维拉帕米抑制原代培养兔视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究

为评价维拉帕米(verapamil)对兔视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)增殖的影响,在原代培养的兔RPE中分别加人不同浓度的维拉帕米溶液(0.1μmol/L,1 μmol/L,1×101μmol/L,1×102μmol/I,1 ×103μmol/L,1×104μmol/L),于培养72 h后用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,在酶联免疫测定仪上测630 nm处吸光值,同对照组相比,计算出不同药物浓度条件下的抑制率.结果表明维拉帕米在0.1μmol/L浓度以上对RPE的增殖有抑制作用;在10 μmol/L浓度时使RPE增殖率显著下降.提示维拉帕米作为钙通道拮抗剂对RPE的增殖有抑制作用,可作为今后临床上防治增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的药物进行研究.     

维拉帕米对血清诱导的兔视网膜色素上皮细胞增殖调节作用的研究

目的 :研究维拉帕米 (Verapamrl,Ver)对兔视网膜色素上皮 (RPE)细胞增殖的抑制作用。　 方法 :用流式细胞仪 (FCM )检测Ver对兔RPE细胞增殖周期的影响。　结果 :Ver能明显抑制血清诱导的兔RPE细胞的增殖 ,可使细胞更多地滞留在G1期 ,阻止细胞由G1期进入S期 ,并具有浓度依赖性和时间依赖性。　结论 :Ver能明显抑制血清诱导的兔RPE细胞增殖 ,可望成为新的防治增殖性玻璃体视网膜病 (PVR)的药物之一。     

羊膜对培养的人视网膜色素上皮细胞增殖影响的实验研究

目的　观察羊膜是否对视网膜色素上皮细胞 (Retinalpigmentepithelial ,RPE)的生长有影响 ,探讨羊膜用于治疗增殖性玻璃体视网膜病变 (Proliferativevitreoretinopathy ,PVR)的潜在可能性。方法　运用MTT比色法 ,观察羊膜匀浆在不同浓度 (4 0、80、160 μg ml)及不同作用时相点 (2 4、48、96h)对人RPE增殖的影响。 结果　①在第 2 4小时 ,3个浓度羊膜匀浆均对人RPE增殖起抑制作用 ,而且随浓度增加抑制作用减弱 ,抑制率 (5 0 774%、2 7 3 87%、14 80 2 % )间相差显著 (P <0 0 5 ) ;在第 48、96小时 ,羊膜匀浆在低浓度时 ,对人RPE增殖起抑制作用 ,而在中、高浓度为促增殖作用 ,其中在第 48小时抑制率 (4 494%、-0 944 %、-3 693 % )间相差不显著 (P >0 0 5 ) ,在第 96小时时抑制率 (8 3 88%、-9 42 5 %、-17 65 1% )间相差显著 (P <0 0 5 )。②羊膜匀浆浓度为 40 μg ml ,各时相点对人RPE均为抑制增殖 ,抑制率间相差非常显著 (P <0 0 1) ;在浓度为 80 μg ml、160 μg ml时 ,随着作用时间延长 ,羊膜匀浆对人RPE增殖的作用逐渐由抑制变为促进作用 ,抑制率间相差显著 (P <0 0 5 )。结论　羊膜匀浆在低浓度 ,短时间内对人RPE增殖有抑制作用 ,而在高浓度、长时间则对RPE增殖有促进作用。羊膜匀浆用     

苏拉明对培养的人视网膜色素上皮细胞DNA合成的影响

目的 探讨苏拉明(suramin)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell,aPE)DNA合成的影响，为防治增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)提供理论依据。方法 将不同浓度的苏拉明加入培养的人RPE细胞，分别于48h、96h后用氚-标脱氧胸苷(tritium—labelled thymidine deoxyri-bose，^3H—TdR)掺入法测定DNA合成抑制率；以300mg／L苏拉明作用于RPE细胞，用流式细胞仪(flowe,cytometry，FCM)分析RPE细胞周期。结果 苏拉明在100～400mg／L范围内对培养的人RPE细胞DNA合成有明显的抑制作用，且具有剂量-效应及时间-效应关系；FCM显示苏拉明将RPE细胞阻抑于G2／M期。结论 苏拉明能抑制RPE细胞DNA合成，可作为防治PVR的药物进一步研究。     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养

目的：将猪视网膜色素上皮(RPE)细胞进行体外培养，为研究RPE细胞的功能及治疗有关眼底疾病提供细胞来源。方法：采用胰酶2次消化法分离猪RPE细胞，15％DMEM培养液培养，每天倒置显微镜观察细胞生长情况，并作流式细胞仪分析培养细胞的细胞周期。以免疫组织化学法鉴定培养细胞的来源。结果：离体培养细胞初期呈圆形，富含黑色素，12～24h贴壁呈圆形、梭形及不规则形。传代后细胞渐趋透明。免疫组化证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。细胞周期分析提示体外培养的RPE细胞保持正常的繁殖能力。结论：培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源。     

转移生长因子β2对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成增殖影响的研究

目的：为研究转移生长因子β2（TGF－β2）对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用。方法：取自愿者贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞，用DMEM加10％血清及MEM氨基酸和庆大霉素，进行细胞传代培养。用溶血磷脂酸、转移生长因子β2（TGF－β2）及TGF－β2＋LPA进行视网色素上皮细胞增殖试验，用细胞染色法进行细胞计数，提取视网膜色素上皮细胞DNA，用Spectrophotometer进行DNA定量测定。结果：含有和／或缺乏1％小牛血清的两种LPA（10uM）均明显刺激视网膜色素上细胞增殖，但这种细胞的增殖被2nG/ml的转移生长因子－β2所阻滞。结论：增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是一种以细胞增殖为主的疾病，参与增殖的主要细胞为视网膜色素上皮细胞，转移生长因子－β2能阻滞体外培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖，应用TGF－β2治疗由RPE细胞引起的PVR疾病，仍需进一步深入研究。     

1-磷酸鞘氨醇对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的研究1-磷酸鞘氨醇对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响。方法采用MTT法研究不同浓度、不同作用时间1-磷酸鞘氨醇对hRPE细胞增殖的影响。结果加入不同浓度S1P24 h后,仅浓度为1 ug/ml组的RPE细胞与对照组相比有统计学意义,加入不同浓度1-磷酸鞘氨醇48 h后,1×10~(-2)、1×10~(-1)、1μg/ml组与对照组相比有统计学意义,加入不同浓度1-磷酸鞘氨醇72 h后,1×10~(-3)、1×10~(-2)、1×10~(-1)、1μg/ml组与对照组相比有统计学意义。各实验组,培养24、48或72 h后,相同浓度各时间点OD之间比较差异有统计学意义。各浓度组培养24及48 h后,相同浓度两时间点OD值比较差异均有统计学意义;0、1×10~(-4)、1×10~(-3)、1×10~(-2)、1×10~(-1)μg/ml组培养48及72 h后,相同浓度两时间点OD值比较差异均有统计学意义。结论 1-磷酸鞘氨醇可促进体外培养的hRPE细胞的增殖,并具有明显的浓度及时间依赖性。     

维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的：观察维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的影响。寻找有效、安全、方便的药物以防治增增性玻璃体视网膜病变。方法：分别将不同浓度的维拉帕米加入体外的兔ＲＰＥ细胞,用噻唑蓝（ＭＴＴ）比色法在自动酶标测定仪测５４０ｍｍ处的吸光值Ａ「旧称光密度（ＯＤ）」,计算出不同浓度条件下的细胞增殖抑制率及５０％抑制浓度,同时用２％台盼蓝色,测定细胞活性。结果：Ｖｅｒ在所设浓度范围内均明显抑制血清诱导的兔ＲＰＥ细胞的     

不同光照时长对体外培养人视网膜色素上皮细胞光损伤凋亡的影响

目的 研究不同光照时长对体外培养的人视网膜色素上皮细胞（hRPE）凋亡的影响,筛选出最佳建造光损伤模型的光照时长,为后续研究视网膜光损伤机制及光损伤保护提供必要的实验基础.方法 体外培养人视网膜色素上皮细胞（h RPE）,用三基色冷光灯模拟自然光源,选取（2500 ±500） Lux作为基础光照强度,以不同光照时长（2、4、6h）对细胞进行照射,建立光损伤模型.分别采用MTS法和流式细胞术检测细胞活力及早期凋亡率,比较给予不同光照时长后,hRPE的活力及早期凋亡率的差异.结果 与空白对照组比较,不同光照时长（2、4、6h）均能抑制细胞活力及引起细胞凋亡;光照时间越长,细胞损伤越严重,光照6h组细胞活力下降明显（P＜0.05）;光照组细胞早期凋亡率较空白对照组升高（P＜0.05）,光照组间比较,光照4h组早期凋亡率升高明显（P＜0.05）.结论 不同光照时长均可造成hRPE不同程度的损害;给予4h时长光照后,hRPE损伤以早期凋亡为主,同时又保有较高的细胞活力,故选取4h作为最佳建造光损伤模型的光照时长.     

p21/WAF1基因对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 观察p21／WAF1基因对体外培养的人视网膜色素上皮(hRFE)细胞增殖的影响。方法hRFE细胞原代、传代体外培养，通过脂质体介导将p21／WAF1基因转人体外培养的hRPE细胞。免疫组织化学法检测p21蛋白表达水平，并用MTT法检测其对hRFE细胞增殖抑制的作用，同时利用流式细胞仪来分析p21／WAF1基因对细胞周期的影响。结果 MTT法显示p21／WAF1基因抑制hRPE细胞的增殖。流式细胞仪检测显示转染后Go／G1期比例明显增加，S期比例减少。结论 p21／WAF1基因可有效地抑制hRPE细胞的增殖活性。     

视网膜色素上皮细胞来源外泌体与老年性黄斑病变

老年性黄斑病变（age-related macular degeneration,AMD）也被称为年龄相关黄斑变性、增龄性黄斑变性。多双眼发病,病发时一般双眼先后或同时发病,出现中心暗点、视物变形等视觉障碍,多发生在50 岁以上的中老年中,且感染几率会随着年龄的增长而增加,成为导致当今中老年失明的重要原因。眼科领域普遍认为视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞分泌的外泌体很可能参与AMD 的发生与发展。RPE 细胞通过分泌携带内容物的外泌体,将其转移到邻近或远处细胞,完成细胞间的信息交流,并对细胞造成一定程度的影响,参与细胞生长与转移、血管生成,在免疫调节、炎症反应等诸多病理生理过程中发挥重要作用。在对RPE 细胞外泌体进行深入研究的同时,也发现了外泌体对AMD 早期诊断和治疗的新潜力,为AMD 的研究带来了新的方向。     

吲哚美辛对视网膜色素上皮细胞增殖、DNA合成及凋亡的影响

目的 探讨吲哚美辛(IN)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖、DNA合成及凋亡的影响.方法 分别采用MTT法和核酸蛋白分析仪测定IN对RPE细胞增殖及DNA合成的影响;用透射电镜和吖啶橙荧光染色对凋亡细胞作定性、定量分析.结果 与空白对照组相比,IN处理组RPE细胞数量减少,DNA浓度降低,细胞凋亡数增多,差异均有显著性意义(均P<0.05).结论 IN能抑制RPE细胞增殖和DNA合成,并能诱导细胞凋亡;在一定范围内,凋亡细胞数量随IN浓度增加和作用时间延长而明显增多.     

E2F decoy对培养的人视网膜色素上皮细胞增生的影响

为探讨转录因子E2Fdecoy策略对培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞增生的抑制作用，在阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000介导下将1μmol/LE2Fdecoy或无义decoy转入人RPE细胞中，用MTT法检测其对细胞增生活性的影响，RT-PCR检测细胞中PCNAmRNA表达水平的变化。结果显示：转录因子E2Fdecoy能抑制RPE细胞的增生，为增生性玻璃体视网膜病变（PVR）提供了新的基因治疗手段。     

孔源性视网膜脱离模型视网膜色素上皮细胞CD44的表达变化

目的 研究兔孔源性视网膜脱离模型视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞CD44的表达,及其与孔源性视网膜脱离病理变化的关系.方法 90只健康有色兔随机分为5组建立不同模型:Ⅰ组:孔源性视网膜脱离组,28只眼;Ⅱ组:孔源性视网膜脱离伴玻璃体积血组,27只眼;Ⅲ组:单纯视网膜裂孔组,18只眼;Ⅳ组:玻璃体切除组,17只眼;Ⅴ组:空白对照组,90只眼.分别于手术后不同时间点(1、3,7、14,21、28 d)摘取各组兔眼眼球,用酶消化和机械分离法分离RPE细胞,制成细胞悬液,荧光免疫法标记CD44,用流式细胞仪检测各组RPE细胞膜上CD44的表达水平.结果 Ⅰ组和Ⅱ组模型眼均发生视网膜脱离,Ⅲ组和iv组模型眼未发生视网膜脱离.Ⅰ、Ⅱ组中RPE细胞CD44的表达明显高于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组,Ⅰ、Ⅱ组RPE细胞CD44表达水平在术后1 d即增高,7 d左右达到高峰,继而下降,Ⅰ、Ⅱ组与V组RPE细胞CD44的表达差异有极显著性意义(均P0.05).结论 孔源性视网膜脱离中RPE细胞CD44表达增强,RPE细胞CD44的表达变化与孔源性视网膜脱离的病理发展关系密切.     

视网膜色素上皮细胞光损伤模型的建立与评估

目的 通过不同光照时间和光照强度,探索建立最佳视网膜色素上皮细胞光损伤模型,为视网膜光损伤细胞造模方法提供理论依据.方法 选取原代大鼠视网膜色素上皮细胞和大鼠视网膜色素上皮细胞系,LED白色冷光灯模拟自然光源,选取(2500、5000、7500、10000 Lux)作为光照强度,以不同光照时间(6、12 h)对细胞进行照射,建立光损伤模型,镜下观察细胞形态,采用MTT法检测细胞活力.结果 光照处理后,RPE细胞活力受到抑制,随着光照强度及时间增强,细胞活力降低明显,原代细胞6 h 7500、10000 Lux和12 h 5000、7500、10000 Lux,细胞系6 h 10000 Lux和12 h 7500、10000 Lux,视网膜色素上皮细胞活力均低于空白组(P<0.01).结论 RPE细胞活力受光照时间及强度抑制,原代细胞较细胞系对光损伤更敏感.     

热休克蛋白90抑制剂对视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的 :探讨热休克蛋白 90 (heatshockprotein 90 ,Hsp90 )抑制剂对培养的视网膜色素上皮 (Retinalpigmentepithelial,RPE)细胞端粒酶活性以及RPE细胞增生的影响。方法 :用分子原位杂交方法分别检测对照组和Hsp90抑制剂组RPE细胞端粒酶活性 ;末端缺口标记 (terminalUTPnick endlabeling ,TUNEL)法分别检测上述 2组细胞中凋亡细胞的比率 ;在上述 2组细胞中分别用甲基偶氮唑蓝 (metheltetrazolium ,MTT)法检测细胞增生状况。结果 :与RPE细胞对照组相比 ,加入Hsp90抑制剂组RPE细胞端粒酶活性显著降低 ,凋亡细胞的比率明显增高 ,RPE细胞生长抑制率升高。结论 :Hsp90抑制剂可抑制RPE细胞中端粒酶的活性 ,从而抑制RPE细胞的增生并引起RPE细胞的凋亡