可能和降低顺铂诱导细胞凋亡有关．     

hTERT启动子特异性调控炭疽毒素致死因子表达以杀伤人肺腺癌A549细胞的研究

目的观察人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)靶向调控炭疽毒素致死因子(LF)表达对人肺腺癌A549细胞活力及凋亡/坏死的影响。方法构建含hTERTp或CMV启动子(CMVp)且表达LF的真核质粒表达载体(phTERTp-LF或pCMV-LF),分别转染人肺腺癌A549细胞株和正常人胚肺成纤维MRC-5细胞株。针对A549、A549hTERTp-LF、A549CMVp-LF、MRC-5、MRC-5hTERTp-LF、MRC-5CMVp-LF六组细胞,分别采用RT-PCR和Western blot检测LF mRNA和蛋白表达,用MTT分析检测细胞活力,用流式细胞仪检测细胞凋亡/坏死。结果与A549组比较,A549hTERTp-LF组、A549CMVp-LF组均出现明显的LF mRNA和蛋白表达,以及细胞活力降低和凋亡/坏死率上升;与A549hTERTp-LF组相比,A549CMVp-LF组LF mRNA和蛋白表达更高,细胞活力降低和凋亡/坏死率上升更明显。与MRC-5组比较,MRC-5hTERTp-LF组也不能测出LF mRNA和蛋白表达,细胞活力和凋亡/坏死率亦无明显变化,但MRC-5CMVp-LF组的LF mRNA和蛋白表达上升,细胞活力降低和凋亡/坏死率增加。结论 hTERTp能特异性地驱动LF表达并杀伤人肺腺癌A549细胞,但避免了对MRC-5细胞的毒性,可望提供一种针对肺腺癌细胞且不良反应小的靶向治疗策略。