重组CHO细胞培养过程中代谢产物对细胞分泌HBsAg的影响

为了获得重组CHO细胞培养的最佳条件，使其能连续高效表达HBsAg，以含不同量谷氨酰胺的DMEM溶液培养重组CHO细胞，测定了不同阶段氨基酸、氨、乳酸含量及HBsAg滴度。结果表明谷氨酰胺的分解产物氨与乳酸均能抑制细胞的生长和分泌HBsAg，减少细胞培养液中的谷氨酰胺用量可使HBsAg分泌量增加。     

Fed-batch培养中补料及接种密度对RABV-G蛋白表达量的影响

目的 研究流加(Fed-batch)培养中补料及接种密度对狂犬病毒糖蛋白G(RABV-G)蛋白表达量的影响,初步建立RABV-G蛋白在重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中Fed-batch培养的较优工艺方案。方法 复苏培养1支能够稳定表达狂犬病毒RABV-G蛋白的重组CHO细胞,传代扩增后进行6种方案Fed-batch培养,从Fed-batch培养的第3天开始监测培养上清中目的蛋白表达量和细胞生长参数,第14天结束培养,分析比较不同策略所产生的目的蛋白表达量。结果 本研究方案6中5%的Feed1补料及0.5×10⁶cells/ml的起始接种密度在Fed-batch培养第14天,糖蛋白表达量达150 mg/L,显著高于其余5种方案,确立为优选方案。结论 本研究建立了RABV-G蛋白在重组CHO细胞中流加(Fed-batch)培养的较优工艺方案,为重组狂犬病毒疫苗生产工艺研究提供基础。     

水解物对CHO细胞培养工艺的影响

目的 对比3种水解物对CHO悬浮培养细胞生长的影响,以及对细胞分泌表达的抗体质量的影响。方法 应用3种不同来源的水解物,采用摇瓶培养CHO细胞,观察培养过程中细胞密度、活性和代谢产物的变化,以及抗体质量的影响。结果 水解物对CHO生长无显著促进作用、但可大幅度提高抗体产量;对抗体糖型无显著影响,可显著影响抗体电荷分布。结论 3种水解物中,Preteose peptone和Phytone peptone对CHO有很好的促进作用。但Preteose peptone含有动物然产分,随着各国药监对动物来源成分监管制度的严格,将进一步限制Preteose peptone的应用,因此Phytone peptone具有优势。     

不同浓度葡萄糖对sf9细胞生长特性及蛋白表达的影响

目的 研究不同浓度葡萄糖对昆虫细胞sf9生长特性及蛋白表达的影响.方法 将对数生长期的sf9细胞在含不同浓度葡萄糖的Hyclone无血清培养基(serum-free medium,SFM)中培养.采用台盼蓝拒染法监测细胞密度,分析比较不同浓度葡萄糖对sf9细胞生长特性的影响.然后,将对数生长期的sf9细胞在含不同浓度葡萄糖的Hyclone SFM中培养表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型L1蛋白.以蛋白印迹法鉴定并分析比较不同浓度葡萄糖对sf9细胞表达蛋白的影响.结果 4个不同葡萄糖浓度实验组的细胞增殖速率及最大细胞密度均大于不加葡萄糖的对照组.两个较低葡萄糖浓度组的细胞凋亡率低于对照组,最高葡萄糖浓度组的细胞凋亡率则高于对照组.另外,加葡萄糖的8个实验组的蛋白表达量均高于不加葡萄糖的对照组,其中,3个较高葡萄糖浓度组显示有目的 蛋白的降解条带.在另外5个没有出现降解条带的实验组中,以培养过程中间补加葡萄糖浓度至15 mmol/L的实验组蛋白表达量最大.结论 葡萄糖可促进sf9细胞增殖,不同浓度葡萄糖对细胞凋亡的影响不同;适宜浓度的葡萄糖可提高sf9细胞表达完整外源蛋白的量.     

葡萄糖和Cu2+对蛹虫草Cu,Zn超氧化物歧化酶在E.coli中表达的影响

对含有蛹虫草Cu，Zn-超氧化物歧化酶（cm—SOD）基因的重组E．coli培养条件进行了初步优化。结果表明，LB培养基中含有Cu^2＋可明显提高超氧化物歧化酶比活力；而在菌体培养中补加葡萄糖，可提高重组蛋白表达量和细胞生物量。在含有0．6mmol／L Cu^2＋、Zn^2＋的LB培养基中补加22mmol／L葡萄糖，每200ml培养液可获得1g湿细胞，超氧化物歧化酶比活力达到3305u／mg。     

人肝癌细胞体外氨基酸代谢

目的：研究肝癌细胞对氨基酸的代谢作用。方法：对人肝癌细胞系（SMMC－7721）体外培养，观察培养液氨基酸成分的动态变化，同时对人正常肝细胞做对比研究，结果：肝癌细胞体外培养24h，培养液中精氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺（P＜0．01），牛磺酸（P＜0．05）的含量明显下降，培养48h，除上述4种氨基酸外，培养液中精到,苏氨酸，谷氨酰胺（P＜0．01），牛磺酸（P＜0．05）的含量明显下降，培养48h，除上述4种氨基酸外，培养液中丝氨酸，半胱氨酸的含量也明显下降（P＜0．05），人正常肝细胞培养24h，培养液中谷氨酰胺，精氨酸（P＜0．01），半胱氨酸（P＜0．05）含量明显下降，培养48h，培养液中谷氨酰胺，半胱氨酸，精氨酸，组氨酸（P＜0．01），丝氨酸（P＜0．05）含量明显下降，结论：肝癌细胞体外增殖过程对精到，谷氨酰胺，苏氨酸，牛磺酸的消耗明显增加，此外，对丝氨酸，半胱氨酸也有一定的消耗，这6种氨基酸可能为肝癌代谢所必需，其中牛磺酸与苏氨酸是肝癌细胞所需氨基酸中有别于正常肝细胞的部分。     

外源蛋白在CHO细胞株中高效表达的策略

目的:随着基因工程技术的不断发展,目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质.真核细胞中CHO细胞与其他表达系统相比具有许多优点,是目前重组糖基蛋白生产的首选体系.本文着重阐述外源蛋白在CHO细胞中高效表达的策略.     

生产抗Tim3单抗CHO细胞N-1灌流高密度培养工艺研究

通过开发高表达量、高效率重组人源化靶向Tim3的单克隆抗体细胞培养工艺,来显著降低Tim3抗体生产成本,提升药品市场可及性。本研究对CHO细胞N-1种子灌流培养工艺和生产抗Tim3单抗CHO细胞高密度培养工艺进行小试工艺开发,实现了高效细胞培养抗体生产。结论：基于交替切向流动过滤(ATF)的灌注过程,N-1种子细胞密度可达53×10⁶ cells/mL;接种至终反应器后进行超高接种密度(uHSD)的补料分批生产,细胞跳过适应期直接进行对数增殖,2 d后细胞便进入稳定期进行蛋白高效表达。对比常规补料分批式生产,细胞周期由14 d缩短为8 d,产品表达量由3.51 g/L提升至5.68 g/L,产品关键质量参数与原始工艺高度类似,生产效率提升3倍左右。研究初步表明,采用对CHO细胞N-1种子灌流培养工艺对抗Tim3单抗CHO细胞高密度培养工艺进行小试工艺开发,实现了高效细胞培养抗体生产。     

大豆蛋白水解物对血浆胆固醇水平作用的初步探讨

目的:探讨膳食大豆蛋白水解物对高胆固醇模型大鼠血浆胆固醇及其有关血脂指标的影响,并对其可能的作用机理加以研究.方法:4周龄断乳雄性Wistar大鼠,经28d诱导高胆固醇模型以后,按血浆总胆固醇浓度将动物均衡分为两组,分别喂饲含酪蛋白和大豆蛋白水解物的纯合成高脂饲料56d.结果:经28d诱导高胆固醇模型后,高胆固醇模型大鼠的TC浓度是阴性对照组的1.51倍.又经56d喂饲含有处理因素的饲料后,酪蛋白组和大豆蛋白水解物组大鼠体重分别增加了198.5和117.4g;TC水平分别为(6.41±0.57)和(3.04±0.38)mmol/L;TG水平分别为(3.73±0.70)和(2.1 5±0.60)mmol/L;粪胆汁酸含量分别为(0.74±0.11)和(0.98±0.18)mmol/d;与酪蛋白组相比,大豆蛋白水解物组动物体重及TC,TG含量显著降-低.而粪胆汁酸含量显著增加(P＜0.05).大豆蛋白水解物组可使大鼠肝脏HMG-CoA还原酶mRNA,LDL-R mRNA的表达增强.结论:膳食大豆蛋白水解物摄入可降低高胆固醇模型大鼠TC、TG浓度、使粪胆汁酸排泄量增高,但对HDL-C水平无影响.另外,大豆蛋白水解物可以增强大鼠肝脏LDL-R基因的表达,这可能是其降低血浆胆固醇的机理之一.大豆蛋白水解物可影响血浆胆固醇水平,但其相应的作用机理还需进-步探讨.     

丹酚酸B对高糖干预下的人肾小管上皮细胞自噬相关蛋白的影响

目的 探究丹酚酸B对高糖干预下的人肾小管上皮细胞自噬相关蛋白的影响.方法 根据人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞培养方式的不同,分为对照组、葡萄糖组和实验组,对照组加入5.5 mmol/L的葡萄糖;葡萄糖组加入葡萄糖的浓度分为10、20和30 mmol/L;实验组在培养基中分别加入丹酚酸B和葡萄糖(30 mmol/L),丹酚酸B的浓度分为0.1、1、10和100 μmol/L,培养24 h.使用蛋白提取试剂盒分别提取3组培养细胞中的总蛋白,采用Bradford法测定不同培养组细胞自噬相关蛋白的含量,进行分析比较.结果 随着葡萄糖刺激浓度的增高,p62蛋白表达增加.24 h后,高糖可诱导HK-2细胞自噬相关蛋白p62表达增加,LC3表达减少,且呈剂量依赖性.与对照组相比,随着丹酚酸B干预剂量的增高,24 h后的细胞LC3的表达增加,不同剂量丹酚酸B干预可减少高糖诱导下的p62蛋白的表达增加,同时LC3的表达得到明显恢复,且呈剂量依赖性(P<0.05).Logistic回归分析的结果显示,LC3蛋白含量、p62蛋白含量是影响细胞自噬的独立影响因素.结论 在高糖的干预下,不同剂量丹酚酸B干预可减少高糖诱导下的p62蛋白的表达增加,同时LC3的表达得到明显恢复,且呈剂量依赖性.     

HPLC法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量

目的:建立用高效液相色谱法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量。方法:采用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)为衍生剂,与各种氨基酸柱前衍生后,用Waters 2690高效液相色谱仪,AccQ.Tag C18柱(150 mm×3.9 mm,4 μm),以水为溶剂A,Eluent(醋酸盐-磷酸盐缓冲液)稀释液为溶剂B,乙腈为溶剂C进行梯度洗脱,检测波长为248 nm,柱温37℃,进样量10μL。结果:所有氨基酸在37 min内测定完毕,回收率为101.4％-110.2％,RSD 1.1％-4.5％。结论:本法分离度好,快速,简便。可作为产品的质量控制方法。     

TLC法检测氨基酸中其它氨基酸限量的实验研究

用TLC法（薄层色谱法）对亮氨酸、异亮氨酸、联氨酸和丝氨酸等4种氨基酸中其它氨基因的检查进行了实验研究,分别确定出各氨基酸供试液浓度和点样量,以及对照液浓度和点样量。     

在线衍生-二极管阵列检测器测定复方氨基酸胶囊中7种氨基酸的含量

目的:建立以在线衍生-二极管阵列检测器联用测定复方氨基酸胶囊中7种氨基酸含量的方法。方法:采用高效液相色谱仪带全自动衍生功能的自动进样器,按预先设置的程序进样,并利用二极管阵列-荧光检测器串联分析。结果:7种氨基酸分离较好,且检测浓度分别在一定范围内与各峰面积积分值呈良好线性关系。结论:本方法操作简便、重现性好、灵敏度高、定量准确,可推广应用。     

Transport of Amino Acid Esters and the Amino-Acid-Based Prodrug Valganciclovir by the Amino Acid Transporter ATB0,+

PURPOSE: The purpose of this study was to analyze the transport of amino acid esters and the amino-acid-based prodrug valganciclovir by the Na(+)/Cl(-)-coupled amino acid transporter ATB(0,+). METHODS: The interaction of amino acid esters and valganciclovir with the cloned rat ATB(0,+) was evaluated in a mammalian cell expression system and in the Xenopus oocyte expression system. RESULTS: In mammalian cells, expression of ATB(0,+) induced glycine uptake. This uptake was inhibited by valine and its methyl, butyl, and benzyl esters. The benzyl esters of other neutral amino acids were also effective inhibitors. Valganciclovir, the valyl ester of ganciclovir, was also found to inhibit ATB(0,+)-mediated glycine uptake competitively. Exposure of ATB(0,+)-expressing oocytes to glycine induced inward currents. Exposure to different valyl esters (methyl, butyl, and benzyl), benzyl esters of various neutral amino acids, and valganciclovir also induced inward currents in these oocytes. The current induced by valganciclovir was saturable with a K0.5 value of 3.1+/-0.7 mM and was obligatorily dependent on Na+ and Cl-. The Na+:Cl-:valganciclovir stoichiometry was 2 or 3:1:1. CONCLUSIONS: Amino acid esters and the amino-acid-based prodrug valganciclovir are transported by ATB(0,+). This shows that ATB(0,+) can serve as an effective delivery system for amino acid-based prodrugs.     

HPLC法直接测定复方氨基酸注射液中的6种氨基酸

目的:建立HPLC法直接测定复方氨基酸注射液中6种氨基酸的含量。方法:KromasilC18柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为50mmol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值至2.4)-乙腈(94∶6),流速为1.5ml/min,检测波长为200nm,进样量10μl。结果:6种氨基酸线性回归方程的相关系数均在0.9997以上;平均回收率为100.3～101.4%,RSD均不超过0.7%。结论:本法操作简便、结果准确,可作为衍生化法的补充方法。     

Comparative Amino Acid Analysis of Bee Brood

Pharmaceutical Chemistry Journal -     

OPA-FMOC联用柱前衍生法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量

采用邻苯二甲醛（OPA）和氯甲酸芴甲酯（FMOC－CL）与氨基酸进行柱前衍生,HPLC测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量,方法简便快速,准确。     

我国氨基酸类药物研究进展

氨基酸是一类具有特殊生理功能的小分子化合物,近年来我国氨基酸类药物发展迅速,总结市场和研究情况,今后小肽、氨基酸螯合物以及氨基酸衍生物可能成为氨基酸类原料药发展的新方向;而复方氨基酸制剂则可能偏重于含谷氨酰胺的营养输液、肠内营养制剂和多腔袋营养制剂的开发。     

复方氨基酸注射液的变色原因探讨

目的探讨复方氨基酸注射液变色原因。方法采用实验方法进行考察。结果通过实验考察得出,残氧量、重金属离子、光照、温度、pH值影响复方氨基酸注射液变色。结论采用实验后总结出的生产工艺和生产条件进行复方氨基酸注射液的生产,未出现变蓝现象,生产正常稳定,产品质量符合标准。     

复方氨基酸制剂的类型及合理应用

本文对复方氨基酸制剂的类型、合理应用、不良反应进行了概述.复方氨基酸制剂为肠外营养药,具有促进人体蛋白质代谢正常,纠正负氮平衡,补充蛋白质,加快伤口愈合的作用.目前复方氨基酸制剂种类繁多,医师应根据患者病情需要选用复方氨基酸制剂.平衡型、疾病适用型和小儿用氨基酸各有适应证和禁忌证,不能混用,同时,近年来由复方氨基酸引起的不良反应时有发生,应引起临床医务人员的重视.