家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2C cDNA全长的克隆

目的克隆家族性急性髓系白血病相关新基因全长,在分子水平上探讨急性白血病发生发展的机制。方法以构建的家族性急性髓系白血病抑制性？肖减性文库中1个有差异表达的新基因EST序列（zywb4）为基础,综合应用电子克隆和cDNA末端快速扩增法（RACE）技术克隆家族性急性髓系白血病相关新基因的全长cDNA。结果获得家族性急性髓系白血病差异表达新基因ELF2C的全长cDNA和432bp的开放阅读框（ORF）,Blast检索为一功能未知基因,被GenBank收录,注册号为DQ359746。结论成功获得一个家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2CcDNA全长,为进一步研究其功能提供了依据。     

人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆

目的 克隆人卵泡抑素(FS)全长cDNA基因。方法 采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中扩增FS cDNA。构建PMD18-T载体，采用BamHⅠ、HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定。结果 RT-PCR扩增长度为968bp的基因片段，BamHⅠ、HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段，测序结果显示编码区无基因突变。结论 人FS全长cDNA基因克隆成功，并构建了重组PMD18-T载体。     

人类Quaking基因的cDNA克隆

研究发现 ,在Ｑｕａｋｉｎｇ(ＱＫ)突变小鼠 (战栗者 )中 ,由于位于 17号染色体ＱＫ基因 (ＱＫ ,ＱＫ 1～ 7,ＧｅｎＢａｎｋ登记号Ｕ44 940 )的缺失突变或点突变 ,导致其神经系统 (包括中枢及周围神经系统 )的髓鞘形成障碍 ,临床表现为以后半身为主的震颤等 ,严重者可于胚胎早期死亡[1,2 ] 。人类ＱＫ基因尚未克隆 ,为此。我们通过同源序列分析方法以小鼠的ＱＫ 1～ 7基因的编码区序列作为信息探针 ,成功地克隆了人类ＱＫ的 6种剪接型。一、材料和方法1 信息分析方法 ;信息分析方法在ＳＵＮ工作站采用ＧＣＧ软件包进行 ,根据大规模测序提供…     

高脂血症敏感兔肝组织差减cDNA文库的构建

目的：构建高脂血症敏感兔肝组织表达基因的抑制差减cDNA文库。方法：分别从兔高脂血症敏感组和非敏感组肝组织分离mRNA，合成双链cDNA，酶切后将敏感组cDNA分成两组，分别与不同的接头连接，再通过再轮差杂交和两次抑制PCR得到两者之间差异表达的cDNA，将PCR产物与T／A载体连接构建差减cDNA文库，挑取克隆进行PCR扩增鉴定，结果：建的差减cDNA文库包含500个克隆，其中463个有插入片段，大小范围在250－700bp之间。结论：用抑制性差减杂交及T／A克隆技术成功构建了高脂血症敏感免疫差异表达基因差减cDNA文库。     

全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略

基因全长cDNA克隆是研究基因功能的前提之一。新基因全长cDNA克隆的方法很多，目前比较可行且应用较多的主要是cDNA库筛选。本主要介绍了近年来比较常用的全长cDNA库的构建及全长cDNA的克隆(包括“电子”基因克隆)的策略和方法及其进展。     

HL-60细胞内同源盒HOXA1、cDNA基因的克隆

目的：研究同源盒ＨＯＸ基因的表达在ＡＴＲＡ诱导白血病细胞分化中的作用。方法：利用我们建立的一种高效、简单的ｃＤＮＡ克隆方法－ＨＯＸ家庭基因指纹图技术,克隆ＨＬ－６０细胞内的ＨＯＸｃＤＮＡ基因。采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术初步探讨ＡＴＲＡ对所克隆的ＨＯＸ基因表达的影响。结果：筛选出一个在ＨＬ－６０细胞内有表达的同源盒基因一ＨＯＸＡＩ基因ｃＤＮＡ片段,初步研究证实,此基因的ｍＲＮＡ水平在ＡＴＲＡ的作用下被上调。结论：ＡＴＲＡ可诱导ＨＬ－６０细胞内ＨＯＸＡ１基因表达增强。提示在ＡＴＲＡ诱导细胞分化而治疗恶性肿瘤的分子机制中,包括上调ＨＯＸＡ１基因表达而致白血病细胞分化成熟。     

慢性间歇缺氧兔模型肝组织cDNA文库构建

目的:构建抑制性差减cDNA文库筛选鉴定慢性间歇性缺氧兔模型肝脏相关基因.方法:选取24只兔随机分成4组,分别为普通饲料喂饲组,高脂饲料喂饲组,间歇性缺氧组和高脂并间歇性缺氧组.提取高脂组和高脂并间歇性缺氧组兔肝脏组织mRNA,酶切cDNA,分别与不同的接头连接,经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA.将PCR产物与T/A载体连接构建差减cDNA文库.挑选克隆进行PCR扩增鉴定.结果:基于高脂组和高脂并间歇性缺氧组兔腹主动脉和肝病理改变的基础,构建的差减cDNA文库包含500个克隆,其中462个有插入片段,大小为250～700 bp.鉴定获得1个新基因Cthrc1,GenBank登录号XM_418373.结论:对Cthrc1基因的研究有助于进一步阐明慢性间歇性缺氧促进动脉粥样硬化形成的分子机制.     

介绍cDNA基因和差异表达基因的克隆技术

cDNA文库的构建是克隆cDNA基因重要的方法，方法的发展经历了置换合成法、SMART方法、固相cDNA文库的构建和逆转录病毒cDNA表达系统构建。细胞内分布克隆方法用于克隆功能性基因。而差异表达基因克隆方法用于克隆不同生命状态下表达基因。     

利用电子差异展示方法克隆人类睾丸特异性新基因

目的 克隆一个新的人睾丸特异性基因.方法 运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达.然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长eDNA序列.结果 新基因全长1197 bp,开放阅读框为504～806 bp,定位于6p21.1-p21.2.编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10 000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性.克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRGI(restis development related gene 1),GenBank登录号为DQ168992.结论 电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因足行之有效的.     

日本血吸虫合抱相关未知功能基因SJCHGC00821的克隆及生物信息学分析

目的 克隆与日本血吸虫合抱相关但未知功能的新基因SJCHGC00821，构建其真核表达载体，并应用生物信息学初步探讨其功能。方法 应用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增SJCHGC00821基因全长ORF，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3中，通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定。应用生物信息学初步分析其细胞定位、蛋白序列、结构域及功能。结果 获得日本血吸虫合抱相关未知基因SJCHGC00821的克隆，序列分析结果提示该cDNA序列含有一个597bp的完整阅读框序列，编码198个氨基酸，其编码蛋白的理论分子量为22．76kDa，等电点为4．84。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论 成功地克隆了日本血吸虫SJCHGC00821基因全长ORF，构建了其pcDNA3真核表达载体，为进一步研究其结构与功能创造了条件。     

Molecular cloning and characterization of NAG-7: a novel gene downregulated i n human nasopharyngeal carcinoma

目的　分离位于染色体 3p2 4 2 6区域中鼻咽癌新的抑瘤基因。方法　在染色体 3p2 4 2 6鼻咽癌杂合性丢失 (lossofheterogosity ,LOH)高频区 ,用RT PCR及Northern杂交检测了2 0个表达序列标记 (expressedsequencetag ,EST)在鼻咽癌细胞株HNE 1和原代培养的正常鼻咽上皮细胞中的表达水平 ,并对其中一个在鼻咽癌细胞株HNE 1中表达下调的EST在 19例鼻咽癌活检组织中的表达进行了检测。用cDNA文库筛选方法获得其全长cDNA序列 ,对该序列进行了初步分析。结果　获得一个位于染色体 3p2 5 3的新基因 ,命名为NAG 7基因。该基因在 2 6 3% (5 19)的鼻咽癌活检组织中表达下调。它全长 16 6 7bp ,其开放阅读框 (openreadingframe ,ORF)编码一个含 94个氨基酸的碱性蛋白质 ,分子量为 110 2 3 87道尔顿 ,预测为一跨膜蛋白质。它含有一蛋白激酶C磷酸化位点和肉豆蔻基位点。迄今为止 ,NAG 7基因序列在基因库中未见任何同源性基因。结论　NAG 7基因是一个在鼻咽癌中表达下调的新基因 ,它的改变可能参与了鼻咽癌的发生发展     

人前列腺组织中雄激素受体亚型表达与基因克隆

目的：研究人前列腺组织中雄激素受体（AR）亚型的表达及其基因学基础。方法：应用聚丙烯酰胺凝胶等电泳和分子生物学基因克隆技术,对1例前列腺增生症（BPH）患者手术切除的前列腺组织中的AR亚型蛋白表达与AR亚型基因进行了研究。结果：在该例患者增生良性前列腺组织中,发现有3个AR亚型蛋白表达,并克隆出了1条有1913个核苷酸组成的AR亚型cDNA,命名为PHAR－1。GenBank登记号为：BankIT372205 324243.PHAR－1与GenBank中已登记的AR序列比较,有3段序列共961个核苷酸相同,有952个核苷酸组成的序列不同,显示了这条新的AR cDNA的同源性和特异性。结论：同一组织标本的3个AR亚型蛋白表达并克隆1条ARcDNA基因的结果,提示AR亚型蛋白可能源于一基因的不同起始密码子的转录作用。AR亚 型cDNA的克隆为研究活AR亚型基因的药物,探讨治疗前列腺癌的新策略奠定了基础。     

cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene

Background This investigation was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma using cDNA microarray and the characterization of one novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma tissues and normal brain tissues, and mRNA was used to make probes. After hybridization and washing, the results were scanned using a computer system. The gene named 681F05 clone was an expressed gene to human glioma through four-time hybridization and scanning. Subsequently northern blot analysis was performed by northern blot, 5‘RACE and bioinformatics. Results Fifteen differentially expressed genes to human glioma were obtained through four-time hybridization and scanning. Northern blot analysis confirmed that 681F05 clone was low-expressed in human brain tissues and over-expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that 681F05 clone is two cDNA clones encoding two novel proteins that are highly identified to the cyclophilin isoform 10 of C. Elgans, respectively. Sequence analysis revealed the two cDNA clones are two different splicing variants of a novel cycophilin-like gene (PPIL3a and PPIL3b). Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human PPIL3 may be correlated with the formation of human glioma.     

低氧诱导因子-1α的基因克隆

目的克隆低氧诱导因子-lα(HIF-1α)cDNA,为进一步研究HIF-1α基因在肿瘤基因治疗中的作用提供依据。方法从健康成人外周血液中提取总的RNA,利用特异性引物,用两步法进行RT-PCR扩增出约2500 bp的HIF-1αcDNA,与T载体连接后转化感受态细胞DH5α,建立HIF-1α的cDNA克隆。结果RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,可见一条清晰特异扩增带,长2500 bp;cDNA经酶切鉴定证实为人低氧诱导因子1α基因。结论成功克隆HIF-lαcDNA,为进一步研究HIF-1α奠定了基础。     

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的 分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法 采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northern blot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果 (1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长l238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northern blot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern blot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7 cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论 初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。     

肝细胞癌候选相关基因IDD01的克隆与鉴定

目的鉴定表达序列标签(EST)在肝细胞癌(HCC)和癌旁非癌组织表达,扩增其全长.方法采用半定量RT-PCR方法,对21例HCC患者的癌组织和癌旁非癌组织EST mRNA的表达情况进行检测,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增、测序获得全长,Blast检索GenBank.结果此EST在HCC癌组织中高表达,癌旁非癌组织中低表达(P＜0.05);序列全长为1 333 bp,含有完整开放阅读框(ORF)和Poly(A)尾;Blast检索为一功能未知基因.结论获得一个和HCC相关候选新基因,为进一步研究其功能打下基础.     

人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人白细胞介素7（hIL-7）的真核表达载体。方法：从人脾脏组织的总RNA中，用RT－PCR方法扩增出编码成熟hIL-7的cDNA，将其克隆于pMD18-T质粒中，并进行序列测定。再将hIL-7cDNA以正义及反义插入真核、原核双重表达载体pBK-CMV质粒，转化至大肠杆菌DH5α。最后将表达的lacz-hIL-7重组蛋白行SDS－PAGE电泳，并作考马斯亮蓝染色分析，western blot鉴定。结果：hIL-7序列测定结果与预期一致。pBK-CMV-hIL-7（正义插入）的无隆表达重组蛋白，western blot证实此蛋白为IL－7。结论：成功构建了hIL-7的真核表达载体，为进一步研究hIL-7的抗肿瘤作用创造了条件。