酪氨酸蛋白磷酸酶2高表达对p210bcr/abl诱导的慢性粒细胞白血病细胞增殖与凋亡抵抗的影响

目的研究Src癌基因同源的酪氨酸蛋白磷酸酶2(Shp2)在慢性粒细胞白血病(CML)细胞中的表达,及其在p210bcr/abl诱导的白血病细胞恶性增殖和凋亡抵抗中的作用。方法收集25例p210bcr/abl阳性CML患者白血病细胞样本,8例非肿瘤病人骨髓和10例正常人外周血细胞样本作阴性对照,K562和KU812白血病细胞系作为p210bcr/abl阳性对照,KG1白血病细胞作为Shp2阳性对照。用Western印迹技术定量分析与比较Shp2在白血病细胞和正常骨髓造血细胞中的表达情况,通过特异性抑制剂分别下调Shp2和白血病融合基因p210bcr/abl后,观察Shp2表达对p210bcr/abl阳性白血病细胞增殖与凋亡的作用。细胞增殖与凋亡检测应用流式细胞仪。结果(1)磷酸化Shp2蛋白在92%患者CML白血病细胞样本中呈高表达状态,而在8例非肿瘤患者骨髓和10例正常人外周血细胞中低表达或不表达。磷酸化Shp2/β肌动蛋白比值分别为0.91±0.62、0.16±0.09和0.03±0.05(P均<0.01)。(2)下调Shp2蛋白表达后,白血病细胞凋亡率从4.89%上升到38.69%(P<0.01),而S期细胞从33.6%下降到10.8%(P<0.01)。(3)特异性抑制p210bcr/abl融合基因表达蛋白后,白血病细胞中磷酸化Shp2蛋白明显下降,同时出现明显细胞凋亡与生长抑制现象。结论(1)磷酸化Shp2蛋白在慢性粒细胞白血病细胞患者中呈过度表达状态,并且与白血病细胞恶性增殖与凋亡抵抗密切相关。(2)bcr/abl融合基因阳性患者的白血病细胞中Shp2的过度表达可能由p210bcr/abl蛋白激活引起。     

姜黄素衍生物Fm04抑制K562细胞增殖及其对P210bcr/abl信号通路的影响

目的 研究姜黄索衍生物Fm04对K562细胞的增殖及对P210bcr/abl信号通路的影响.方法 应用MTT法检测姜黄素衍生物Fm04对K562细胞增殖的影响;应用Western blot法检测P210bcr/abl及其下游通路蛋白表达的变化和线粒体细胞色素C的变化;比色法测定Caspase-3、Caspase-9活化程度.结果 Fr004对K562细胞的抑制作用呈量效、时效关系,4 μmol/L Fm04作用24 h,抑制率88.4%,半数抑制浓度1.45 μmol/L,强度约为姜黄素的7倍;Western blot表明Fm04可显著下调P210bcr/abl及其下游信号通路蛋白,减少细胞线粒体内细胞色素C含量;Fm04处理组Caspase-3、Caspase-9浓度值增加.结论 Fm04显著抑制K562细胞的增殖并减少P210的蛋白含量从而下调P210bcr/abl下游多种信号分子表达,通过激活caspase的活化和线粒体内细胞色素C的释放,最终诱导K562细胞的凋亡.     

雷公藤诱导皮肤T细胞淋巴瘤Hut102的凋亡及机制

目的探讨雷公藤内酯醇（TP）诱导皮肤T细胞淋巴瘤Hut102细胞株的凋亡及机制。方法采用MTT法检测Hut102细胞的增殖抑制率,Annexin v-FITC/PI双染流式细胞术检测Hut102细胞的凋亡率,Western印迹法检测Hut102细胞中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、caspase-3、热休克蛋白27（Hsp27）的表达。结果雷公藤内酯醇可诱导Hut102细胞凋亡（P〈0.01）,磷酸化p38MAPK、caspase-3被激活,同时抑制Hsp27的表达。用p38MAPK特异性抑制剂SB203580干预后,雷公藤内酯醇诱导Hut102细胞凋亡率下降,磷酸化p38的表达降低,caspase-3激活被抑制,Hsp27的表达增加。结论雷公藤内酯醇可诱导Hut102细胞凋亡,该作用可被p38MAPK特异性抑制剂SB203580显著抑制,提示雷公藤内酯醇可能通过激活p38MAPK信号通路使部分Hut102细胞产生凋亡。     

bcr/abl基因在慢性粒细胞性白血病中的发病作用及bcr/abl反义基因治疗

慢性粒细胞性白血病(CML)最有效治疗手段为骨髓移植(BMT)。但异体BMT供髓者缺乏，且有发生移植物抗宿主病的危险。自体BMT常因骨髓净化不彻底导致复发。所以探讨CML细胞生物学行为改变的原因，是探索CML病因进而力争治愈CML的关键。 　　1　bcr/abl表达产物及功能 　　90%以上CML患者骨髓全部造血细胞内出现Ph1染色体，由位于9号染色体q34.11的c-abl基因与位于22号染色体q11.21的c-sis基因相互易位，形成t(9;22)(q34.11;q11.21)所致。22号染色体上断裂点集中在约5 800 bp的区域内，称M-bcr。CML中bcr/abl融合方式有2种：bcr第3及第2外显子分别与abl第2外显子融合成b3a2及b2a2型，二者差75 bp，均表达210 000的蛋白，即p210bcr/abl (p210)。此外还有bla2型(p185)，主要见于ALL。     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导髓系白血病细胞株HL60凋亡的机制研究

目的 探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导髓系白血病细胞HL60凋亡的机制。方法 四甲基偶氮唑盐（MTT）法、Hoechst33342染色形态学观察及流式细胞仪证实细胞凋亡,Western印迹检测B细胞淋巴瘤／白血病-2（Bcl-2）、Caspase-9、Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）蛋白表达。结果 硼替佐米对HL60细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖关系,30nmol/L的硼替佐米作用24h能明显抑制HL60细胞增殖,抑制率为76％,形态学观察可见明显的胞核凝聚、固缩及碎裂;流式细胞仪检测可见明显的凋亡峰凋亡率为62．6％;Western印迹检测显示Bcl-2表达下降,Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白均裂解激活。结论 硼替佐米能诱导髓系白血病细胞HL60凋亡,其机制与Bcl-2蛋白的抑制及Caspase凋亡信号途径的激活有关。     

慢性粒细胞白血病bcr/abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

目的 构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达.方法 以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCF4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆人pBB质粒中与ber/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG.在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的ber/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有hcr/abl融合蛋白的表达.结论 成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白.     

姜黄素衍生物Fm04抑制K562细胞增殖及其对P210^bcr/abl引信号通路的影响

目的研究姜黄素衍生物Fm04对K562细胞的增殖及对P210^bcr/abl信号通路的影响。方法应用MTT法检测姜黄素衍生物Fm04对K562细胞增殖的影响；应用Western blot法检测P210^bcr/abl及其下游通路蛋白表达的变化和线粒体细胞色素C的变化；比色法测定Caspase-3、Caspase-9活化程度。结果Fm04对K562细胞的抑制作用呈量效、时效关系，4 μmol／L Fm04作用24h。抑制率88．4％，半数抑制浓度1．45 μmol／L，强度约为姜黄素的7倍；Western blot表明Fm04可显著下调P210^bcr/abl及其下游信号通路蛋白，减少细胞线粒体内细胞色素C含量；Fm04处理组Caspase-3、Caspase-9浓度值增加。结论Fm04显著抑制K562细胞的增殖并减少P210的蛋白含量从而下词P210^bcr/abl下游多种信号分子表达，通过激活caspase的活化和线粒体内细胞色素C的释放，最终诱导K562细胞的凋亡。     

姜黄素与 STI571对慢性粒细胞白血病细胞株K562作用的体外研究

目的 研究姜黄素（Cur）、STI571以及二者联合应用对慢性粒细胞白血病细胞株K562的影响,探索两药的不同效果及联合应用机制.方法 锥虫蓝排染法计算K562细胞增殖抑制率;Western blot方法检测Cur、STI571以及二者联合应用对K562细胞P210bcr/abl蛋白含量及其下游信号蛋白激酶C（PKC）的影响;用金氏公式评价两药的协同效果.结果 Cur和STI571联合应用对K562细胞呈剂量依赖性的抑制作用,协同指数Q值均＞0.85;Western blot显示,Cur和STI571联合应用对P210bcr/abl及PKC的下调呈明显增强作用.结论 Cur与低剂量（0.1,0.15μmol/L）的STI571联合应用对抑制K562细胞增殖呈单独相加;而较大剂量则可明显协同下调P210bcr/abl和PKC的表达水平.     

Hsp90抑制剂槚如酸对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的探讨热休克蛋白90 (Hsp90) 抑制剂槚如酸对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法采用体外
malachite green-molybdate 显色反应和ATP-琼脂糖凝胶结合实验检测槚如酸对Hsp90 抑制活性;MTT 法检测药物对
MDA-MB-231增殖抑制效应;Transwell小室法检测药物对细胞侵袭和迁移影响;免疫印迹法检测药物对相关蛋白基质金属蛋
白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）、Hsp90、热休克蛋白70（Hsp70）表达的影响。结果槚如酸为特异性
的Hsp90抑制剂,其抑制IC50值为82.5 μmol/L。MTT结果显示,槚如酸具有明显抑制细胞增殖的作用,且呈现浓度依赖关系,其
IC50值为29.3 μmol/L。不同浓度的槚如酸（12.5,25.0,50.0 μmol/L）处理36 h后,与对照组相比,药物对细胞侵袭抑制率分别为：
23.6%、56.6%、67.0%,P<0.05。槚如酸（12.5,25.0,50.0 μmol/L）处理24 h 后,与对照组相比,药物对细胞迁移抑制率分别为：
30.0%、45.5%、77.5%,P<0.05。免疫印迹法结果显示,槚如酸随着浓度的增加,诱导MMP-9降解越明显,而对Hsp90和Hsp70蛋
白表达均没有影响。结论槚如酸能明显抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力,其机制可能是通过抑制Hsp90 ATPase活性以
及导致下游的顾客蛋白的MMP-9表达下调有关。
     

bcr/abl基因特异性小干扰RNA对K562细胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表达的影响研究

目的 通过小干扰RNA（siRNA）沉默K562细胞bcr/abl基因使SH2肌醇磷脂酶（SHIP）基因表达增加,探讨SHIP基因缺失对K562细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 构建bcr/abl基因的化学合成siRNA,并转染到K562细胞,分为转染特异性siRNA实验组、转染非特异性siRNA对照组、空白对照组。Western blotting法检测转染后K562细胞p210表达量,实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）检测各组细胞中SHIP mRNA表达量;Western blotting法检测SHIP、磷酸化蛋白激酶B 308（p-Akt308）和磷酸化蛋白激酶B 473（p-Akt473）的表达量;MTT比色法检测K562细胞增殖率;流式细胞仪检测K562细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测核因子（NF）-κB活性。结果 转染特异性siRNA实验组K562细胞p210表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低,SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、细胞凋亡率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组升高（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞p210表达量、SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量、细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第1天、第3天、第5天转染特异性siRNA实验组K562细胞增殖率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞增殖率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第3天、第5天转染特异性siRNA实验组NF-κB活性较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组NF-κB活性比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 SHIP基因表达受bcr/abl基因的调控,SHIP表达缺失可能是K562细胞过度增殖和凋亡减少的重要因素。     

Berbamine selectively induces apoptosis of human acute promyelocytic leukemia cells via survivin-mediated pathway

Background Currently, resistance and relapse are still major problems in acute promyelocytic leukemia （APL） cases. Thus, new agents that override the resistance are crucial to the development of curative therapies for APL. In this study, we investigated the effects of berbamine on the proliferation of APL cell line NB4 and its possible mechanisms. Methods NB4 cells were treated with berbamine at different concentrations （0-64 μg/ml） for 72 hours. MTT assay was used to determine proliferation inhibition of NB4 cells. Cell apoptosis was evaluated by both flow cytometry （FCM） and morphological examination. PML/RAR-α and survivin mRNAs were measured by nested-RT-PCR and RT-PCR, respectively. Activated-caspase 3 was determined by FCM. Results Berbamine greatly inhibited the proliferation of NB4 cells in dose- and time-dependent manners, and its IC50 value was 3.86 μg/ml at 48 hours. Both morphological observations and FCM results showed that berbamine induced apoptosis of NB4 cells with concomitant increase of activated caspase-3 and decrease of survivin mRNA. After treatment with berbamine at 8 μg/ml for 48 hours, the percentage of apoptotic cells increased from 2.83% to 58.44% （P〈0.01）, and the percentage of cells with activated-caspase 3 elevated from 2.06% to 70.89% （P〈0.01）, whereas, level of survivin mRNA was reduced to 38.24% of control （P〈0.01）. However, no significant change was observed in PML/RAR-α mRNA. Conclusions Berbamine induces caspase-3-dependent apoptosis of leukemia NB4 cells via survivin-mediated pathway, suggesting that berbamine may be a novel potential agent against APL with a mechanism distinct from that of all-trans retinoic acid （ATRA） and arsenic trioxide （ATO）.     

小檗胺诱导白血病细胞株NB4细胞凋亡及其机制的研究

目的：探讨小檗胺对白血病细胞系NB4生长的影响及其机制。方法：体外培养人白血病细胞株NB4细胞，经不同浓度小檗胺处理不同时间后，MTT法检测药物对NB4细胞的抑制作用；细胞形态学观察和DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡；流式细胞仪检测DNA含量及细胞周期；巢式PCR及RT-PCR检测PML／RARα融合基因及Survivin基因表达及流式细胞仪检测Caspase3阳性表达率。结果：经不同浓度小檗胺处理不同时间后，NB4细胞生长出现明显的抑制，并呈现明显的时间剂量依赖性，48h IC50为3．860μg／ml；细胞形态学观察可见细胞凋亡现象，DNA琼脂糖电泳显示典型的凋亡梯形图；流式细胞仪检测发现细胞凋亡率明显增加，经48h作用后，凋亡率从2．83％增至12μg／ml时的58．44％；虽未发现药物作用后PML／RARα基因表达量的改变，但检测到NB4细胞经药物作用后Survivin基因表达量的减少和Caspase3表达的增加，Caspase3阳性率从对照组的2．06％增至12μg／ml时的70．89％。经相关性分析，随着细胞Survivin表达水平的下降和Caspase3表达水平的增高，NB4细胞凋亡率相应地增高。结论：小檗胺对NB4细胞有增殖抑制作用，诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的重要机制之一，但不是通过作用于NB4细胞特异性融合基因PML／RARα发挥作用的，其抗凋亡的可能分子机制之一是抑制Survivin基因的表达和增加Caspase3的表达。     

Genistein 对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响

目的 研究Genistein抑制K562细胞生长的机制及对CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响。方法 用RT－PCR方法检测Genistein作用于K562细胞前后CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达变化,用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡。结果 K562细胞中CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表达阳性,用Genistein与K562细胞共同孵育后,bcr-abl融合基因的mRNA表达阴性,CyclinD1的mRNA和CDK4蛋白表达下降,细胞阻滞于G2／M期,K562细胞出现凋亡。结果 bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4蛋白在K562细胞中高表达,Genistein能使K562细胞生长受抑,诱导其调亡,抑制bcr-abl基因的mRNA表达,并使CyclinD1基因的mRNA和CDK4蛋白表达下降,表明bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4对慢粒发展存在内在关系。     

三尖杉酯碱诱导慢性髓系白血商K—562细胞凋亡的实验研究

目的 阐明三尖杉酯碱（HT）作用于K562细胞的机制。方法 应用细胞形态，DNA凝胶电泳和流式细胞仪等检测，观察HT对K562细胞株的作用方式，进一步用RT-PCR方法研究bc/rlabl基因在转录水平的改变。结果 0.01-100.00μg/ml浓度HT可诱导K562细胞凋亡，并呈时间和剂量依赖性，随着药物作用时间的延长，bcr/abl基因的转录下调。结论 低浓度HT就可通过抑制bcr/abl基因的表达，诱导K562细胞凋亡。     

小檗胺对慢性粒细胞白血病细胞抑制作用的机制研究

目的:探讨小檗胺诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡的机制.方法:体外培养K562细胞株细胞,经8 μg/ml小檗胺处理不同时间后用Western blot检测细胞内总NF-κB、核内NF-κB和IκBα、pIκBα、IKKα、A20蛋白表达.结果:随着小檗胺处理时间的延长,细胞内总NF-κB无变化,但核内的NF-κB表达下降,半定量比值从处理前的59.2%,随着作用时间的延长,逐步下降为31.4%,19.7%,4.1%,0%.同时出现pIκBα、IKKα表达下调,A20表达增高.结论:小檗胺通过NF-κB途径诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡的机制,可能涉及抑制NF-κB的核转位和转激活,推测其作用与小檗胺降低K562细胞bcr-abl基因的表达有关.     

bcr3/abl2和c-myb基因反义寡核苷酸联用对慢性髓细胞白血病的作用

探讨多癌基因反义寡核苷酸对慢性髓细胞白血病的作用及其相互作用的影响。方法用台盼蓝拒染,集落形成,逆转录－多聚酶链反应及流式细胞仪技术研究反义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞株和ＣＭＬ骨细胞的作用。结果ｃ－ｍｙｂ反义寡核苷酸通过促进ＣＭＬ,细胞凋亡,发挥对ｂｃｒ／ａｂｌ反义寡核苷酸的协同作用。结论多癌基因反义核酸的联合应用可为ＣＭＬ基因治疗提供一项新手段。     

Bcr/abl融合基因的小干扰RNA对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察特异性bcr/abl融合基因的siRNA对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法　设计并化学合成bcr/abl融合基因融合位点b3:a2 21个核苷酸 siRNA作用于K562细胞,用WST-8法检测细胞增殖抑制率;RT-PCR 检测 bcr/abl mRNA表达水平;PI单染流式细胞仪检测细胞周期;Annexin V-PI双染测定细胞凋亡比例;Hochest33258 染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果 ①Bcr/abl siRNA作用K562细胞24h,48h,72h后,明显抑制K562细胞增殖,各浓度组间的增殖抑制率无明显差异(p>0.05);②Bcr/abl siRNA能显着下调bcr/abl mRNA水平,各浓度组间差异无显著性(p>0.05);③Bcr/abl siRNA作用组细胞周期阻滞于G1期;④Bcr/abl siRNA作用后细胞出现明显的早期凋亡群,各浓度组间的早期凋亡率差异无统计学意义(p>0.05),细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论 　特异性bcr/abl siRNA可显着抑制K562细胞bcr/abl融合基因的表达,抑制细胞的增殖,诱导凋亡,但其作用未显示明显的剂量依赖性。     

bcr/abl反义寡聚脱氧核苷酸抑制慢性粒细胞白血病细胞生长的研究

目的：研究bcr/abl基因的反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASON）对K562细胞生长的影响。 方法：根据bcr/abl基因类型（b₃/a₂）的cDNA序列分析,以其 mRNA融合区的18个核苷酸为作用靶序列,人工合成了18聚ASON片段,同时合成18聚无义ASON片段,作为序列特异性对照。用ASON和无义ASON片段与K562细胞共同培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学、³H-TdR掺入率、bcr/abl mRNA和P210蛋白的表达。 结果：3.5～30.0 μmol•L^-1的ASON对K562细胞生长有不同程度的抑制作用,ASON浓度低于10.0 μmol•L^-1 时抑制作用很小,大于10.0 μmol•L^-1时抑制作用显著,这种作用有浓度、时间依赖关系,而无义ASON与空白对照组比较差异无显著性(P<0.05)。同时发现ASON使细胞的 ³H-TdR掺入率下降, bcr/abl mRNA及P210蛋白的表达下降。结论：ASON的抑制作用是从基因水平上封闭了bcr/abl mRNA转录及P210蛋白的翻译,抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡。ASON对慢性粒细胞白血病(CML)细胞有抑制作用。