DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株的建立

目的 建立并鉴定DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株。用于研究hMSH2基因的作用机制及其缺陷与肿瘤发生的关系。方法 运用基因工程的方法获得hMSH2 cDNA片段,并反向克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上,随后将构建好的hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体转染入人胚肺成纤维细胞(HLF)．使之在HLF中表达,用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hMSH2基因的表达水平。结果 构建了hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体,并在真核细胞成功表达;hMSH2酶缺陷细胞株hMSH2基因的蛋白表达水平下降了44％。结论 hMSH2缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hMSH2基因功能研究提供了一种有效手段。     

RNA干扰技术抑制哺乳动物细胞绿色荧光蛋白表达的研究

目的本研究旨在探讨阳离子脂质体的体外转染效率、化学合成双链RNA(dsRNA)诱导RNA干扰(RNAi)的效应强度及其作用特点,为采用RNAi技术开展基因治疗提供实验依据。方法①采用磷酸钙沉淀法构建293T/GFP细胞株。②体外化学合成dsRNA,经由三种不同的阳离子脂质体TransIT-TKO,Oligofectamine reagent,Lipofectamine2000导入293T/GFP细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪测定荧光强度的变化,观察不同阳离子脂质体的体外转染效率。③采用dsRNA-Lipofectamine2000复合物转染293T/GFP细胞。dsRNA分设5个不同的浓度(0.01,0.02,0.04,0.08,0.16μmol/L)转染细胞48h以观察剂量效应关系。dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine20008μl转染细胞,于4个不同的时间点(12h,24h,48h,72h)观察时间效应关系。结果绿色荧光蛋白序列特异性dsRNA(dsRNA-eGFP)经由三种不同的阳离子脂质体导入细胞均可产生RNAi效应,序列非特异性dsRNA(dsRNA-unrelated)无抑制效应。在三种不同的阳离子脂质体中,Lipofectamine2000的转染效率最强,转染48h可将293T/GFP细胞荧光强度降低约80%,与空白载体组比较差异显著,TransIT-TKO组,Oligofectamine reagent组分别降低41.02%、37.45%,与空白载体组比较无显著性差异,而且TransIT-TKO、Oligofectamine的细胞毒性较强。结果还表明dsRNA/Lipo-fectamine2000诱导的RNAi效应具有剂量及时间双重依赖性,dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine20008μl/6孔培养板转染细胞48h的抑制效应最强。结论①体外化学合成的dsRNA可有效诱导哺乳动物细胞出现序列特异性基因沉默效应。②三种不同的阳离子脂质体中Lipofectamine2000的转染效率最强,且细胞毒性轻微。③dsRNA/Lipofectamine2000诱导的RNAi效应具有剂量及时间双重依赖性。     

基于慢病毒介导RNA干扰技术的人PARP-1基因沉默细胞株构建

目的利用慢病毒介导的RNA干扰技术构建人淋巴母细胞TK6细胞的PARP-1基因沉默细胞株,为后续PARP-1基因功能和表观遗传学调控机制的研究提供有效的工具细胞。方法利用瞬时转染方法筛选最佳干扰效果的shRNA片段,与慢病毒载体pLVX-shRNA1连接,形成重组质粒,DNA测序鉴定后进行病毒包装,转导TK6细胞,利用嘌呤霉素筛选得到稳定表达PARP-1siRNA的PARP-1沉默细胞株,并用定量PCR和Western blotting鉴定所构建的细胞株。结果转染shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4细胞的PARP-1相对表达量分别为0.289、0.538、0.375和0.474,故选择shRNA1作为干扰PARP-1基因最佳片段。用0.5μg/ml的嘌呤霉素成功筛选出PARP-1沉默细胞株和空载体对照细胞株,并从mRNA、蛋白质、细胞表型来检测PARP-1基因的干扰效率,抑制效率超过80%。结论成功构建PARP-1的siRNA慢病毒干扰载体,并筛选出PARP-1基因沉默的TK6细胞株,携带shRNA的慢病毒稳定、高效干扰PARP-1基因表达。     

哺乳动物RNA干扰中的小干扰RNA表达载体

载体表达小干扰RNA的方法因便宜,稳定,操作方便的优点,在哺乳动物RNA干扰研究中有非常大的潜力和优势。本文对当前哺乳动物RNA干扰研究中的小干扰RNA表达用载体作一综述。小干扰RNA载体表达方法的广泛应用,将对功能基因组研究以及抗病毒和肿瘤的基因治疗产生深远的影响。     

RNA干扰技术在抗HIV-1感染中的实验研究

RNA干扰是双链RNA特异性关闭靶基因表达的转录后基因沉默机制,它为HIV-1的治疗开辟了一条新的有效途径。本文就此技术在抗HIV-1感染中的研究进展进行综述。     

大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1基因RNA干扰表达质粒构建与鉴定

目的 构建并筛选大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)基因的RNA干扰(RNAi)表达质粒,为职业性疾患的基因治疗探索新途径.方法 根据基因序列数据库中报道的PARP-1基因序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计、合成用于构建RNAi质粒的寡核苷酸,构建4种重组PARP-1 RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体Lipofectamine TM2000介导转染大鼠骨髓间充质干细胞.48 h后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测转染细胞中PARP-1 mRNA的转录水平,筛选有效的PARP-1 RNAi质粒.结果 4种重组PARP-1 RNAi质粒经酶切及测序证明构建正确.转染后48 h,转染质粒shRNA-PARP-1-532的细胞PARP-1基因抑制效果最明显,mRNA的转录水平下降了78％,可作为后续实验的有效质粒.结论 成功构建并筛选出PARP-1基因的RNAi表达质粒,为探索PARP-1基因在疾病中的作用奠定了基础.     

野生型CENP-E基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选研究

目的为探索有丝分裂中的重要基因CENP-E在非整倍体的形成及肿瘤发生中的作用,设计并构建了以野生型CENP-E中Q2-Q3片段为靶点的RNA干扰表达载体pCENP-Es,筛选其中对野生型CENP-E有显著干扰作用的表达质粒。方法根据已知的野生型CENP-E中Q2-Q3片段的mRNA序列,选择设计4条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到载体pgenesil-1中并测序分析。用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒pDSRED-Q2-Q3共转染293T细胞,72h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过RT-PCR方法检测不同干扰质粒对野生型CENP-EmRNA的干扰效果。结果 4个野生型CENP-E的siRNA片断被成功克隆到pgenesil-1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致。RT-PCR结果表明,针对1号和4号干扰质粒共转染时干扰效果最好,干扰效率可达84.47%。结论成功构建了能表达野生型CENP-EshRNA(smallhairpinRNA)重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到干扰效果达80%以上的干扰片断,为体内研究CENP-E基因及蛋白在肿瘤发生过程中功能打好基础。     

哺乳动物RNA干扰中小干扰RNA载体表达策略及其表达盒

RNA干扰是一种典型的转录后基因调控方法 ,也是体内抵御外在感染的保护机制之一。在哺乳动物功能基因组学及病毒感染性疾病和肿瘤治疗研究中具有很大的应用前景。构建在细胞内稳定表达小干扰RNA的载体因价廉、稳定、操作方便 ,被认为是一种较理想的产生RNA干扰的方法 ,目前广泛应用于哺乳动物RNA干扰研究中。本文对小干扰RNA载体的表达策略及其表达盒作一阐述。     

慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展

慢病毒载体是一类逆转录病毒载体,以其转染效率高,可感染分裂期和非分裂期细胞,可容纳较大的基因片段等优点,现已被作为转移目的基因的理想载体。而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术,在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。通过慢病毒载体与RNA干扰技术的结合应用,有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。     

RNA干扰技术专利分析

RNAi具有非常光明的发展前景.目前,包括默克、阿斯利康、罗氏等制药巨头在内的制药公司及生物技术研发公司对RNAi专利非常重视,专利活动活跃.本文对RNAi专利的审批形势、发展历程、分布态势、未来专利争夺热点及潜在的专利争议等问题进行分析探讨.     

应用RNA干扰沉默NOB1基因对卵巢癌HEY细胞增殖和周期的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制NOB1基因的表达,并在卵巢癌HEY细胞上观察NOB1下调对细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法:NOB1特异性siRNA构建于慢病毒载体,感染卵巢癌HEY细胞后,Real-time PCR和Western验证NOB1的抑制效率,MTT、Brdu实验观察NOB1基因沉默对HEY细胞增殖的作用,PI染色流式细胞仪检测细胞周期变化。结果:shRNA慢病毒感染HEY细胞能够将NOB1基因mRNA表达抑制82.2%,蛋白表达也显著降低,MTT和Brdu实验显示细胞增殖水平显著变弱,流式细胞仪检测证实细胞出现G1期阻滞。结论:应用RNA干扰技术能在HEY细胞上有效沉默NOB1基因,并降低卵巢癌细胞的增殖能力,使细胞阻滞在G1期。     

人卵泡抑素基因短发夹RNA表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建人卵泡抑素(FS)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,并瞬时转染方式初步鉴定其干扰效果。方法:依据GenBank数据库提供的人FS基因mRNA核苷酸序列,利用Ambion网站上siRNA软件设计shRNA干扰靶序列,将该序列克隆到线性化的pLKO.1质粒载体上,构建pLKO.1-FS-shRNA重组质粒,并进行酶切和测序鉴定。确认质粒构建成功后,用脂质体(Lipofectamine TM 2000)将重组质粒瞬时转染3AO人卵巢癌细胞系,并用实时定量反转录PCR法检测重组质粒对FS基因的表达抑制效果。结果:构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致;实时定量反转录PCR结果显示pLKO.1-FS-shRNA重组质粒瞬时转染的3AO人卵巢癌细胞后,细胞中的FS基因转录受到抑制,抑制率达59%。结论:成功构建了靶向人FS基因的shRNA干扰靶序列重组质粒(PLKO.1-FS-shRNA),转染后对人卵巢癌细胞系FS基因的表达具抑制效果,该实验为进一步研究FS基因的生物学功能奠定基础。     

RNA干扰对疱疹病毒的抑制作用

疱疹病毒是儿童感染性疾病的常见病原体,可表现为潜伏感染和持续感染,甚至引起肿瘤的发生,严重威胁儿童健康。抗病毒药物作为目前疱疹病毒感染性疾病首选的治疗方法,其应用越来越受到药物毒副作用以及耐药问题的限制。RNA干扰(RNAi)作为一种新型的基因阻断技术与传统的基因敲除技术及反义技术相比,具有效能高、特异强、毒性低、作用迅速、操作简便等优点,因此它作为一种新型的抗病毒疗法被寄予厚望。此文就RNAi对疱疹病毒抑制作用的研究进展作了综述。     

RNA干扰在神经退行性疾病发病机制研究和治疗方面的进展

神经退行性疾病是一类适用于RNA干扰疗法的疾病,其发病机制的复杂性又使RNA干扰成为探讨其发病机制的有效工具。本文针对RNA干扰在神经退行性疾病发病机制研究和治疗方面的应用进展进行了综述。通过小RNA干扰技术,在神经退行性疾病的模式动物中找到一批RNA的基因,创建模式动物中RNA组数据库,发现或/和揭示与一些重要生命现象和神经退行性疾病相关的RNA,建立一些以RNA为靶标的预防和治疗技术。     

RNA干扰CD36对大鼠肺泡巨噬细胞TGF-1活化影响

目的观察RNA干扰CD36基因表达对博莱霉素(BLM)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞潜在转化生长因子-β₁(L-TGF-β₁)活化影响。方法实验设BLM组、Lv-shCD36(CD36 shRNA重组慢病毒)组、Lv-shCD36对照组,各组细胞均用BLM刺激,采用realtime-PCR和western blot检测细胞中CD36干扰效率;采用貂肺上皮细胞(CCL-64)增殖抑制实验检测培养上清中TGF-β₁活性。结果Lv-shCD36组细胞CD36 mRNA表达均低于BLM组和Lv-shCD36对照组,与Lv-shCD36对照组比较,干扰效率可达83%;与BLM组、Lv-shCD36对照组比较,Lv-shCD36组细胞CD36蛋白表达均降低;Lv-shCD36组培养上清中活化转化生长因子-β₁(TGF-β₁)含量(91.82±36.79)pg/10 μL和TGF-β₁活化率(19.80±7.98)%均低于BLM组和Lv-shCD36对照组(P<0.05)。结论通过RNA干扰CD36基因表达能够抑制BLM诱导的大鼠肺泡巨噬细胞分泌的L-TGF-β₁的活化。     

SGK1基因沉默对人乳腺癌细胞生长抑制作用

目的观察血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1(SGK1)基因沉默对人乳腺癌细胞生长抑制作用,为探讨乳腺癌治疗靶点提供实验依据。方法采用RNA干扰技术,以pGenesil 3为载体,建立针对SGK1的短发卡RNAC(shRNA)干扰质粒pGen-3-siSGK1和阴性对照质粒pGen-3-control,转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经筛选得到稳定SGK1基因沉默的乳腺癌细胞模型;采用实时定量PCR法、免疫荧光法以及蛋白免疫印迹法,检测shRNA干扰组、阴性对照组及未转染组细胞中SGK1的表达;采用体外浸润实验、细胞迁移实验检测各组细胞的侵袭和转移能力,噻唑蓝比色法检测细胞体外生长能力。结果成功构建针对SGK1基因的shRNA干扰质粒,建立稳定的SGK1基因沉默乳腺癌细胞模型;模型细胞中SGK1蛋白表达量与对照组相比下降了60%(P<0.01);β-catenin与SGK1表达条带亮度均明显下降;PGen-3-siSGK1组SGK1 mRNA相对含量(RQ) 为0.35,低于其他2组(分别为0.96、1.00),与pGen-3-control组相比下降了65.5%,差异有统计学意义(P<0.05),高倍显微镜视野下,pGen-3-siSGK1组的穿膜细胞数为22个/HPF,其他2组分别为66、62个/HPF;pGen-3-siSGK1组的细胞迁移率为17.01%,其他2组分别为72.22%、68.47%;凝血酶不同浓度下pGen-3-siSGK1组细胞生长均受到抑制,生长速度缓慢,其中0.1、1.0 U/mL浓度下,细胞含量(吸光度)分别为0.10、0.05,远低于其他2组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论SGK1基因沉默可抑制SGK1基因表达,可使人乳腺癌细胞MDA-MB-231株的浸润能力、迁移能力下降,抑制乳腺癌细胞生长。     

RNA干扰技术在德国小蠊功能基因研究中的应用

德国小蠊是我国蜚蠊的优势种,在医学与经济方面的重要性和危害性,以及作为多种科学问题的重要研究模型决定了其在生物科学研究领域的重要地位,而在后基因组时代对功能基因的研究成为生物学研究的基础。RNA干扰是外源性或内源性双链RNA诱发的在mRNA水平上进行的基因沉默现象,从而阻止某一基因功能在细胞或整体水平上的表达,具有高效性和特异性等优势。鉴于蜚蠊重要研究价值与RNA干扰表现出的技术优势,该文简要介绍RNA干扰技术分子机制,重点对德国小蠊功能基因的最新研究结果进行综述。