不同标本对荧光实时定量PCR法测定HBV—DNA结果的影响

目的 利用沉淀煮沸裂解法提取HBV核酸，探讨不同的临床标本和贮存条件对荧光定量PCR法测定乙型肝炎病毒核酸（HBV－NDA）结果的影响，为临床标本的收集和贮存提供依据。方法 按不同要求收集特定的临床标本，用本实验室使用的HBV－DNA提取方法提取DNA模板，再用荧光实时定量PCR法检测HBV－DNA的含量。结果 经EDTA、中等含量肝素、枸橼酸钠抗凝血浆标本与相应血清标本测定HBV－DNA的含量无显著性差别均（P＞0．05），但高浓度肝素（1000U／ml)抗凝管结果显著降低（F值为25．96；P＜0．05）；溶血、高血脂标本、标本反复冻融、血浆（清）标本在室温下短期贮存（48h内）对HBV－DNA含量均无明显影响（P＞0．05）。结论 用本实验室使用的HBV－DNA提取方法，可使抗凝剂及其它PCR反应抑制物质对HBV－DNA测定结果影响降到最低，从而使临床无污染标本一般均可接受。     

核酸提取方法在聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸中的评价

目的 对不同核酸提取方法在荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）检测血清乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）含量中应用进行评价，为临床方法学选择和实验结果的评价提供理论依据。方法 选用直接煮沸裂解法、NP－40煮沸裂解法、沉淀煮沸裂解法、磁珠核酸提取法等4种核酸提取方法提取乙型肝炎血清标本和含不同含量肝素的血清标本中HBV DNA模板，用荧光实时定量PCR法对其进行准确定量，从提取效率、抗干扰能力方面进行评价。结果 4种核酸提取方法中磁珠核酸提取法提取效率为最高，对数换算后，以此相对提取效率为100％，则直接煮沸裂解法为最低81％（P＜0．05）、NP－40煮沸裂解法为95％（P＞0．05）、沉淀煮沸裂解法为88．7％（P＜0．05）；从抗干扰能力方面，当肝素含量为500U／ml时，磁珠核酸提取法抗干扰能力最强，沉淀煮沸裂解法次之、直接煮沸裂解法和NP－40煮沸裂解法为最差，其HBV DNA含量抑制率分别为9．4％、13．5％、35．4％、52．7％。结论 本实验结果认为磁珠核酸提取法为实验室首选的核酸提取方法。     

144例HBV感染者血清PCR-HBV-DNA与Pre-S_2相关性观察

HBV感染期间，血清HBV－DNA、HBeAg是代表HBV复制的指标．我们应用聚合酶链式反应（PCR）检测了144例乙型肝炎病人血清中HBV－DNA，同时用ELISA法测定了Pre－S：，旨在证实HBeAg、HBV－DNA、Pre－S：三个病毒复制指标的相关性，以了解HBV感染者病毒复制情况．1材料和方法1．1血清标本来源1994年1月～9月我院住院的144例乙型肝炎病人血清．其中52例HBeAg（＋）／抗MBe（－），44例HBeAg（－）／抗一HBe（＋）；48例HBeAg（－）／抗，ute（－）．1．2HBV—M检测ELISA法：试剂盒由上海市传染病医院提供．1．3Pre—…     

血红蛋白和宫颈黏液对人乳头状瘤病毒分型的影响

目的探讨血红蛋白和宫颈黏液对导流杂交基因芯片（HybriMax）技术检测人乳头状瘤病毒（HPV）分型结果的影响。方法应用碱裂解法分别提取不同类型的宫颈脱落细胞样本的HPvDNA,经扩增后采用HYbriMax技术对HPVDNA进行分型检测。结果（1）非溶血样本经不同浓度（0．75～24．0g／L）血红蛋白处理后,HPV分型结果不受影响,符合率为100％。（2）无宫颈黏液标本和宫颈黏液标本HPVDNA的阳性率分别为25．11％和20．92％,差异有统计学意义（χ2=5．364,P〈0．05）。（3）宫颈黏液标本和无宫颈黏液标本的复查率分别为6．91％和2．49％,差异有统计学意义（χ2=24．049,P〈0．01）。结论溶血的宫颈脱落细胞标本,可采用碱裂解法提取HPVDNA进行HybriMax技术分型检测。标本中的宫颈黏液可影响本法对HPVDNA分型的检测。     

从石蜡包埋的淋巴瘤组织提取DNA并定量检测EB病毒

目的 定量检测石蜡包埋的淋巴瘤组织中EB病毒（EBV）的表达，方法 对TES水浴DNA提取法进行了改良，从石蜡包埋的淋巴瘤组织中提取高质量的基因组DNA，以实时荧光定量PCR方法检测淋巴瘤组织EBV。结果在60例标本中平均提取DNA量为3．97ng（10／μm厚切片2片），86．7％（52／60）标本DNA的纯度（260nm／280nm）≥1．6，其中50％（30／60）淋巴瘤组织EBV呈阳性表达（10^0～10^6拷贝／ngDNA）。结论 采用改良TES水浴法能获取石蜡包埋组织中高质量基因组DNA，使用该新的实验技术可有效地利用现有的标本资源进行与疾病相关科学的研究。     

PCR—ELISA检测TB—DNA方法学建立及临床应用评价

目的 建立PCR－ELISA检测TB－DNA的方法学，探讨其最佳实验条件及优化组合，结合涂片法、培养法和PCR电泳法评价其临床应用价值。方法 常规PCR引物用地高辛标记，使扩增产物带有地高辛标记成分，再通过亲和素－生物素系统把生物素标记探针包被在固相聚丙乙烯微孔中，通过固相探针与TB－DNA扩增产物进行杂交与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应，经NPP显色后测其A405nm值的大小，与同样操作处理的不同浓度标准菌株A值比较，推出样品中TB－DNA含量。结果 建立该法的最佳实验条件为PCR循环次数为35次，杂交温度为42℃，杂交时间为1h，探针浓度为0.2uM，包被浓度为10μg/ml。经北京胸部肿瘤结核病医院、北京胸科医院及中国人民解放军第309医院三家医院621例临床标本验证，其中结核组464例，该法检出率为57．3％（266／464），而涂片法仅为31．7％（147／464），培养法为35．8％（166／298），PCR电泳法检出率为45．7％（212／464），各法比较存在显差异（P＜0．01）。结论 本法作为结核病的一项免疫学和分子生物学检测指标，具有较高的临床推广应用价值。     

HCG试纸条在HCG定量中的应用

人类巨细胞病毒（HCMV）在人群中感染率较高，是先天性感染中最常见的致畸致残的病毒。临床确诊比较困难。我们设计合成巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR（FluorescenceQuantitativePCR，FQ－PCQ）诊断试剂盒，以一完全闭管式的PCR和荧光杂交技术相结合所产生的实时检测定量PCR方法，检测了３０１例产妇的血标本，３２４例新生儿脐血标本和２５６例儿童血标本HCMV－DNA的含量，同时与ELISA方法和常规PCR进行比较，探讨该方法在巨细胞病毒的临床诊断中的应用价值。３０１例产妇HCMV－IgM阳性４５例，阳性率为１４．９％，F…     

改良碘化钾法提取冻存外周血基因组DNA的方法探讨

目的探讨用改良碘化钾法（改良法）提取长期冻存外周血基因组DNA的方法。方法对碘化钾（KI）法加以改良,包括：血量由100μL增加到200μL;使用0．9％NH4CL溶液代替无菌重蒸馏水裂解红细胞;增加裂解白细胞膜的5mol／LKI溶液的用量（为70μL）;低温（4℃）离心。然后用改良碘化钾法从82份．80℃冻存外周血标本中提取基因组DNA。同时使用碘化钾法提取其中的30份血标本,比对两种方法提取DNA的浓度和纯度,并进行CYP2C19相关基因PCR扩增。结果两种方法所提取的DNA浓度和纯度分别是碘化钾法为128．2±34．9μg／mL和A260／A280 1．74±0．08,改良法为220±91．29μg／mL和A260／A280 1．87±0．12。改良法获得的DNA纯度更高,差异有统计学意义（P〈0．01）,通过增加样本量及对方法进行改良获得的DNA量较多。对改良后方法提取的基因组DNA进行PCR扩增,结果稳定。结论改良碘化钾法从长期冻存外周血中所提取的基因组DNA质量较高,能够满足对临床冻存样本研究的需求。     

冷冻治疗宫颈糜烂430例分析

我院自1994～1998年用冷冻治疗宫颈糜烂430例,效果良好,分析如下。1临床资料1．1一般资料通过普查及门沙发现宫颈糜烂患者430例。年龄22～51岁,重度（糜烂面积超过宫颈口面积2／3以上）80例,中度（糜烂面积占宫颈口面积1／3～2／3）154例,轻度（糜烂面积小于子宫颈口面积1／3）196例。1．2治疗方法术前常规作子宫颈刮片,排除宫颈其它病变。手术直选择在月经干净后3～7天内进行。制冷剂采用液氮（－196℃）。患者取膀胱截石位,常现清洗外阴,消毒,然后放置阴道窥器,充分暴露宫颈,清除宫颈粘液。根据糜烂的程度及具体情况选择适当的…     

应用聚合酶链反应检测南京地区TT病毒感染

目的：了解南京地区TT病毒感染情况。方法：采用巢式PCR方法检测血清标本中TTV－DNA。结果：163例病毒性肝炎患者血清标本中,TTV－DNA总检出率为21.5％（35／163）,其中甲型肝炎13.3％（4／30）,乙型肝炎21.3％（16／75）,丙型肝炎20.0％（3／15）,戊型肝炎5.3％（1／19）,非甲－庚型肝炎45.8％（11／24）。结论：南京地区存在TTV感染,TTV是导致非甲－庚型肝炎的重要病因,TTV可能存在非血源性传播途径。     

人乳头瘤病毒E6／E7mRNA在不同程度宫颈病变中的应用价值

目的：探讨人乳头瘤病毒（HPV）E6／E7 mRNA水平在不同程度宫颈病变中的应用价值。方法选取2011年4月至2013年4月广东省中医院妇科门诊收治的HPV感染患者430例,将HPV‐DNA阳性标本根据病理资料分为炎症组、CINⅠ组、CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组和宫颈癌组。用反转录聚合酶链反应（RT‐PCR）检测各组标本的HPV E6／E7 mRNA水平,比较不同宫颈病变组间HPV‐DNA病毒载量及 HPV E6／E7 mRNA阳性检出率的差异情况。结果随着宫颈病变程度增加,HPV‐DNA病毒载量未呈现逐级递增的趋势,各病变组间的病毒载量两两比较差异无统计学意义（P＞0．05）;而HPV E6／E7 mRNA阳性检出率则逐级递增,除炎症组与CINⅠ组的检出率比较差异无统计学意义（P＞0．05）之外,其余各组之间的检出率两两比较差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论 HPV E6／E7 mRNA与宫颈病变程度有高度的相关性,可作为宫颈疾病筛查的重要检测指标。     

415例HBV感染的不同血清学指标组合的HBV—DNA的检测

目的 了解HBV感染的不同血清学指标组合的HBV－DNA阳性情况。方法 对415份血清同时行ELISA方法测定HBV－M及普通PCR法检测HBV－DNA。结果 HBsAg( )组HBV－DNA阳性率为77．8％（270，347），HBsAg(-)组HBV－DNA阳性率19．1％（13／68），二者差别显著（P＜0．001）。其中153例HBsAg( )HBeAg( )抗HBc( )血清，HBV－DNA全部阳性，阳性率为100％，HBsAg（ ）抗HBe( ）抗HBc( )组血清HBV－DNA阳性率为66．9％（79／118），HBsAg( )抗HBc( )组血清HBV－DNA阳性率为50％（38／76），抗HBs( )组为18％（9／50），9例抗HBs( )抗HBe（＋）抗HBc( )血清中2例HBV－DNA阳性，2例抗HBs( )抗HBc( ）血清中1例HBV－DNA阳性，4例单一抗HBc( )血清中1例HBV－DNA阳性。结论 单凭HBsAg或HBeAg是否阳性来判断肝脏中HBV复制及有无传染性是不够的，易造成部分慢性乙型病毒性肝炎的漏诊，对HBsAg阴性无论抗HBs是否阳性，只要有HBV感染后的任何血清学依据，都应进一步检测血清HBV－DNA作为诊断乙型肝炎的第二步筛选，有条件时肝活检加以证实。     

宫颈电环切除术治疗宫颈疾病105例分析

目的：观察宫颈电环切除术（LEEP）治疗宫颈上皮内瘤样病变（CIN）和宫颈重度糜烂经微波治疗无效的临床疗效。方法：对105例患者采用LEEP治疗对其临床疗效作回顾性分析。结果：105例患者中90例CIN患者15例为宫颈重度糜烂经一次微波治疗无效。90例中CIN患者术前术后病理诊断不变者占53．1％（48／90），术后病理级别下降者占32．5％（29／90），上升者占14．4％（13／90），手术切缘阳性3例，重度宫颈糜烂术后病理为CIN的4例。结论：LEEP是治疗CIN重度宫颈糜烂安全有效的方法。     

子宫颈癌患者人乳头瘤病毒及癌基因的检测

为了解人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）的某些类型及某些癌基因与宫颈癌发病及预后的关系，应用ＨＰＶ１６、１８，ｃ－Ｈａ－ｒａｓ－１及ｃ－ｍｙｃ四种分子探针，通过核酸分子杂交技术，对４４例子宫颈癌及１７例正常子宫颈组织进行检测，并分析其间的关系以及与子宫颈癌发生、发展和预后的关系。结果表明，ＨＰＶ１６、１８，ｃ－Ｈａ－ｒａｓ－１及ｃ－ｍｙｃ在宫颈癌组织中的阳性率分别为５０％（２２／４４）、７％（３／４４），６４％（２８／４４）及６８％（３０／４４）；正常子宫颈组织均为阴性。并发现宫颈癌细胞分化程度越高者，阳性率越低。据此，认为分子杂交技术检测ＨＰＶ１６、ｃ－Ｈａ－ｒａｓ－１及ｃ－ｍｙｃ可以作为判断子宫颈癌患者预后的重要指标。     

细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）加反相杂交技术在细菌ＤＮＡ检测中的应用。方法以１６ＳｒＲＮＡ基因为靶序列，设计引物及寡核苷酸探针，采用ＰＣＲ法加反相杂交检测标准菌株及临床标本的细菌ＤＮＡ。结果对２４株不同标准菌株进行ＰＣＲ扩增，均出现３７１ｂｐ长度的ＤＮＡ片段，敏感性试验可检测出１０－１２ｇ的细菌ＤＮＡ，与人类基因组ＤＮＡ、真菌及病毒无交叉反应；２２例血培养阳性标本及４例脑脊液培养阳性标本均扩增出３７１ｂｐ长度ＤＮＡ条带，反相杂交法区分革兰阳性／阴性细菌与培养结果相符。结论１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ加反相杂交技术检测细菌ＤＮＡ，具有特异、敏感、快速、准确的特点，为细菌感染的临床诊断提供了科学的依据     

α干扰素栓剂治疗宫颈糜烂

笔者用a干扰素栓剂治疗556例宫颈糜烂患者，并对其中498例采用多聚酶链反应（PCR）的方法，检出宫颈糜烂中人乳头瘤病毒（HPV）阳性患者181例，观察。干扰素栓剂对HPV病毒的抑制作用。1材料与方法1．1研究对象及方法1997年2～8月，选择我院门诊病人中，有白带增多、下腹坠胀感、腰酸、接触性出血或无明显症状，肉眼观察可见宫颈表面有红色糜烂面者。治疗前行白带常规检查，未见霉菌或滴虫，并有498例接受HPV－PCR检测，宫颈刮片防癌检查为阴性，志愿接受本治疗者，治疗前后宫颈糜烂面积及程度的诊断标准按高等医药院校教材《妇产科学…     

一种增强核酸分子杂交信号的方法

核酸分子杂交已成为分子病理学和分子生物学研究中的基本技术之一，并逐渐应用到临床基因检测中。实验中常遇到的问题是杂交信号往往较弱，影响了结果的评价。我们在实践中摸索到一种简便易行、质高价廉的增强核酸杂交信号检测的方法。现报告如下。1材料与方法1．1核酸提取按文献[1]介绍的方法从卵巢癌组织及正常卵巢组织中提取核酸DNA，在UV－754型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）上分别测定每份标本的OD值，计算其核酸含量［核酸含量=OD260×稀释倍数×（50／1000）]，然后置-20℃的冰箱备用。1．2点膜将预先浸过6XSSC的…     

质粒DNA简单快速提取及纯化回收

质位DNA提取的方法较多，每种方法都有各自的优点及局限，由于费时仅力以及议钠等条件的限制使得实验者不甚满意．本文介绍一种简单快速提取及统化回收质位的方法．1材料与方法1．1仪器①电泳仪；②DNA回收相（南京大学生化系产）；③紫外线透射仪，④台式高速高心机．1．2试剂①LB培养基（tryl）tO。10yL，yysttX－tract5g几，NaCI109／L调PH7．4后高压灭菌），②溶液1（50mmol／Lglucose，25mmol几Tris－HCIpHS．0，10mmol／LEDTApHS．0）；③溶液！（0．2mol／LNa0H，1％SDS）④溶液三（3mol／LNaAcpH4．8）；⑤异丙四…     

人乳头瘤病毒感染与宫颈糜烂的关系

目的：研究宫颈糜烂患者人乳头瘤病毒（H PV ）的感染情况。方法采用聚合酶链反应和核酸分子杂交技术对宫颈糜烂组及宫颈正常组进行H PV检测及分析。结果轻、中、重度糜烂组与宫颈正常组比较，H PV感染率差异均有统计学意义（P＜0．05），并且中、重度明显高于轻度糜烂组；乳头型糜烂者HPV检出率明显高于单纯型糜烂与颗粒型糜烂。结论 HPV感染与宫颈糜烂面积、程度有密切关系，应积极有效地治疗宫颈糜烂及 HPV的筛查，预防宫颈癌的发生。     

石蜡包埋尖锐湿疣组织中人类乳头瘤病毒(HPV)的PCR技术检测

以PCR技术检测石蜡包埋尖锐湿疣（CA）组织标本中HPV－DNA。实验结果：30例具有典型病理特征标本和14例病理特征不典型的标本均发现HPV－DNA6型或／和11型；2例诊断为假性湿疣的标本有1例检出HPV6型DNA；3例生殖道鳞癌有2例检出16型HPV－DNA；2例正常组织未检出HPV－DNA。这一结果表明用石蜡包埋标本在进行PCR研究中有特别用途，PCR可对尖锐湿疣（CA）的诊断提供直接、快速和准确的依据。