ABCG2/Bcrpl基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达

目的探讨ABCG2／Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达及意义。方法建立大鼠2-乙酰氨基芴／三分之二肝切除模型，二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心分离大鼠肝脏卵圆细胞，采用荧光定量PCR技术检测ABCG2／Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞和肝细胞中的表达水平，免疫组织化学、免疫荧光双标染色和Westernblot方法检测该转运蛋白的表达。结果大鼠肝卵圆细胞中ABCG2／Bcrp1基因的表达水平是肝细胞的13．8倍，ABCG2／Bcrp1蛋白相对分子质量大小为72000，定位于卵圆细胞膜。其表达位于门脉区周围，并向肝小叶延伸。免疫荧光双标染色显示与OV-6共表达。结论大鼠肝卵圆细胞表达高水平的ABCG2／Bcrp1，后者参与肝干细胞免受外源性化学物质损伤的自我保护机制。     

胰腺癌细胞F1t-1受体表达与p53、ras基因突变的关系

目的　探讨胰腺癌细胞Flt- 1受体表达与p5 3、ras基因突变之间的关系,了解Flt- 1受体表达与p5 3、ras基因突变在胰腺肿瘤血管形成中的作用。方法　采用免疫组织化学EnVisionTM方法检测40例原发性胰腺癌组织Flt- 1受体和p5 3、ras基因的表达;采用χ2 检验分析Flt- 1受体表达与p5 3、ras突变基因的相关性。结果　Flt- 1受体和p5 3、ras基因的阳性表达率分别为77.5 %(3 1/4 0 )和5 0 % (2 0 /4 0 )、60 % (2 4/4 0 )。经连续切片对比分析表明,在Flt 1受体表达较高的区域,p5 3、ras基因的表达亦较强,Flt 1受体表达与p5 3基因突变呈显著相关性(χ2 =4.3 5 ,P <0 .0 5 ) ,但与ras基因表达之间无显著相关性(χ2 =2 .12 ,P >0 .0 5 )。结论　胰腺癌细胞Flt 1受体表达与p5 3基因突变之间有显著相关性,与ras基因突变之间无显著相关性,提示野生型p5 3基因发生突变可能会失去抑制Flt 1受体表达的功能,从而导致胰腺肿瘤血管的新生,促进肿瘤细胞生长;ras突变基因可能通过其他的途径参与胰腺肿瘤新生血管的形成。     

大鼠肝卵圆细胞的体外分离、培养及脾内移植

我们在成功建立和优化大鼠肝卵圆细胞增殖模型的基础上[1,2 ] ,在体外对大鼠肝卵圆细胞进行分离与培养 ,并将其移植入同种异体大鼠脾脏内 ,观察其在脾内的演变结果 ,为肝干细胞移植的临床应用提供实验依据。一、材料与方法1.大鼠肝卵圆细胞分离 :采用本室建立和改进的体外两步灌流法分离大鼠肝实质细胞和非实质细胞[3 ] ;所获细胞先用 5 0g离心 ,沉淀即为肝实质细胞 ,上清液中富含肝卵圆细胞 ,上清液采用 5 0 0g进行离心 ,沉淀物中富含肝卵圆细胞 ,加F12培养液悬浮细胞 ,再用相同条件离心 ,反复 3次 ,将沉淀物用F12培养液制备成细胞悬液 ;…     

Activin A suppressed hepatic oval cell-mediated liver regeneration in vivo

目的 研究Activin A对卵圆细胞介导肝再生的抑制作用及其机制.方法 建立2-乙酰胺基芴/部分肝切除卵圆细胞介导肝再生模型,肝切除后立即经门静脉注射1 μg Activin A(Activin A组),或生理盐水(对照组).肝切除后不同时间点取肝脏标本检测卵圆细胞增殖及肝再生率和磷酸化smad2,p15和p21的表达.结果 Activin A组肝脏中卵圆细胞的增殖及肝再生率均明显低于对照组;Activin A组肝脏中smad2的磷酸化水平及p15,p21的表达水平均高于对照组.结论 Activin A可以通过smad信号通路抑制卵圆细胞介导的肝再生.     

大鼠肝卵圆细胞中matrilin-2的表达及其意义

目的探讨大鼠肝脏再生过程中肝卵圆细胞matrilin-2的表达及其意义。方法利用大鼠部分肝切除(PH)或2-乙酰氨基芴灌胃+/部分肝切除(2-AAF/PH)建立大鼠肝脏再生模型,并设正常对照组。应用免疫组织化学和RT-PCR方法研究肝脏组织中matrilin-2表达情况。结果免疫组化发现正常对照组及PH组肝脏组织中只有极少量的matrilin-2表达位于胆管血管周围及肝窦状隙内,而在2-AAF/PH模型中可见matrilin-2表达位于门静脉周围的肝窦状隙内,RT-PCR发现2-AAF/PH组肝卵圆细胞中matrilin-2mRNA高表达,而PH组及正常对照组成熟肝细胞中无matrilin-2mRNA表达。结论matrilin-2是肝卵圆细胞在肝脏再生过程中产生的重要的细胞外基质蛋白,与肝卵圆细胞的增殖分化过程有密切关系。     

硫氧还蛋白2在2-乙酰氨基芴加肝切除诱导的卵圆细胞中的表达及意义

目的 观察硫氧还蛋白2(Trx2)在2-乙酰氨基芴(2-AAF)加肝切除诱导的卵圆细胞增殖中的表达,并探讨其表达的意义.方法 Balb/c小鼠喂饲2-AAF加2/3肝切除方法诱导肝脏卵圆细胞的增殖.经门静脉灌注消化法和等密度离心法分离卵圆细胞,并在体外进行原代培养.免疫荧光和双标法对培养的细胞进行鉴定.免疫组化法检测卵圆细胞的增殖,免疫荧光法检测Trx2在卵圆细胞和肝实质细胞中的表达,TUNEL法检测卵圆细胞和肝实质细胞的凋亡.结果 喂饲2-AAF后引起肝脏损伤,与肝切除前相比,肝切除后肝脏损伤明显加重(P＜0.01),同时有明显的卵圆细胞增殖.卵圆细胞中Trx2的表达明显高于肝实质细胞,同时其凋亡率明显低于肝实质细胞(P＜0.01).结论 喂饲2-AAF加2/3肝切除可以引起严重的肝损伤,促进卵圆细胞增殖,卵圆细胞高表达Trx2可以抑制自身凋亡和损伤,在肝脏功能的恢复过程中起着非常重要的作用.     

肝脏胞外基质成分参与卵圆细胞介导的肝再生

目的 探讨肝再生中肝脏胞外基质成分与卵圆细胞的相互关系及作用.方法 采用免疫组化及免疫荧光双标的方法动态观察大鼠卵圆细胞增殖模型中肝脏胞外基质成分(层粘连蛋白和纤维连接蛋白)的定位及与卵圆细胞的关系. 结果 肝部分切除后第2天,卵圆细胞开始向门静脉周围区域增殖.层粘连蛋白主要出现在门静脉周围的肝窦状隙内,纤维连接蛋白在整个肝小叶内表达显著增加.术后第4～9天,卵圆细胞进一步向肝实质内增殖,门静脉周围纤维连接蛋白表达增加,中央静脉周围表达减少.层粘连蛋白及纤维连接蛋白与卵圆细胞关系紧密.术后第12～15天,随着卵圆细胞分化为小肝细胞结节,大多数层粘连蛋白及纤维连接蛋白位于结节周边,少数出现在结节内.第18天以后,正常的肝小叶结构开始恢复.结论 卵圆细胞与肝脏胞外基质成分存在紧密联系;局部肝脏微环境可能通过细胞与基质之间的相互作用在卵圆细胞介导的肝再生中发挥重要的调控作用.     

大鼠肝卵圆细胞的电镜观察及SDF-1/CXCR4轴作用研究

目的 本研究通过应用AMD3100封闭卵圆细胞表面CXCR4受体,从而起到抑制趋化因子SDF-1的生物活性,观察大鼠肝卵圆细胞的生长及SDF-1,CXCR4 mRNA表达情况,探讨SDF-1/CXCR4轴在肝卵圆细胞激活、增殖、分化中所起的作用.方法 建立卵圆细胞增殖模型,分为四组,分别为:2-AAF/PH组,AMD3100/PH组,2-AAF/AMD3100/PH组,PH组,重(150±20)g的Wistar大鼠予2-AAF灌喂,联合2/3肝切除,制作卵圆细胞模型,并通过尾静脉注射AMD3100阻断SDF-1的生物学作用,分别在术后的第3、5、7、10、14、21天6个时间点各处死6只大鼠,取肝脏标本行CXCR4和SDF-1 RT-PCR,检测卵圆细胞CXCR4及SDF-1 mRNA的表达情况,并取第10天肝脏透射电镜检查,观察卵圆细胞的超微结构.结果 给予AMD3100抑制SDF-1作用后,肝脏卵圆细胞数量减少,细胞膜受体CXCR4表达下调,同时SDF-1表达也呈下调趋势.结论 抑制SDF-1活性可以在一定程度上减少卵圆细胞的增殖,SDF-1可以通过自分泌或旁分泌途径激活并促进肝卵圆细胞增殖.     

大鼠肝卵圆细胞的形态学及免疫组织化学特征研究

肝卵圆细胞等肝干细胞有可能在肝衰竭及遗传性肝病治疗中发挥重要作用[1 ] 。我们在已建立的大鼠肝卵圆细胞增殖模型基础上 ,对大鼠肝卵圆细胞的形态学参数及细胞表型等生物学特征进行研究。一、材料与方法1.大鼠模型建立 :按照我们建立和改进的方案[2 ] ,选择体重 15 0 ｇ左右的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 (第三军医大学动物研究所提供 ) ,2～ 3个月龄 ,实验前单只分笼饲养 1周以上。实验大鼠通过胃管灌喂2 乙酰氨基芴 (ＡＡＦ ,Ｓｉｇｍａ公司产品 ) ,每天 1次 ,连续 4ｄ ,第 5天在戊巴比妥全身麻醉下行 2 3肝切除 (手术当日不灌喂ＡＡＦ) ,…     

大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞标志分析

目的研究简单易行的成体大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞鉴定方法。方法采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12d切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和RT-PCR分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达。结果分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达。生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性。结论简单易行的肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础。     

D-柠檬烯对人膀胱癌细胞生长和ras p21表达的影响

目的 探讨D-柠檬烯对人膀胱癌EJ细胞生长和ras p21表达的影响.方法 采用还原四氮唑复合物(XTT)、实时定量PCR、蛋白质印迹法,对D-柠檬烯处理后的人膀胱癌EJ细胞增殖、ras基因mRNA表达以及ras p21蛋白表达进行检测,比较用药前后EJ细胞生长和ras p21表达变化.结果 经2、4 mmol/L D-柠檬烯处理后的EJ细胞增殖活性吸光度(A)值分别为0.8014-0.016和0.148±0.008,与未给药组1.218±0.031比较,差异有统计学意义(P<0.05).1 mmol/LD-柠檬烯作用48h,EJ细胞ras p21 mRNA表达数638±9,与未给药组11170±25比较明显下调;rasp21蛋白表达相对值为0.792,与未给药组4.459比较明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 D-柠檬烯对EJ细胞生长具有明显的细胞毒作用,并呈一定的剂量效应关系,在无毒剂量下可促使ras基因mRNA表达F调和ras p21蛋白表达下降.抑制ras p21活性可能是D-柠檬烯抗肿瘤作用的重要机制之一.     

胰腺癌细胞Flt-1受体表达与p53、ras基因突变的关系

目的探讨胰腺癌细胞Flt-1受体表达与p53、ras基因突变之间的关系,了解Flt-1受体表达与p53、ras基因突变在胰腺肿瘤血管形成中的作用.方法采用免疫组织化学EnVisionTM方法检测40例原发性胰腺癌组织Flt-1受体和p53、ras基因的表达;采用χ2检验分析Flt-1受体表达与p53、ras突变基因的相关性.结果 Flt-1受体和p53、ras基因的阳性表达率分别为77.5%(31/40)和50%(20/40)、60%(24/40).经连续切片对比分析表明,在Flt-1受体表达较高的区域,p53、ras基因的表达亦较强,Flt-1受体表达与p53基因突变呈显著相关性(χ2=4.35, P<0.05),但与ras基因表达之间无显著相关性(χ2=2.12, P>0.05).结论胰腺癌细胞Flt-1受体表达与p53基因突变之间有显著相关性,与ras基因突变之间无显著相关性,提示野生型p53基因发生突变可能会失去抑制Flt-1受体表达的功能,从而导致胰腺肿瘤血管的新生,促进肿瘤细胞生长;ras突变基因可能通过其他的途径参与胰腺肿瘤新生血管的形成.     

大鼠血清表皮生长因子和睾丸表皮生长因子受体与精子生成的相关性

目的　探讨血清表皮生长因子 ( EGF)和睾丸组织表皮生长因子受体 ( EGF-R)与大鼠精子生成的关系。　方法　 40只性成熟期雄性 SD大鼠 ,随机分为假手术组( SOG)、去颌下腺组 ( SG)、去颌下腺加腹腔注射 EGF I组 ( SG-EGF I)和 II组 ( SG-EGFII) ,每组 1 0只。SG-EGF I和 SG-EGF II分别腹腔内注射 EGF0 .2 5和 0 .50 μg·kg- 1·d- 1。大鼠常规喂养 48d,断头取血和睾丸。放射免疫法检测血清 EGF水平 ,病理检查睾丸生精功能和免疫组织化学检测睾丸组织 EGF-R的表达。　结果　大鼠血清 EGF水平SG-EGF I组明显下降 ( P<0 .0 5) ,SG组有非常显著下降 ( P<0 .0 1 ) ;睾丸生精功能中、重度障碍 ;间质细胞 EGF-R表达明显减少 ( P<0 .0 5)。补充不同剂量的 EGF对睾丸生精功能有不同影响。 SOG、SG-EGF I和 SG-EGF II大鼠睾丸生精细胞、支持细胞及间质细胞 EGF-R表达无显著性差异 ( P>0 .0 5)。　结论　EGF对精子发生具重要的调控作用 ,血清 EGF水平和睾丸间质细胞 EGF-R高表达与睾丸生精功能呈正相关     

乙型肝炎病毒X基因诱导卵圆细胞恶性转化的研究

目的 研究乙型肝炎病毒X(HBx)基因对卵圆细胞转化和分化的影响.方法 用稳定表达HBx的转基因即圆细胞株pEGFP-HBx卵圆细胞作为实验组,pEGFP卵圆细胞及LE/6卵圆细胞作为对照组,运用倒置相差显微镜和透射电镜、流式细胞术、糖原染色、软琼脂生长、实时定量PCR、细胞免疫化学技术观察和检测pEGFP-HBx卵圆细胞在细胞形态、细胞周期、分化标志物、癌基因c-myc及TGF-α的变化.结果 (1)与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞体积增大,核具有明显异型性;(2)流式细胞仪检测显示,与对照组相比,pEGFP-HBx卵圆细胞G0/G1期细胞百分比下降,S期和G2/M期细胞百分比明显升高,而且非整倍体细胞明显增多;(3)糖原染色显示,pEGFP-HBx卵圆细胞胞质内可见大量糖原颗粒;(4)软琼脂中可见pEGFP-HBx卵圆细胞克隆形成;(5)癌基因c-myc及TGF-α表达量明显增高,卵圆细胞分化指标HNF-4α、AFP表达上升,CK-7、CK-19表达下降,未见有cps1 mRNA表达.结论 HBx基因可以引起卵圆细胞异常分化,并直接诱导卵圆细胞发生恶性转化.     

乙型肝炎病毒X蛋白对卵圆细胞中Smad2、Smad3、Smad4基因表达的调控作用

目的 观察乙型肝炎病毒编码X蛋白(HBX)对肝脏卵圆细胞中转化生长因子-β(TGF-β)/Smad中核心元件Smad2、Smad3、Smad4表达的调控作用。方法 稳定转染HBX基因的大鼠卵圆细胞株HBX-EGFP-LE/6作为实验组,转染绿色荧光蛋白标记空载体的大鼠卵圆细胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圆细胞株LE/6作为对照组。Real-time聚合酶链反应(PCR)与Western blot分别检测3种细胞株中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白表达。结果 对照组Smad3的mRNA表达量分别是实验组的(4.56±0.79)倍和(4.14±0.38)倍,差异有统计学意义(P＜0.01)。对照组Smad4的mRNA表达量分别是实验组的(1.41±0.04)倍和(1.63±0.43)倍,差异有统计学意义(P＜0.01)。实验组Smad3蛋白表达水平有一定程度降低。结论 HBX可以在卵圆细胞中影响TGF-β/Smad信号通路中的核心元件Smad3的转录及蛋白合成,对Smad4的转录有一定影响。     

转化生长因子β1 对大鼠肝卵圆细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)在肝卵圆细胞增殖过程中发挥的调控作用.方法 60只雄性SD大鼠随机分成实验组和对照组,建立肝卵圆细胞增殖动物模型(2-AAF/PH),采用免疫组织化学、RT-PCR、原位细胞凋亡检测方法,观察上述两组动物模型不同时间点肝脏卵圆细胞增殖情况和TGF-β1 及其受体动态表达变化.结果 实验组在肝切除术后2 d 即出现卵圆细胞,10 d达高峰,16 d 卵圆细胞数目明显减少,肝小叶和肝索结构恢复;TGF-β1 表达在术后6 d开始增多,16 d达高峰,21 d 降至正常水平;TUNEL 染色阳性细胞高峰出现在卵圆细胞的增殖高峰后期,和TGF-β1 表达高峰出现在同一时期.结论 TGF-β1 与卵圆细胞增殖和凋亡密切相关,在肝卵圆细胞增殖过程中起负调控作用.     

大鼠2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中卵圆细胞增殖动力学的初步研究

目的 研究大鼠肝脏卵圆细胞增殖模型中卵圆细胞增殖率的变化,进一步了解卵圆细胞生物学特性.方法 采用2-乙酰胺基芴/部分肝切除(2-AAF/PH)的方法建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型.免疫荧光双标技术检测肝切除术后不同时间点肝脏石蜡切片中卵圆细胞标志物上皮细胞黏附分子和增殖标志物增殖细胞核抗原的共表达情况,对阳性细胞进行定量计数分析;并采用荧光双标和天狼猩红染色观察此过程中肝星状细胞激活和肝脏胶原沉积的情况.结果 术后第2天门静脉区开始出现少量卵圆细胞,到第9天数量达到高峰,此后数量逐步下降.此过程中卵圆细胞的增殖率逐步下降,从第2天的(91.3±1.6)%下降到第12天的(53.6±4.4)%,差异有统计学意义(P＜0.01).激活的肝星状细胞一直伴随卵圆细胞增殖并向肝实质延伸,分泌的胶原形成细胞外基质包绕小管样结构的卵圆细胞.结论 2-AAF/PH模型中卵圆细胞数量达到高峰前,其增殖率已经开始逐渐下降.肝星状细胞可能通过分泌细胞外基质和多种因子严格调控卵圆细胞的增殖.     

肝卵圆细胞对大鼠肝硬化组织TGFβ/smad信号传导的影响

【摘要】〓目的〓探讨肝卵圆细胞对TGFβ/smad信号传导通路影响的机制,并证明肝卵圆细胞对肝硬化的发展是否有阻止和逆转的作用。方法〓对肝卵圆细胞进行增殖、分离、培养后,移植于肝硬化大鼠肝脏组织,以未经移植的大鼠做对照,分别进行组织病理学和肝功能及蛋白表达水平的检测,分析ALB、AST、ALT、TGFβ1、TGFβRⅡ、Smad2、Smad4 、Smad7的情况。结果〓移植肝卵圆细胞的鼠肝硬化组织纤维化减少,肝功能明显改善(P<0.05),肝硬化组织TGFβ/smad信号通路中各蛋白表达量有差异。结论〓肝卵圆细胞刺激肝硬化细胞后TGFβ/smad信号通路中各蛋白的表达是不同的,肝卵圆细胞对肝硬化组织有阻止和逆转的作用。     

小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及电镜观察

我们在成功分离培养鼠神经干细胞的基础上[1,2 ] ,对神经干细胞的生长发育特性进行电镜观察。一、材料与方法1.材料 :一级昆明E12 13孕小鼠(本校动物中心提供 ) ,改良的Eagle培养液 (DMEM /F12 ) ,胎牛血清 ,表皮生长因子 (EGF) ,均购于Gibco公司 ;N 2添加剂 (N2 supplement)、Nestin抗体、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)抗体、神经丝蛋白 2 0 0 (NF 2 0 0 )抗体 ,购自Sigma公司 ;免疫组织化学检测系统购自博士德公司。透射电子显微镜 (日立 F75型 )。2 .细胞的分离培养及传代 :无菌条件下剖腹取胎鼠 ,在解剖显微镜下分离胎鼠大脑半…