转染PDGF-B反义核酸和tPA基因预防狗冠脉搭桥术吻合口再狭窄

目的： 探讨联合应用组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因质粒和血小板源性生长因子（PDGF-B）反义核酸预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法： 建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型，构建tPA基因质粒并设计合成（PDGF-B）反义寡核苷酸，在冠状动脉搭桥术同时以超声波辅助转染心肌细胞和吻合口血管平滑肌细胞，采用常规病理、免疫组织化学、原位杂交以及形态测量方法观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和PDGF-B mRNA表达以及内膜增生的影响。结果： 成功转染tPA基因和（PDGF-B）反义核酸；2种基因联合应用显著抑制血管内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA，抑制率分别为65.01%和81.75%；显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积和吻合口血栓形成，使吻合口狭窄率显著减少62.63%。结论： 联合转染tPA表达质粒和PDGF-B的反义寡核苷酸在一定程度上抑制猪实验性冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。     

兔髂动脉内膜损伤后PDGF-BmRNA在血管壁原位表达增强

目的:探讨内膜损伤后血管平滑肌细胞(VSMCS)增殖的体内机制。方法:用球囊导管损伤兔髂动脉内膜建立VSMCS增殖模型,以自行设计、合成的血小板源性生长因子β(PDGF-B)cDNA探针和原位杂交方法检测了损伤后不同时期VSMCS表达PDGF-B mRNA与VSMCS表达增殖细胞核抗原和内膜横断面积增加关系。 结果:血管损伤后VSMCS 表达PDGF-B mRNA增强,计数内膜(0.25 mm×mm)×4面积中PDGF-B mRNA阳性细胞数分别为1、2和4周的31.93±14.63,26.50±9.25和24.85±13.65。其表达与VSMCS表达增殖细胞核抗原和内膜面积的增加密切相关。结论: 血管内膜损伤后VSMCS自泌性产生PDGF-B 是VSMCS增殖和内膜增生的主要原因之一。我们设计的探针为原位研究兔VSMCS PDGF-B mRNA的表达提供方便。     

联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响

目的：探讨联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响，探索一种理想的血管再狭窄的疗法。方法：选择20只新西兰家兔，实验组、对照组各10只，均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术，实验组行腺病毒介导的p21 cDNA溶液浸泡和反义c-fos寡聚核苷酸凝胶涂布；对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。术后2周取出移植血管，分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度（IT）、内膜平滑肌细胞（VSMC）数及PCNA阳性表达情况。结果：实验组移植血管IT、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减少，增殖细胞核抗原（PCNA）阳性表达情况亦较对照组明显减少。结论：联合转染p21基因和反义c-fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生。     

靶向转染纳米tPA基因预防狗冠脉搭桥术吻合口血栓形成和再狭窄的研究

目的探讨构建的白蛋白纳米组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因质粒超声微泡载体靶向转染心肌组织预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型,制备tPA基因白蛋白纳米超声微泡,超声波靶向转染心肌并获得tPA表达,观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和PDGF-BmRNA表达以及内膜增生的影响。结果成功靶向心肌转染tPA基因并获得了tPA基因有效表达。显著减少了动脉搭桥吻合口血栓形成,抑制率100%。抑制冠状动脉吻合口处内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA。显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积,使吻合口狭窄率减少68.29%。结论白蛋白纳米-超声微泡载体靶向转染tPA基因可预防狗冠状动脉搭桥术后吻合口血栓形成和再狭窄,这为人冠状动脉搭桥术吻合口血栓形成和再狭窄的防治提供实验基础。     

纤维蛋白胶外支架转染PCNA基因反义寡核苷酸预防移植静脉再狭窄

背景：前期研究成果,纤维蛋白胶不仅是一种良好的非限制性、生物可降解血管外支架,能够预防移植静脉内膜和中膜增生,而且是一种良好的药物缓释系统,能够提高血管外膜基因转染效率。 目的：验证应用纤维蛋白胶外支架转染PCNA基因反义寡核苷酸预防移植静脉再狭窄的作用。 方法：建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,随机分为模型组、纤维蛋白胶支架组、纤维蛋白胶联合反义PNCA组。后两组分别给予纤维蛋白胶和纤维蛋白胶与携带PCNA反义寡核苷酸腺病毒的混合物于静脉桥外周均匀喷洒。 结果与结论：移植后第28天模型组静脉移植物内膜和中膜增生明显,纤维蛋白胶外支架组静脉移植血管内膜和中膜增生程度明显减少(P  < 0.01),纤维蛋白胶联合反义PNCA组内膜和中膜增生程度明显少于纤维蛋白胶外支架组(P  < 0.05)。纤维蛋白胶联合反义PNCA组PCNA基因mRNA及蛋白表达明显减少纤维蛋白胶外支架组(P < 0.05),纤维蛋白胶外支架组表达明显弱于模型组(P  < 0.05)。提示血管外膜反义PCNA转染可进一步抑制移植静脉管壁PCNA表达,纤维蛋白胶外支架联合反义PCNA对移植静脉内膜和中膜增生有协同抑制作用。     

磷酸化修饰的反义TGF-β1寡核苷酸抑制血管损伤后内膜增殖

 目的：探讨反义转化生长因子β1（TGF-β1)寡核苷酸对血管损伤后血管平滑肌细胞（VSMCs）表型转变的影响及对内膜增殖的作用。方法：在跨过TGF-β1 cDNA序列的起始密码区ATG范围内,设计含15个碱基、无修饰或硫代磷酸化修饰的反义TGF-β1寡核苷酸（AS TGF-β1）及对照的正义（与反义寡核苷酸互补）寡核苷酸（S TGF-β1）。球囊导管损伤SD大鼠颈总动脉,术后7 d取出正常或损伤的血管进行VSMCs的培养,RT-PCR及蛋白印迹分别检测VSMCs生物学标志平滑肌22α蛋白（SM22α）、基质Gla蛋白和骨桥蛋白,以及TGF-β1和纤维连结蛋白（fibronectin,FN）mRNA和蛋白质的表达。采用ALZET 泵皮下注射硫代磷酸化修饰AS TGF-β1及S TGF-β1（90 μg·kg-1·d-1）,连续给药28 d后测定血管内膜与中膜的面积比（I/M）。结果：（1）AS TGF-β1对血管损伤后VSMCs TGF-β1 mRNA表达并无明显作用,但呈浓度依赖性抑制TGF-β1蛋白质的表达,而S TGF-β1不影响TGF-β1mRNA和蛋白质的表达。（2）AS TGF-β1呈浓度依赖性抑制血管损伤后VSMCs DNA的合成,而不管是AS TGF-β1还是S TGF-β1对正常VSMCs DNA的合成均无明显的量效作用;同时AS TGF-β1显著抑制了血管损伤后VSMCs FN的合成。（3）AS TGF-β1显著促进了VSMCs SM22α mRNA的表达,但抑制了基质Gla蛋白和骨桥蛋白mRNA的表达,这种相反的作用在001及01 μmol/L的水平最为明显。（4）硫代磷酸化修饰的AS TGF-β1治疗28 d后,显著抑制了颈动脉损伤后新生内膜的增殖,I/M比对照组下降了68%。结论：AS TGF-β1特异性抑制了VSMCs TGF-β1蛋白的表达,抑制血管损伤后VSMCs增殖及合成、分泌FN,减轻血管损伤后新生内膜的增殖。上述作用可能与逆转血管损伤后VSMCs的表型转变有关。     

川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖中CaN活性及增殖细胞核抗原表达水平的影响

目的：观察川芎嗪对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）中钙调神经磷酸酶（CaN）活性及增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平的影响。方法：建立AngⅡ诱导VSMCs增殖模型，应用免疫细胞化学法观察血管平滑肌细胞PCNA表达；并用酶促反应定磷法测定CaN活性。结果：AngⅡ组能够明显刺激VSMCs增殖，VSMCs细胞数目和细胞增殖活度明显高于正常对照组（P＜0.01）；CaN活性和PCNA表达量（A值）显著高于正常对照组（P＜0.01）。同时加川芎嗪处理，各组CaN活性和PCNA表达水平均显著低于AngⅡ组（P＜0.01）。结论：川芎嗪对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖有显著抑制作用，其机制与抑制CaN介导的信号转导进而抑制PCNA的表达有关。     

四逆汤对兔球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的: 观察四逆汤(SND)对兔腹主动脉球囊拉伤后血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和凋亡的影响,探讨VSMCs增殖和凋亡在动脉损伤后再狭窄(RS)中的作用及SND预防PCI术后RS的可行性。方法: 建立兔腹主动脉球囊拉伤模型,用SND进行干预,电镜观察中膜和内膜增殖和凋亡的VSMCs超微结构特征。用α-actin标记VSMCs并检测其增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期素E(cyclin E)的表达;Tunel法检测凋亡细胞,计算增殖和凋亡指数。84 d亚组行腹主动脉造影观察损伤段血管的狭窄程度。结果: SND治疗组中膜内膜VSMCs增殖程度明显轻于对照组,凋亡指数明显高于对照组(P<0.05),而且细胞凋亡持续的时间较长,到术后14 d才达高峰,以后才逐渐下降。术后84 d亚组血管造影显示治疗组损伤段腹主动脉狭窄程度明显小于对照组(P<0.05)。结论: 四逆汤能有效抑制VSMCs增殖,诱导其凋亡,减轻血管损伤后的狭窄程度。     

抗肿瘤药物DIM防治兔颈动脉球囊损伤术后再狭窄的实验研究

目的：观察DIM对兔血管成形术后再狭窄内膜增生的影响。方法：随机将兔分为假手术组、模型组及大、小剂量DIM治疗组，DIM做成乳剂后予腹腔注射给药。术前3 d开始给药，每只给药体积均为2 mL/d，假手术组与模型组予等体积的生理盐水。术后4周全部将兔处死，行HE染色观察动脉形态学改变，同时进行PDGF、TGF-β1的免疫组化及〖STBX〗bcl-2〖STBZ〗的原位杂交检测并计算其阳性率。结果：损伤动脉内膜厚度及面积、内膜/中膜面积与内膜/中膜厚度比显著增加。与模型组相比，DIM小剂量组的内膜厚度、内膜面积及内膜/中膜面积与厚度比、PDGF、TGF-β1与〖STBX〗bcl-2〖STBZ〗的阳性表达率均有所下降，但无显著差异(P＞0.05)，而DIM大剂量组效果显著，具有显著差异(P＜0.01)。结论：DIM可以抑制PTCA术后再狭窄的形成，其作用机制可能与抑制血管平滑肌细胞增殖及细胞生长因子和促进细胞凋亡有关。     

高糖和不同浓度胰岛素对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨高糖和不同浓度胰岛素对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响及可能机制.方法:组织贴块法原代培养大鼠胸主动脉VSMCs,用高糖和不同浓度胰岛素诱导细胞增殖.实验设对照组、高糖组、高糖和不同浓度胰岛素组.采用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]比色法测定VSMCs增殖;免疫细胞化学技术检测VSMCs增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)含量;RT-PCR技术检测VSMCs中PCNA mRNA的表达量;NO试剂盒检测培养基上清液中NO含量.结果:高糖能诱导VSMCs的增殖,而胰岛素则呈剂量依赖性地协同高糖诱导VSMCs增殖,最大作用效果出现在300 mU/L胰岛素培养的第5天;高糖可以使PCNA蛋白含量增加,而高糖和高浓度胰岛素(300 mU/L)合用则可使PCNA蛋白含量显著增加;高糖可使PCNA mRNA表达量增高,而高糖和高胰岛素(300 mU/L)合用则可使PCNA mRNA表达量显著增高;高糖可使NO含量降低,而高糖和高胰岛素(300 mU/L)合用则可使NO含量显著降低.结论:胰岛素呈剂量依赖性地协同高糖促进VSMCs增殖,使VSMCs PCNA蛋白含量和PCNA mRNA表达量增高,并协同高糖降低NO的产生.     

自体移植兔静脉细胞增殖与钙激活钾通道的变化

目的: 研究静脉移植后钙激活钾通道(K_Ca)的变化,并探讨其病理生理意义。方法: 将兔的双侧股静脉倒置移植于同侧股动脉缺损之间,采用离体血管灌流的方法,测定移植静脉环的张力。分别以图像分析和四唑盐(MTT)比色法检测移植静脉内膜增厚的程度以及K_Ca的阻断剂盐酸四乙胺(tetraethylammonium chloride, TEA)对培养的家兔股静脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖的影响。进而采用膜片钳技术记录K_Ca电流。 结果: 移植后1 week, 静脉的收缩性和内膜相对厚度没有显著变化。静脉移植后2 weeks,收缩性和内膜相对厚度显著大于对照组(P＜0.05, n=8)。移植后4 weeks静脉的收缩性和内膜相对厚度进一步大于对照组(P＜0.01, n=8)。TEA(2-8 mmol/L)显著增加培养VSMCs的MTT吸光值,并且有剂量依赖性(P＜0.05, n=8)。膜片钳实验结果显示,指令电位在(30-60)mV时,移植(1-4) weeks静脉VSMCs的K_Ca 电流密度均显著低于对照组(P＜0.05, n=5),指令电位在20 mV时,只有移植4 weeks静脉VSMCs的K_Ca电流密度显著低于对照组(P＜0.05, n=5)。结论: 自体移植静脉VSMC的K_Ca受到抑制,可能是血管收缩性增强、VSMCs异常增殖的原因,从而导致自体移植静脉痉挛和狭窄。     

microRNA-34a在低切应力诱导血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨micro RNA-34a(mi R-34a)在低切应力诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用。方法应用细胞联合培养平行平板流动腔系统对与VSMCs联合培养的内皮细胞(endothelial cells,ECs)施加1.5 Pa正常切应力(normal shear stress,NSS)和0.5 Pa低切应力(low shear stress,Low SS),加载时间为12 h。Western blotting检测联合培养VSMCs的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达,以此反映VSMCs的增殖能力。实时PCR检测联合培养VSMCs的mi R-34a表达变化。通过Target Scan、mi RWalk等网站预测mi R-34a的下游靶蛋白。Western blotting检测联合培养VSMCs的mi R-34a靶蛋白Forkhead转录因子J2(forkhead box j2,Foxj2)表达。通过mimics和inhibitor转染技术,分别上调和抑制VSMCs的mi R-34a表达,Western blotting检测Foxj2及PCNA的表达变化,验证mi R-34a和Foxj2之间的调控关系。结果与NSS相比,Low SS促进联合培养VSMCs的PCNA表达,并显著上调联合培养VSMCs的mi R-34a表达。通过Target Scan、mi RWalk等网站预测mi R-34a的下游靶蛋白为Foxj2。Low SS加载下联合培养VSMCs的mi R-34a靶蛋白Foxj2表达明显降低。静态条件下上调VSMCs的mi R-34a表达,靶蛋白Foxj2表达明显降低,PCNA表达显著升高;抑制VSMCs的mi R-34a表达,靶蛋白Foxj2表达明显上调,PCNA表达显著降低。结论 Low SS通过调控联合培养VSMCs的mi R-34a和靶蛋白Foxj2,促进VSMCs增殖。研究结果为进一步阐明动脉粥样硬化疾病的发病机制及药物治疗靶标提供新的力学生物学实验依据。     

Identification of platelet-derived growth factor A and B chains in human renal vascular rejection.

Platelet-derived growth factor (PDGF) exists as a dimer composed of two homologous but distinct peptides termed PDGF-A and -B chains, and may exist as AA, AB, and BB isoforms. The PDGF-B chain has been implicated as a mediator of renal vascular rejection by virtue of up-regulated expression of its receptor, PDGF beta-receptor, in affected arteries. A role for PDGF-A chain in mediating intimal proliferation has been suggested in human atherosclerosis (Rekhter MD, Gordon D: Does platelet-derived growth factor-A chain stimulate proliferation of arterial mesenchymal cells in human atherosclerotic plaques? Circ Res 1994, 75:410), but no studies of this molecule in human renal allograft injury have been reported to date. We used two polyclonal antisera to detect expression of PDGF-A chain and one monoclonal antibody to detect PDGF-B chain by immunohistochemistry in fixed, paraffin-embedded tissue from 1) normal adult kidneys, 2) a series of renal transplant biopsies chosen to emphasize features of vascular rejection, and 3) allograft nephrectomies. Immunohistochemistry was correlated with in situ hybridization on adjacent, formalin fixed tissue sections from nephrectomies utilizing riboprobes made from PDGF-A and -B chain cDNA. PDGF-A chain is widely expressed by medial smooth muscle cells of normal and rejecting renal arterial vessels of all sizes by immunohistochemistry and in situ hybridization. PDGF-A chain is also expressed by a population of smooth muscle cells (shown by double immunolabeling with an antibody to alpha-smooth muscle actin) comprising the intima in chronic vascular rejection. In arteries demonstrating acute rejection, up-regulated expression of PDGF-A chain by endothelial cells was detected by both immunohistochemistry and in situ hybridization. In contrast, PDGF-B chain was identified principally in infiltrating monocytes within the rejecting arteries, similar to its localization in infiltrating monocytes in human atherosclerosis. Although less prominent than the case for PDGF-A chain, PDGF-B chain also was present in medial and intimal smooth muscle cells in both rejecting and nonrejecting renal arteries. PDGF-A and -B chains have now been localized at both the mRNA and protein levels to the intimal proliferative lesions of vascular rejection. These peptides, which are known stimuli for smooth muscle cell migration and proliferation in experimental vascular injury, may have similar stimulatory effects on smooth muscle cells in an autocrine and/or paracrine manner to promote further intimal expansion and lesion progression in this form of human vasculopathy.     

L-精氨酸对大鼠血管损伤后内膜增生及相关细胞周期调控基因表达的影响

目的:研究L-精氨酸(L-Arg)对大鼠血管损伤后内膜增生及相关细胞周期调控基因表达的影响。方法:大鼠分为假手术组,球囊损伤组(又分为术后48h、7d和14d亚组)及球囊损伤+L-Arg组。取各组实验动脉段测新生内膜面积,并采用免疫组化及计算机图像分析法测细胞周期依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E(cyclinE)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平。结果:球囊损伤后14d组的血浆NO水平低于假手术组(P＜0.01),CDK2、cyclinE及PCNA均于球囊损伤术后48h在中膜表达,第7d、14d在内膜表达,中膜几无表达,随着内膜增厚表达水平上升。与球囊损伤后14d组相比,球囊损伤+L-Arg组的血浆NO水平增高(P＜0.01),新生内膜面积少59.1%(P＜0.01),CDK2、cyclinE及PCNA的阳性表达指数分别低36.1%,46.3%和76.2%(P均＜0.01)。结论:L-Arg可有效抑制血管损伤后内膜增生,其机制可能与逆转CDK2、cyclinE及PCNA的过表达从而抑制血管平滑肌细胞增殖有关。     

雌激素对血管平滑肌细胞中c-fos和增殖细胞核抗原表达的影响

目的：研究并比较雌激素和／或血清对血管平滑肌细胞(VSMC)中c-fos和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法：分别在有或无他莫昔芬(TAM)(雌激素受体ER拮抗剂)预处理的情况下，采用免疫细胞化学和图像分析方法，研究雌二醇(E2)和/或新生小牛血清(NCS)对传代大鼠VSMC中的c-fos和PCNA蛋白表达的影响。结果：E2以及NCS均能上调细胞中c-fos和PCNA蛋白的表达，TAM能阻断其效应。结论：雌激素能促进传代VSMC增生，ER介导其作用。