兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。 目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。 设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10/12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。 材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。 方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8 h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5 d后首次换液，细胞融合率达90%时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。 主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48 h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14 d左右可达90%融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1~3 d为潜伏期，3 d后进入对数生长期，7~8 d为平台期，平均倍增时间为24.22 h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93.0%。 结论：采用密度梯度离心联合差速贴壁、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5 d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离培养及鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的分离和培养扩增至今缺乏统一的方法。内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但因获取骨髓单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异。 目的：拟在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,并对其进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-10/2009-02在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：清洁级健康雄性SD大鼠2只,由安徽省动物中心提供。 方法：抽取大鼠骨髓,通过密度梯度离心法提取单个核细胞,采用差速贴壁法分离骨髓间充质干细胞。原代骨髓间充质干细胞培养48 h后,收集未贴壁细胞,加入含胎牛血清、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、重组人上皮生长因子的EGM-2完全培养液诱导骨髓间充质干细胞向内皮祖细胞分化。设立3组：分别为早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞、2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞、大鼠成熟主动脉内皮细胞,采用硝酸还原酶法间接测量细胞培养液中一氧化氮的含量。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞体外培养情况,细胞培养液中一氧化氮的含量。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,24 h内大部分细胞贴壁,9~10 d可达90%融合,纯化扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭性,传代周期为8 d左右,流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞CD34,CD45呈阴性,CD105呈阳性。2次贴壁的内皮祖细胞培养3 d内贴壁,6 d形成集落,8~10 d出现条索状结构,呈微血管样生长,2周时大部分细胞呈多角形,细胞集落相互连接,呈典型的“铺路石”样,7~10 d细胞DiI-acLDL、FITC-UEA-1双染呈阳性,流式细胞仪检测Flk-1,CD133阳性。2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞培养液中一氧化氮含量明显高于早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞(P < 0.05),但低于大鼠成熟主动脉内皮细胞(P < 0.05)。 结论：差速贴壁法能有效地分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,加入多种细胞生长因子诱导后具有较强地向内皮细胞方向分化的能力,且2次贴壁细胞已具有部分内皮细胞的功能。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性*

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。 目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养条件

背景：间充质干细胞适合生长、培养的条件尚不十分明确,目前对于间充质干细胞的分离纯化以及体外培养亦没有统一的方法,而培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是进行以上实验的重要前提。 目的：寻求适宜有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 设计、时间及地点：分组对比观察,实验于2007-04/09在重庆医科大学附属第一医院实验中心完成。 材料：6~8周龄雄性Wistar大鼠1只,体质量120 g,用于间充质干细胞的分离及培养。 方法：采用全骨髓培养法获取间充质干细胞,按不同接种密度(1×106,5×105,1×105,5×104,1×104 cm-2)、血清体积分数(体积分数5%,10%,15%的胎牛血清)、首次换液时间(接种后6,12,24,48,72 h)及pH值(分别为7.0~7.1,7.1~7.2,7.2~7.3,7.3~7.4,7.4~7.5)分组接种,10 d后进行活细胞计数。 主要观察指标：不同培养条件对间充质干细胞生长的影响;倒置显微镜下观察原代及传代间充质干细胞的形态变化;采用四甲基偶氮唑盐法绘制细胞的生长曲线,并计算细胞倍增时间;常规SABC免疫组织化学法检测传代间充质干细胞CD44、CD34的表达;流式细胞仪检测传代间充质干细胞生长周期。 结果：①以1×106,5×105 cm-2密度接种的细胞数较多,余3种接种密度获得细胞数明显低于上述2种密度(P < 0.05)。首次换液时间为48 h获得的细胞数量最多,各组间相比,差异有显著性意义(P < 0.05)。体积分数5%血清组较体积分数10%、15%血清组细胞数量少(P < 0.05)。pH值为7.1~7.2,7.2~7.3的培养液细胞生长活跃,细胞数量多,以pH值为7.0~7.1和pH 7.4~7.5培养的细胞生长缓慢,数量较少。②刚接种的间充质干细胞呈圆形,培养6~8 h后开始贴壁,呈纺锤状或类圆形;约10 d左右细胞基本汇合长满瓶底;传代后,细胞形态以梭形为主;经过一二次传代后,细胞呈放射状或平行排列,形态趋于一致。③传代一二天细胞生长缓慢,生长停滞期;自3 d起,细胞生长进入对数生长期,四五天达到高峰;之后进入平台期,细胞倍增时间约为39.5 h。④传代间充质干细胞存在CD44抗原表达,而CD34呈阴性表达。⑤传代后82.93%的间充质干细胞处于G0/G1期,G2+M+S期细胞占17.07%。 结论：细胞较佳接种密度为5×105 cm-2,合适血清体积分数为10%,首次换液时间为48 h,pH值为7.2左右;在适宜的培养条件下,间充质干细胞在体外生长状态良好,增殖速度快。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。 目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。 设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10/2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。 材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1.073 kg/L的Percoll分离液。 方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞, 在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。 主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。 结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3~5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44,不表达CD34。 结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定

背景：相对于骨髓间充质干细胞来说,脐血间充质干细胞是一种较为理想的新的组织工程种子细胞来源,但其培养成功率较低。 目的：通过对培养基的选择、离心速度及时间、接种密度、生长因子的选择、首次换液时间等条件进行优化,拟建立一种稳定可靠的人脐血间充质干细胞的体外分离培养方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-01/10在白求恩国际和平医院输血科完成。 材料：健康足月剖宫产新生儿脐带血20份,由白求恩国际和平医院干细胞中心提供,产妇及其家属均知情同意。 方法：无菌条件下采集脐血,采用密度梯度离心法(1 500 r/ min 离心15 min)结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞,加入含体积分数为10%人脐带血血清、5 μg/L GM-CSF、15 μg/L白细胞介素3的DMEM/F12培养基,调整细胞密度为1×1010 L-1接种于人脐带血血清包被过的塑料培养瓶中,置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度环境下培养,3 d后首次换液,去除未贴壁细胞,以后每隔24 h换液1次。当培养瓶中的细胞生长到80%融合时,胰酶-EDTA混合液消化传 代。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞免疫表型。 结果：24 h后可见有少量细胞贴壁,48 h后贴壁细胞增多,并出现少量单极梭形细胞,7 d后可见细胞形成集落,培养两三周形成平行排列、辐射状或漩涡状细胞界限不清楚的成纤维样细胞,且80%~90%呈现融合。第2代细胞接种后12 h开始贴壁,10 d即可达80%~90%融合。流式细胞仪分析显示,此类细胞稳定地表达相关抗原标记CD29及CD44,但不表达造血细胞系表面标记CD34。 结论：实验在体外改良培养条件下成功分离出人脐血间充质干细胞,培养周期较短,细胞纯度较高,贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原。     

改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

背景：小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点,使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究。 目的：观察改良小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性。 设计、时间及地点：观察性实验,于2008-06/12在解放军军事医学科学院完成。 材料：C57BL/6小鼠4~6周龄,体质量20 g,雌雄不拘。 方法：通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞。参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%。用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块。然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×106/cm2浓度接种75 cm2培养瓶。对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM-DiI标记。 主要观察指标：原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度。 结果：①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48 h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形、多角形和扁平形。3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45。③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10 d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构。在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9 d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒。④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-DiI标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上。流式细胞仪检测CM-DiI细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞。 结论：改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM-DiI标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪。     

成人骨髓间充质干细胞的分离、鉴定和生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞具有自我复制的能力、多向分化和增殖的潜能，但骨髓中间充质干细胞的含量极少，因此体外纯化和扩增极其重要。 目的：拟建立体外分离培养、纯化骨髓间充质干细胞的方法，观察其增殖及生长特性。 设计、时间及地点：单一样本观察实验，于2006-05/2007-12在北京协和医院胸心外科实验室和桂林医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓血来源于成人肋骨骨髓。 方法：收集成人骨髓血，采用密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液提取成体人骨髓单个核细胞，根据骨髓间充质干细胞易于贴壁的特性除去未贴壁细胞获取骨髓间充质干细胞。取第2~3代细胞在-80 ℃条件下冻存，24 h后复苏，观察活细胞数，按2×103/cm2种植扩增，扩增时保持细胞密度为2×103/cm2~8×103/cm2。 主要观察指标：倒置显微镜和相差倒置显微镜观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞抗原表达，采用细胞计数方法绘制原代培养和传代培养细胞生长曲线。 结果：原代培养接种三四小时后细胞开始贴壁,24 h后贴壁细胞数量明显增多, 3 d后贴壁细胞为单个或几个细胞克隆，散在分布，大部分细胞呈纺锤形。7~9 d后集落迅速增多细胞融合,细胞数量约增加了10倍；10~12 d，细胞数量增加了约20倍，铺满了全层，细胞排列也有一定的方向性，呈旋涡样生长，旋涡中心细胞呈多层分布。骨髓间充质干细胞表达KDR、CD105，不表达CD34、CD45、CD11a、CD14、HLADR等。原代细胞培养曲线显示，第2~6天为生长潜伏期，第8~10天进入对数增长期，第12~14天进入个平台期；传代培养的潜伏期为24~48 h，对数增长期为4~6 d，细胞的增殖、生长逐渐缓慢，接种后8到9天进入平台期。 结论：利用密度梯度离心和贴壁的方法获取的骨髓间充质干细胞具有大量增殖的能力，表达CD105、KDR，不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。     

人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体外分离、培养、分化及

背景：间充质干细胞由于具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能,近年来已成为细胞领域的研究热点。 目的：对比观察脐带血与骨髓来源的间充质干细胞其体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性比较。 设计：体外细胞学对比观察。 材料：新鲜脐带血在征得产妇同意后采集。骨髓由健康的成年志愿者捐赠。 方法：取脐带血和成人骨髓分离、培养并纯化间充质干细胞,对获得的间充质干细胞进行形态学观察。 主要观察指标：两种来源间充质干细胞的形态和生长特性;流式细胞仪检测脐带血间充质干细胞表面抗原的表达情况;对脐带血间充质干细胞多向分化的能力进行鉴定。 结果：两种来源的单个核细胞经体外培养贴壁后均出现间充质样细胞,原代骨髓间充质干细胞的贴壁时间和培养时间均短于脐带血间充质干细胞,两种细胞传代生长呈共同特性：传代培养潜伏期为24~36 h,传代培养对数增殖期为接种后3～7 d,接种后八九天,生长进入平台期;脐带血来源的间充质干细胞表达相关抗原CD29、CD44、CD105;但不表达造血细胞抗原CD34、CD45;脐带血间充质干细胞可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞。 结论：人脐带血和骨髓来源间充质干细胞均可在体外分离培养、扩增;脐带血的间充质干细胞原代贴壁时间、形成细胞克隆的时间、集落交错融合的时间均较骨髓间充质干细胞晚,传代培养的细胞形态,生长速度均无明显差异;两种来源的间充质干细胞具有相同的表面标志物;脐带血间充质干细胞有多项分化潜能,可诱导为脂肪细胞、成骨细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。